實(shí)時(shí)定量PCR課件

1、1實(shí)時(shí)定量PCRQuantitative Real-Time PCR梁沛中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲學(xué)系2主要內(nèi)容n基本原理n幾個(gè)概念n絕對定量n相對定量n常見問題3一、基本原理41993年，日本Higuchi 等人首次采用動(dòng)態(tài)PCR的方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。熒光染料：EB（溴乙錠）PCR儀：改良的熱循環(huán)儀激發(fā)光：UV射線檢測器：CCD相機(jī)缺點(diǎn)：儀器耗費(fèi)巨大；非特異產(chǎn)物導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確5n1995年美國PE公司成功開發(fā)TaqMan技術(shù)n1996年推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等6n實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)

2、（real-time quantitative PCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入，實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR過程中熒光信號的累積強(qiáng)度，并利用特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。nRT-PCR：Reverse-transcription PCRnqRT-PCR: quantitative Real-time PCR789檢測通道n2004年推出的7300和7500均為第三代產(chǎn)品，2001推出的7900為第二代產(chǎn)品。n7300：4通道n7500：5通道n均需加Rox染料進(jìn)行校正1011兩種熒光標(biāo)記法1. 染料染色-SYBR Green I-EB2. 探針標(biāo)記-Taqman-Taqman MGB-分

3、子信標(biāo)12SYBR Green I 的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm1. 熒光染料法熒光染料法13化學(xué)原理14染料法的優(yōu)缺點(diǎn)：n實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單，僅需要設(shè)計(jì)一對上下游引物，不需要設(shè)計(jì)探針，通用性好；n成本低；n可通過分析檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。n低通量實(shí)驗(yàn)一般優(yōu)先考慮使用SYBR Green I染料法。 15染料法的優(yōu)缺點(diǎn)nSYBR Green I方法對PCR擴(kuò)增特異性要求較高SYBR Green I 可與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性nSYBR Green I 不能區(qū)分不同擴(kuò)增片段發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它

4、不能用于多重反應(yīng) 162. 熒光探針法(Taqman)17Taqman ProbeQuencherReporter18Tagman probe 的工作原理19探針與PCR產(chǎn)物的數(shù)量關(guān)系n每產(chǎn)生一個(gè)新的DNA片段，就切斷一條探針n每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個(gè)單位的熒光信號n信號強(qiáng)度與DNA的copy數(shù)成正比20探針法的優(yōu)缺點(diǎn)nTagman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標(biāo)序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準(zhǔn)確性n可用于多重反應(yīng)，即可同時(shí)檢測多個(gè)目的基因。n但探針設(shè)計(jì)成本較高，有時(shí)探針設(shè)計(jì)困難。 21二、幾個(gè)概念221.擴(kuò)增曲線n描述PCR動(dòng)態(tài)進(jìn)程的曲線稱為擴(kuò)

5、增曲線。nPCR的擴(kuò)增曲線實(shí)際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線CyclesFluoresces231.擴(kuò)增曲線n擴(kuò)增曲線分三個(gè)階段：擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可選擇該階段進(jìn)行定量分析。 擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始DNA拷貝數(shù)。242.熒光閾值n一般把熒光PCR的前15個(gè)循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline，基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。n是人為設(shè)定的一個(gè)

6、值，可設(shè)在指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上。n缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（自動(dòng)）。2.熒光閾值25262.熒光閾值n手動(dòng)設(shè)置，原則：大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是超過域值的熒光信號。273. Ct值nCycle threshold，就是當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù)。線性圖譜半對數(shù)圖譜28Ct值的重現(xiàn)性293. Ct值nCt值與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，達(dá)到閾值所需的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。n正常的Ct值范圍在18-30之間，過大和過小都將影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精度。 3

7、031Ct值定量的數(shù)學(xué)原理32Ct值定量的數(shù)學(xué)原理33Ct值定量的數(shù)學(xué)原理34Ct值定量的數(shù)學(xué)原理0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold10410310235靶標(biāo)基因的定量36靶標(biāo)基因的定量50001000012需要制備標(biāo)準(zhǔn)品需制作絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線無需標(biāo)準(zhǔn)品，需制作相對標(biāo)準(zhǔn)曲線37靶標(biāo)基因的定量CYP6B6Actin38三、絕對定量39三、絕對定量40三、絕對定量41三、絕對定量1.化學(xué)合成目的基因，是純度高、定量準(zhǔn)確是受化學(xué)合成工藝限制，只能合成120bp以下的長度；2.回收純化PCR產(chǎn)物后

8、克隆到載體上，然后抽提質(zhì)粒，經(jīng)過測量濃度和拷貝數(shù)的換算，可準(zhǔn)確定量是穩(wěn)定、準(zhǔn)確。42三、絕對定量43三、絕對定量(以dsDNA為例） dalton/bp44三、絕對定量n3000 堿基質(zhì)粒，濃度100 ng/ul nMW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106 daltons。ncopy數(shù) - 3x 1010 copies/ul100ng1.98 x 10645絕對定量舉例Copies/ul Ct 1Ct 2Meant CtSTD510328.1828.6428.410.16510425.2525.1425.190.04510522.1122.4622.280

9、.12510618.6318.9218.770.10Blank46絕對定量舉例擴(kuò)增效率（擴(kuò)增效率（E）計(jì)算）計(jì)算E=10-1/斜率斜率 =10-1/-3.18 =2.06E%=(2.06-1) 100%=106%47絕對定量舉例n如未知樣本Ct為20.5，將Ct值帶入線性方程：n20.5= -3.183 X + 40.211nX=（20.5-40.211）/-3.183 =6.19n未知樣本拷貝數(shù)=106.19=1548816 copies/ul48四、相對定量n無需知道目的基因的絕對拷貝數(shù) 1. 模板均一性問題模板均一性問題：起始的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞的狀態(tài)、均一性等 2. RNA制備制備：RNA純

10、化得率、均一性等 3. 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄：反轉(zhuǎn)錄的效率等49內(nèi)標(biāo)/內(nèi)參照n因因RNA純化后得率不同、純化后得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度可能不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度可能不同。因此，在進(jìn)行基因表達(dá)研究中都會用看家基因不同。因此，在進(jìn)行基因表達(dá)研究中都會用看家基因（house-keeping gene）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以校）對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。正因樣品初始濃度不同而造成的差異。n常用的看家基因有：常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18S rRNA等等50相對定量的方

11、法n雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法nCt法法51雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：分析簡單，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化簡單。n缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：對每一個(gè)基因每一個(gè)基因，每一輪實(shí)驗(yàn)每一輪實(shí)驗(yàn)都必需做標(biāo)準(zhǔn)曲線；必需有固定的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線；這些標(biāo)準(zhǔn)品并不代表樣品擴(kuò)增的真實(shí)狀態(tài)比如標(biāo)準(zhǔn)品為質(zhì)?；蚣兓腜CR產(chǎn)物，而待測樣品為cDNA，那么標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率并不能真實(shí)地反映樣品的擴(kuò)增情況。n應(yīng)用應(yīng)用：基因表達(dá)調(diào)控研究中最常用與公認(rèn)的兩種相對定量方法之一。處理組處理組目的目的基因表達(dá)量基因表達(dá)量處理組處理組參照參照基因表達(dá)量基因表達(dá)量對照組對照組目的目的基因表達(dá)量基因表達(dá)量對照組對照組參照參照基因表達(dá)量基因表達(dá)量相對表達(dá)量相對表達(dá)量52Ct

12、法法nCt，即，即Ct的變化值的變化值n假定目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率相同，均為假定目的基因和參照基因的擴(kuò)增效率相同，均為100%2-(Ct1- Ct2) 2-Ct53Ct法法舉例舉例Cyp6B6 ave Ct18S RNA ave Ct標(biāo)準(zhǔn)化的Cyp6B6 Ct校正Ct處理組處理組22.812.310.5-1.4對照組對照組24.512.611.902-Ct = 54Ct法法n優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)化的體系建立后，每次實(shí)驗(yàn)中無需再對看家基因和目的基因做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對待測樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。n要求：要求：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率差值70%高效、全長的高效、全長的cDNA61建立反應(yīng)體系n做普通PCR

13、、跑核酸電泳的槍嚴(yán)禁用于定量PCR！n加buffer、引物和水在獨(dú)立房間n加模板在另一房間n加模板和其它反應(yīng)物的移液槍要嚴(yán)格區(qū)分，不能混用！n增大模板的加樣量，以減少孔間誤差。n使用mix以減少系統(tǒng)誤差；每個(gè)樣品至少3個(gè)重復(fù)62樣品設(shè)置6364656667引物設(shè)計(jì)及評價(jià)引物設(shè)計(jì)的基本原則： 1) 避免重復(fù)堿基，尤其是G. 2) 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上3）GC=30-80%. 4) 3端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C. 5) 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 6) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度： 不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）.68引物設(shè)計(jì)及評價(jià)n做溶解曲線Dissociation curve69引物設(shè)計(jì)及評價(jià)70SYBR法常見問題及注意事項(xiàng)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物特異性擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物引物二聚體引物二聚體71探針設(shè)計(jì)原則1.探針位置盡可能地靠近上游引物，擴(kuò)增片段長度在50150bp范圍內(nèi)； 2.探針長度通常在2030bp，Tm值在6570，通常比引