醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序

1、醫(yī)院人感染h7n9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序 醫(yī)院人感染 9 h7n9 禽流感病毒核酸檢測 標準操作程序 一、目的 確保人感染 h7n9 禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規(guī)范化，降低人為不規(guī)范操作對檢測結果造成的影響，保證結果的準確性和可重復性。 二、適用范圍 醫(yī)療機構臨床基因擴增檢驗實驗室按照關于醫(yī)院開展人感染 h7n9 禽流感病毒核酸檢測有關工作的通知（衛(wèi)辦醫(yī)政函2021383 號）和關于做好醫(yī)療機構人感染 h7n9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知（衛(wèi)發(fā)明電202129 號）有關要求，使用國家疾病預防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染 h7n9 禽流感病毒核酸檢測工作。 三、樣本采集、

2、運送和保存 盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)?？蓪⒈?、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率?；颊哂邢潞粑罉颖緯r，應優(yōu)先采集。 根據(jù)試劑說明書對樣本采集方法有關要求，制訂樣本采集標準操作程序（sop），并組織樣本采集人員進行培訓及考核。樣本的采集應當嚴格按照 sop 進行。 樣本采集后，按照人間傳染病的病原微生物名錄中高致病性禽流感病毒的相關規(guī)定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應盡快進行檢測，24 小時內能檢測的樣本可置于 2

3、8暫時保存，24 小時內無法檢測的樣本則應置于-70狀態(tài)保存。如無-70保存條件時，可于-20冰箱暫存。樣本避免反復凍融。 樣本采集、處理、運輸及保存不當時，可因病毒 rna 降解出現(xiàn)假陰性結果，也可因為樣本"污染'出現(xiàn)假陽性結果。 四、pcr 檢測 （一）樣本處理 樣本的核酸提取應當在樣本處理區(qū)進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應盡可能新鮮，提取過程應嚴防 rna 酶污染及操作不當導致的 rna 降解。提取過程如涉及離心步驟，應采用低溫冷凍離心機；在生物安全柜內進行加樣、提取過程中，為防止 rna 降解，可將試管架置于托

4、盤內平鋪的碎冰上。提取好的 rna 應及時用于檢測，否則應當-70保存。如無-70保存條件，可于-20冰箱暫存。 （二）試劑準備 試劑準備應當在試劑準備區(qū)進行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感 h7 亞型或 h7n9 病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。 除酶混合物外，其它試劑在使用前應當在室溫充分復融，混勻并瞬時低速離心。反應液分裝時盡量避免產生氣泡，上機前注意檢查各反應管是否蓋緊，以免管內溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應液的反應管應當扣蓋或裝入密實袋內再轉移至樣本處理區(qū)。 （三）加樣 加樣應當在樣本處理區(qū)進行。加樣時應當使樣品完全落入反應液中，不應有

5、樣品粘附于管壁上，加樣后應盡快蓋緊管蓋。 按試劑、儀器說明書完成加樣和 pcr 反應管準備。 （四）r pcr 擴增檢測 pcr 擴增檢測在擴增區(qū)進行。待檢 pcr 管轉移至擴增區(qū)，按順序置于 pcr 儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設定循環(huán)參數(shù)。 （五）結果分析 根據(jù)所用試劑盒說明書設置基線值（baseline）。熒光閾值（threshold）設定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線（無規(guī)則的噪音線）的最高點為原則，且 ct 值應大于所設置的擴增循環(huán)數(shù)（或顯示為 undet）。使用儀器配套軟件自動分析結果。 （六）質量控制 檢測過程對可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性進行質量控制，除了檢測商品試劑

6、盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣 本檢測時，至少應當有 1 份弱陽性和 3 份陰性質控樣本（多份陰性質控樣本設置對實驗室"污染'所致假陽性的監(jiān)控更為有效），隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有"內標'控制假陰性，或弱陽性質控樣本來源困難，可暫不設弱陽性質控。陰性質控樣本采用標本采集管內溶液即可。質控樣本應與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。 試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。 （七）實驗結果的判定與解釋。 按照試

7、劑盒說明書進行。對于出現(xiàn)弱陽性結果的樣本應進行重復檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉"污染'所致假陽性結果區(qū)別。 五、檢測結果報告 按照試劑盒說明書進行。 六、其它注意事項 （一）人感染 h7n9 禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照人間傳染的病原微生物名錄中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術人員必須經過生物安全培訓并具備相應的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施（使用眼罩、n95 型口罩等）。樣本 核酸提取必須在級生物安全實驗室，經過年檢合格的二級生物安全柜內進行。實驗室應具有良好的通風。 （二）注意儀器設備的日常和定期維護，加樣器、

8、擴增儀和溫育設備應進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無dna 酶和 rna 酶 pcr 反應管、離心管、帶濾芯吸頭等應進行每批質檢。 （三）實驗應嚴格分區(qū)操作；各區(qū)物品、工作服等均應當專區(qū)專用，不得交叉使用。實驗后應及時清潔工作臺，以防污染。 （四）每批實驗室后，可采取實驗室通風、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產物氣溶膠污染。 （五）使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應試劑盒說明書（見附件 1、2）有關要求。 附件：1.h7n9 亞型禽流感病毒 rna 檢測試劑盒（熒光pcr 法）說明書 2.h7n9 禽流感病毒核酸檢測試劑盒（pcr-熒光探針法

9、）說明書 9 h7n9 亞型禽流感病毒 a rna 檢測試劑盒 （熒光 r pcr 法）說明書 【產品名稱】 通用名稱：h7n9 亞型禽流感病毒 rna 檢測試劑盒（熒光pcr 法） 英文名稱：diagnostic kit for h7n9 subtype avian flu virus rna（fluorescence pcr） 【 包裝規(guī)格】48 人份/盒。 【預期用途】 本試劑用于對咽拭子樣本中 h7n9 亞型禽流感病毒 rna進行定性檢測，用于 h7n9 禽流感病毒感染的輔助診斷及流行病學監(jiān)控。 【檢驗原理】根據(jù)熒光 pcr 技術原理，針對 h7n9 亞型禽流感病毒的 ha 基因和 n

10、a 基因設計特異性引物和 taqman探針，通過熒光 pcr 檢測儀進行檢測，從而實現(xiàn)對 h7n9 亞型禽流感病毒 rna 的定性檢測。試劑盒以正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶 p（rnase p）的 mrna 為正常人體細胞對照，對提取和檢測過程進行監(jiān)控。 【主要組成成分】 名稱 成分 規(guī)格 數(shù)量(管) h7 反應液 含內標 rnp 、h7 亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1 n9 反應液 含內標 rnp 、n9 亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1 dna 聚合酶 dna 聚合酶，不可用其他同類 dna 聚合酶替代 60l /管 1 逆轉錄酶 逆轉錄酶，不可用

11、其他同類逆轉錄酶替代 60l /管 1 陽性對照 rnp、h7、n9 rna 假病毒混合物 1.0ml/管 1 陰性對照 depc 水 1.0ml/管 1 本品各組成成分均不得與其他產品或不同批號產品中的相應組成成分進行互換。 本品不包含，但對試驗必須的設備和試劑： 生物安全柜、臺式離心機、旋渦震蕩器、拭子、采樣管、無菌病毒采樣液、1.5 ml 無核酸酶的離心管、全自動熒光pcr 檢測儀專用 pcr 擴增管和核酸分離試劑盒(硅膠膜吸附法，北京金豪制藥股份有限公司，cat：bjh101)。 【儲存條件及有效期】-20冷凍保存，有效期 2 個月，陽性對照反復凍融次數(shù)不得超過 5 次。 【適用儀器】

12、rg3000、lightcycler、abi prism 7500、abi prism 7000 型全自動熒光 pcr 檢測儀。 【樣本要求】 1. 樣本類型：咽拭子。推薦使用金豪公司生產的微生物采樣及運送管（12 人份/盒）。 2. 拭子、采樣管和保存液： 2.1 拭子選擇：應使用頭部為合成纖維（例如，聚酯纖維），桿部為鋁或塑料的拭子。 2.2 采樣管：外螺旋口、耐-70凍存，可容納 3 ml 病毒采樣液。 2.3 無菌病毒采樣液：應含有蛋白質穩(wěn)定劑，阻止細菌和真菌生產的抗生素，緩沖液，經無菌處理。 3. 樣本采集、運輸和保存： 由于 h7n9 亞型禽流感病毒為呼吸道傳播病毒，有關生物安全應

13、按照"人間傳染的病原微生物名錄'中高致病性禽流感病毒進行管理。 3.1 采集：采集病人發(fā)病 3 日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用微生物采樣及運送管內的采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有 3ml 保存液的 15ml 外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4暫存并在 48 小時內送達實驗室。 3.2 保存和運輸：新鮮采集樣本應在 4條件下 48 小時運送到檢測實驗室。保存樣本可在-20以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70冰箱。冷凍樣本應在冷凍條件下送至實驗室。運輸

14、時在包裝箱內填充吸水材料，運輸過程中保持標本采集管直立狀態(tài)，不能傾斜。 樣本送至實驗室后，立即進行處理和分裝，避免反復凍融。臨床樣本保存在 4不能超過 4 天。 4. 咽拭子標本的處理 咽拭子要在標本保存液中充分攪動（至少 40 下），以洗脫拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在 4條件下，10000rpm 離心 20 分鐘，用上 清接種細胞或直接提取 rna。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。 【檢驗方法】 1. 核酸提?。?取 200l 咽拭子樣本進行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅

15、膠膜吸附法)，該試劑盒可用于對呼吸道懸浮液樣本中的病毒 rna 提取，并按試劑盒說明書要求操作。 本品的陽性對照和陰性對照均參與核酸提取。 1.1. 準備及注意事項： 1.1.1 分別在洗液 a 瓶和洗液 b 瓶中加入 16ml 和 60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，并在瓶身上加以標識。 1.1.2 吸 取 所 需 的 洗 脫 液 ， 加 至 一 無 核 酸 酶 的eppendorf 管中，于 70預熱。 1.1.3 冷凍樣本應室溫融化，輕微震蕩混勻后使用。 1.1.4 區(qū)分操作中的離心設置（rpm 和 g），本產品操作過程均為室溫離心。 1.1.5 助沉劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使

16、用。 1.2. 樣本裂解及核酸吸附 1.2.1 在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10l助沉劑和 400l 裂解液，加入 200l 待處理樣本，劇烈震蕩 2 分鐘，室溫靜置 10 分鐘。 注：如樣本體積小于或大于 200l，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積。體積大于 400l 樣本應分多次進行處理。 1.2.2 加入 480l 無水乙醇，顛倒混勻，吸取 600l裂解混合物轉移到核酸吸附柱中。 注：如樣本體積小于或大于 200l，需按比例改變乙醇用量。 1.2.3 3500g 離心 2 分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體。將剩余裂解混合物轉移至核酸吸附柱，重新離心一次，棄套管中的液體。

17、1.2.4 將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g 離心 1 分鐘，倒掉套管中的液體。 1.3. 核酸純化 1.3.1 將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入 500l 洗液 a，6000g 離心 1 分鐘，將核酸吸附柱裝入一個干凈套管中。 1.3.2 在核酸吸附柱中加入 500l 洗液 b，靜置 1 分鐘，6000g 離心 1 分鐘。 1.3.3 倒掉套管中的液體，將核酸吸附柱重新裝入套管。 1.3.4 重復一次 1.3.2 步驟(本步驟不用靜置 1 分鐘)。 1.3.5 將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm 離心 3 分鐘。 1.4. 核酸洗脫 1.4.1 將核酸吸附柱裝入一無核酸

18、酶 1.5ml 離心管，小心在吸附膜.加入 50l 預熱洗脫液，室溫靜置 4 分鐘。 1.4.2 10000 rpm 離心 2 分鐘，離心管中液體即待測樣本 rna。 r 2. pcr 擴增： 2.1 實驗設計： 2.1.1 待檢樣本檢測：每份樣本分別使用 2 種反應液（h7和 n9 反應液）進行檢測，綜合 2 種反應液的檢測結果對樣本進行判定。 2.1.2 對照品檢測：每次試驗都應設置陰性對照和陽性對照。 2 2.2 反應體系的配制： 2.2.1 準備工作：將 2 種反應液（h7 和 n9 反應液）融化后振蕩混勻，離心 6000rpm 10 秒。 2.2.2 2 種反應體系（h7 和 n9）的配制：取 2 個 1.5ml 無核酸酶離心管，計算待測樣本數(shù)量(n)，分別取 20l （n+2）反應液（h7 和 n9）、0.5l（n+2）dna 聚合酶和0.5l（n+2）逆轉錄酶