Hepa1-6原位肝癌小鼠模型的構(gòu)建及其IDO1活性和表達的研究

1、    hepa1-6原位肝癌小鼠模型的構(gòu)建及其ido1活性和表達的研究    郭磊磊楊青【摘 要】目的：建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型，并研究該模型中吲哚胺2，3-雙加氧酶1 （indoleamine 2，3-dioxygenase 1， ido1）的活性和表達，為研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制劑的藥效奠定基礎。方法：培養(yǎng)收集hepa1-6小鼠肝癌細胞并調(diào)整濃度至2×106/50 l，將其注射于小鼠肝左葉中，術(shù)后14天處死小鼠，收集血清，解剖并觀察小鼠肝臟腫瘤的形成情況，對腫瘤組織進行he染色，qpcr法和western blo

2、t法分別檢測腫瘤中ido1 mrna和蛋白的表達水平，hplc法檢測血清中色氨酸和犬尿氨酸的含量。結(jié)果：小鼠肝上形成腫瘤且呈彌漫性生長并發(fā)生肝葉間的轉(zhuǎn)移;肝癌小鼠血清中ido1活性、腫瘤中ido1 mrna和蛋白水平的表達比野生型小鼠的均高。結(jié)論：成功建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型，該模型可用于ido1功能及ido1抑制劑藥效學研究?！娟P(guān)鍵詞】原位肝癌;吲哚胺2，3-雙加氧酶1（ido1）;ido1抑制劑r730.3a1672-3783（2020）06-18-01肝癌是世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤，預后差，現(xiàn)有的治療效果不盡人意。免疫療法是肝癌治療的新希望，免疫檢查點阻斷療法在肝癌中已有應用1。吲

3、哚胺2，3雙加氧酶1（indoleamine-2，3-dioxygenase 1，ido1）是犬尿氨酸代謝通路中的關(guān)鍵限速酶，催化人體必需氨基酸色氨酸（tryptophan，trp）分解代謝生成l-犬尿氨酸（kynurenine，kyn）。它在多種腫瘤里高表達，使腫瘤組織中cd8+ t細胞功能和增殖減弱，foxp3+ treg細胞增殖，促進腫瘤細胞生存及腫瘤免疫逃逸等2。ido1被認為是潛在的免疫檢查點，ido1抑制劑是腫瘤免疫治療的新型候選藥物3。目前尚無ido1抑制劑藥物上市，但多個ido1抑制劑如indoximod、epacadostat、bms986205等已經(jīng)進入臨床試驗，其中包括b

4、ms986205與pd-1抗體聯(lián)合治療肝癌的一項i期/ii期臨床實驗（nct03695250）4。本研究在建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型的基礎上，研究了該模型血清中ido1活性和肝腫瘤中ido1 mrna與蛋白水平的表達，為研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制劑的藥效學奠定基礎。1 實驗材料與方法1.1 主要實驗材料c57bl/6小鼠（上海杰思捷實驗動物有限公司）、hepa1-6小鼠肝癌細胞（）、he染色試劑盒（華安生物）、逆轉(zhuǎn)錄及qpcr試劑盒（諾唯贊）、ido1抗體（華安生物）等。1.2 試驗方法培養(yǎng)收集hepa1-6細胞并用pbs調(diào)整濃度至2×106/50 l。脫毛膏褪

5、去小鼠胸腔和腹部的毛并腹腔注射160 l 5%水合氯醛使小鼠麻醉;沿小鼠劍突剪開1cm的開口，使肝左葉暴露并注入50 l細胞懸液（含2×106個細胞），棉球按壓止血30 s，器官歸位并縫合創(chuàng)口。術(shù)后1-3 h小鼠蘇醒，正常飼養(yǎng)。術(shù)后14天，小鼠引頸處死，收集血清，解剖并觀察肝腫瘤發(fā)生和發(fā)展情況，收集小鼠肝腫瘤組織。hplc檢測血清中kyn和trp含量，腫瘤組織進行he染色，提取腫瘤組織總rna和蛋白，用qpcr法和western blot法檢測ido1 mrna和蛋白表達。具體實驗步驟參照文獻18。1.3 統(tǒng)計學分析采用grapsd prism 5.0進行數(shù)據(jù)處理和圖像繪制，所有實驗

6、數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤（±se）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用獨立樣本t檢驗，以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 造模情況術(shù)后14天小鼠腹部傷口全部愈合，手術(shù)縫合線全部自動脫落。人道主義處死小鼠，解剖并取出肝臟組織，進行觀察，如圖1所示，棕色部分為肝組織，白色部分為腫瘤組織，腫瘤在肝上大面積彌散性生長，并且已經(jīng)發(fā)生肝葉間的腫瘤轉(zhuǎn)移，小鼠接瘤14天后存活率和成瘤率均為100%。2.2 組織病理檢查肝腫瘤組織he染色結(jié)果如圖2所示，深紫色部分為腫瘤區(qū)（黃色圈區(qū)域），其細胞排列無規(guī)則，細胞核大，染色較深;淺紫色偏紅區(qū)域為正常肝區(qū)，細胞排列整齊，細胞核染色較淺。此外

7、有小片獨立的腫瘤區(qū)出現(xiàn)（黑色箭頭指處），表明肝癌細胞已在肝內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，印證了上述解剖觀察結(jié)果。2.3 肝腫瘤組織中ido1 mrna和蛋白表達水平的檢測qpcr法檢測肝腫瘤組織中ido1 mrna的表達，western blot法檢測ido1蛋白的表達，以野生型（wt）小鼠正常肝組織為對照，結(jié)果如圖3所示hepa1-6原位肝癌小鼠肝腫瘤組織中表達的ido1 mrna和蛋白均比wt小鼠的高。2.4 小鼠血清中ido1活性的檢測hplc法檢測野生型小鼠（wt）和hepa1-6原位肝癌小鼠血清中trp和kyn的濃度，以（trp/kyn）*100的比值來定量表示小鼠血清中的ido1活性。結(jié)果如圖4所示

8、，hepa1-6原位肝癌小鼠血清中kyn濃度水平較wt小鼠的高，trp濃度水平與wt的基本一致，（kyn/trp）*100的值變化與kyn濃度水平變化一致，即hepa1-6原位肝癌小鼠血清中的ido1活性高于wt小鼠血清中的。3 討論hepa1-6原位肝癌小鼠血清中ido1活性是野生型小鼠的2.5倍，本底ido1活性較高，能較好的反映在給予ido1抑制劑后小鼠血清中ido1活性的變化情況。同時，hepa1-6原位肝癌小鼠血清中ido1活性和腫瘤中ido1的表達均高，是研究ido1與肝癌關(guān)系的良好工具。總之，本研究在建立hepa1-6原位肝癌小鼠模型的同時，研究了該模型血清中ido1活性和肝腫瘤中ido1 mrna和蛋白水平ido1的表達，發(fā)現(xiàn)肝癌小鼠血清中ido1活性、肝腫瘤中ido1 mrna和蛋白水平的表達均較野生型小鼠中的高，為研究ido1在肝癌中的作用及ido1抑制劑的藥效學奠定基礎。參考文獻】周晨，劉家成，石欽，等. 肝癌分子靶向藥物及免疫抑制劑治療的研究現(xiàn)狀及進展j. 中華介入放射學電子雜志，2019，7（3）：243-250.毛耀南，于萍，任敬慧，等. ido小分子抑制劑的研究進展j.實用藥物與臨床，