鰻魚中磺胺類藥物殘留的Charm Ⅱ放射免疫法檢測

1、鰻魚中磺胺類藥物殘留的Charm 放射免疫法檢測福建水產(chǎn),2006年8月第3期JOURNALOFFUJIANFISHERIES鰻魚中磺胺類藥物殘留的CharmII放射免疫法檢測陳健,林杰,黃曉蓉,鄭晶,湯敏英,陳彬(福建出入境檢驗檢疫局,福建福州350001)摘要:本文探討應(yīng)用Charm控制點設(shè)定的方法,評價了免疫反應(yīng)體系的靈敏度和特異性,驗證了磺胺類最大殘留限量50pc/ks的檢測穩(wěn)定性,90分鐘可出檢測結(jié)果.關(guān)鍵詞:磺胺類;鰻魚;CharmII放射免疫分析方法磺胺類藥物(Sulfonamides,SAs)是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱,其通過干擾細(xì)菌的酶系統(tǒng)對氨基苯甲酸的利用而

2、發(fā)揮抑菌作用,后者是微生物生長必需物質(zhì)葉酸的組成基本結(jié)構(gòu)后,相繼合成了各種SAs,由于其抗菌譜廣,價格低廉,目前仍是獸醫(yī)Il缶床和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中最常用的藥物添加劑之一,但也帶來了食品安全和環(huán)境污染等系列問題.研究表明與其它常用抗生素相比,SAs可能更易誘導(dǎo)菌株應(yīng)選擇壓力而產(chǎn)生耐藥性.此外,SAs藥物還會導(dǎo)致過敏反應(yīng),尿和造血功能紊亂動物如鼠的甲狀腺增生,對其激素樣效應(yīng)和潛在用和代謝的時間較長,通過任何途徑攝人的磺胺都有可能在人體中蓄積,蓄積濃度超過一定值時將對人體機能造成損害.因此,聯(lián)合國食品法典委員會(CAC)和許多國家規(guī)定,食品和飼料中SAs總量以及磺胺二甲基嘧啶等單個SAs的量學(xué)的發(fā)展和風(fēng)

3、險分析手段的進步,各國對SAs在動物源性食品中的殘留限量做出了越來越嚴(yán)格的規(guī)定,如日本對食用動物肌肉中磺胺二甲基嘧啶的最大殘留限量規(guī)定為方法檢測低限,即關(guān)于SAs殘留的檢測從早期的分光光度法,熒光法,薄層色譜法到近些年的液相色譜法,氣相色譜一質(zhì)譜法,液相色譜一質(zhì)譜法,毛細(xì)管電泳法和超臨界流體色譜法,幾乎所有的分析理論和技術(shù)在SAs殘留分析中都得到了研究和應(yīng)用,其中采用最多的篩選方法是反相高效液相色譜法(HPLC),后來發(fā)展的酶聯(lián)免疫吸附測試方法(ELISA)作為篩選方法也得到了廣泛的應(yīng)用.但是這些檢測方法都存在處理方法繁瑣,操作時菌受體分析的CharmII放射免疫法的樣品前處理提取方法簡便,具

4、有靈敏度高,特異性強的特點,并且可以檢測磺胺類殘留總量,已經(jīng)為歐盟國家和美國FDA認(rèn)可并且應(yīng)用于初篩分析,目前國內(nèi)中磺胺類殘留Chann放射免疫檢測方法.1材料和方法Charm6600/7600分析儀:美國Charm公司生產(chǎn);IEC離心;均質(zhì)器;渦旋混合器;恒溫孵育器(65±1;80±2C);閃爍液加液器;50mL離心管;硼硅玻璃試管及試管塞;pH試條;藥片壓桿.1.2.2檢測試劑磺胺類CharmII檢測試劑盒;閃爍液(Optifluor);陰性對照液;多抗標(biāo)準(zhǔn)品.以上試劑均由美國Charm公司提供.第3期陳健等:鰻魚中磺胺類藥物殘留的CharmH放射免疫法檢測9($M1)

5、,磺胺二甲基嘧啶(SM2),磺胺間甲氧嘧啶(SMM),磺胺間二甲氧嘧啶(SDM),磺胺喹嗯啉(SQX),磺胺甲噻二唑(STZ),磺胺吡啶(SPD),磺胺異嘌唑(SIZ),磺胺甲基異嗯唑(SMZ),磺胺嘧啶(SD),磺胺噻唑(sT),磺胺甲氧噠嗪(SMP),磺胺氯噠嗪(SCP).以上標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供.1.2.4恩諾沙星,新霉素,慶大霉素,鏈霉素,螺旋霉素,林可霉素,四環(huán)霉素,氯霉素,紅霉素,青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品.以上標(biāo)準(zhǔn)品由Sigma公司提供.'H標(biāo)記的磺胺二甲嘧啶(示蹤劑)與樣品中磺胺類藥物的競爭結(jié)合試劑(微生物細(xì)胞上的特異性受體)上的磺胺結(jié)合位點,當(dāng)樣品中殘留磺胺類藥物時,殘留物

6、與受體上的結(jié)合位點結(jié)合,從而阻止了H標(biāo)記的磺胺類藥物與結(jié)競爭的結(jié)合位點越多,H標(biāo)記磺胺二甲嘧啶的則越少,用Charm11分析儀測定樣品中的H含量的cpm(每分鐘脈沖數(shù))值,cpm值越低則樣品中的磺胺類藥物殘留量越高.(1)取50mL離心管,加入10g均質(zhì)好的鰻魚糜樣.(2)加入30mLMSU提取緩沖液,強力振蕩離心管10min后進入步驟(3).(3)將離心管置80±2%1孵育器內(nèi)孵育45rain.(4)再將離心管置冰水內(nèi)10rain.×1000rpm)離心10rain.浮的脂肪顆粒混入上清液內(nèi).(1)用藥片壓桿的平端,將白色藥片(受體試劑片)壓人一潔凈的玻璃試管內(nèi).(2)加

7、300蒸餾水到試管內(nèi)用渦旋混合器振蕩10s至藥片破碎.(3)用加樣器加4mL樣品到試管內(nèi).(每一樣品用一新加液吸嘴).(4)用筆的平端,壓人粉紅色藥片(H標(biāo)記的磺胺二甲嘧啶).用振蕩器振蕩大約15s.(5)置65±l孵育器內(nèi),孵育3min.×1000rpm)離心3min.(7)離心停止后立即取出試管,倒掉上層液,用棉簽清除試管內(nèi)的脂肪環(huán)并吸干管壁內(nèi)的殘漬,不要接觸沉淀物.(8)加300蒸餾水到試管內(nèi),振蕩使沉淀物完全破碎.(9)加3mL閃爍液到試管內(nèi)渦旋混勻至試管內(nèi)沒有不均一的云絮狀物.(10)試管放人CharmlI/'/600分析儀內(nèi).(11)按CharmlI/&

8、#39;/600分析儀操作程序選項(檢測控制點需預(yù)先設(shè)定并輸入儀器),讀H項的epm值.樣品的cpm<控制點時,需要重新檢測樣品及同時測定一個陰性質(zhì)控和一個陽性質(zhì)控,以確定試劑和設(shè)備是否工作正常.通常情況下:(1)測試的陰性質(zhì)控應(yīng)該是陰性質(zhì)控平均值±20%(每一試劑盒都會給出陰性質(zhì)控平均值,平均值一般為運行三份陰性質(zhì)控液的cpm值的平均數(shù)).(2)測試的陽性質(zhì)控應(yīng)該小于控制點.如果重測樣品的cpm<控制點且(1)(2)兩條件符合,則判定樣品陽性.在6份已知無磺胺類殘留的鰻魚樣品中加入測試所要求的抗生素濃度(參照試劑盒說明書).按照分析程序運行(見1.3.3

9、方法).得出6個cpm值,計算其平均值.平均值的130%即為此類樣品的控制點.2結(jié)果與分析將濃度為1000L的多抗標(biāo)準(zhǔn)品添加入陰性鰻魚樣品中,添加濃度分別為lO,20,3O,10福建水產(chǎn)總第110期定步驟檢測其cpm值,結(jié)果如圖1和圖2.3OOOr添加濃度(,L)圖1鰻魚中添加磺胺二甲嘧啶的競爭性RIA曲線任何受體分析的靈敏度都存在限制,Charm放射免疫分析中細(xì)菌受體和.H的磺胺二甲嘧啶抗原的量是固定的.從圖1可以看出,當(dāng)樣品中競爭性磺胺二甲嘧啶濃度達到501g/kg時,濃度繼續(xù)增加則其競爭效率下降,表現(xiàn)為斜濃度達到200pg/kg時,分析體系已接近飽和.在磺胺二甲嘧啶添加濃度為1O501g

10、/kg的范圍內(nèi),以質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標(biāo),以相應(yīng)質(zhì)量濃度的cpm數(shù)值的相對值(即其cpm讀數(shù)與陰性樣品cpm讀數(shù)的比值,B/Bo)為縱坐標(biāo),得體作為抗原的結(jié)合位點,其親和性不均一,而且抗原抗體反應(yīng)的復(fù)雜性使得不能得到相關(guān)系數(shù)很高的線形擬合,但是從圖2可以看出在添加濃度為1O50lag/ks的范圍內(nèi),分析體系是比較靈敏的.根據(jù)實際情況確定檢測限時,考慮到分析相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,一般要求空白加標(biāo)樣品與空白樣品的cpm相對值小于0.6,即鰻魚中磺胺二甲嘧啶檢測濃度須大于l1.291g/kg.本實驗室選取陰性鰻魚樣品,分別加人13種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品分別為磺胺甲基嘧啶(SM1),磺胺二甲基嘧啶(SM2),磺胺間

11、甲氧嘧啶(SMM),磺胺間二甲氧嘧啶(SDM),磺胺喹嗯000驀00Ip(twgKs)圖2鰻魚中添加磺胺二甲嘧啶趨勢線啉(SQX),磺胺甲噻二唑(STZ),磺胺吡啶(SPD),磺胺異嗯唑(SIZ),磺胺甲基異嗯唑(SMZ),磺胺嘧啶(SD),磺胺噻唑(ST),磺胺甲氧噠嗪(SMP),磺胺氯噠嗪(sce),添加水平為501g/kg,測定加標(biāo)后cpm值,與控制點cpm值1357相比較,結(jié)果添加13種磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品的樣品測定結(jié)果陽性率為100%.另外添加恩諾沙星,新霉素,慶大霉素,鏈霉素,螺旋霉素,林可霉素,四環(huán)素,氯霉素,紅霉素,青霉素G的混合標(biāo)準(zhǔn)品,添加水平為10001a#,/kg,樣品測免疫分析

12、法測定鰻魚中磺胺類殘留的特異性能滿足檢測要求.現(xiàn)在日本等一些國家把磺胺類最大殘留限量從1001g/kg降為501g/kg,我們對放射免疫法在此水平的檢測靈敏度做了加標(biāo)驗證.磺胺類檢測限為500o/ks的控制點cpm值是1357.選取陰性樣品,添加13種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品,添加水平分別為401g/kg,501g/kg和801g/kg,測定出的cpm值與控制點cpm值1357進行比較.如樣品的cpm值大于1357,則結(jié)果為陰性;如樣品的cpm值小于1357,則結(jié)果為陽性.實驗結(jié)果如表1.表1鰻魚中磺胺類加標(biāo)驗證第3期陳健等:鰻魚中磺胺類藥物殘留的ch刪放射免疫法檢測ll我們應(yīng)用本方法對6OO余份鰻魚

13、樣品進行了磺胺類的初篩分析,篩選水平為50tLg/kg,對其中篩選陽性的4份鰻魚進行HPLC/UV的分析,均未檢出磺胺類殘留,可見初篩有假陽性可能.原因可能是鰻魚生長的環(huán)境復(fù)雜如:水源,土池的土壤,飼料,用來殺菌的中藥等干擾物質(zhì)造成的影響.另取十份初篩陰性的樣品,經(jīng)HPLC/uV確認(rèn)均為陰性,假陰性率為0%.3結(jié)論應(yīng)用CharmII放射免疫分析方法測定鰻魚樣品的磺胺類藥物殘留,該檢測方法可靠,靈敏度高,特異性強,快速簡便,達到了日本,歐美等國磺胺類最大殘留限量的檢測要求,能夠進行大批量樣品的初篩.但是,該檢測方法檢測結(jié)果有假陽性的可能,因此,初篩陽性的樣品必須用其殖,加工基地,年產(chǎn)量近七萬多噸

14、,占世界鰻魚產(chǎn)量的三分之一.作為福建經(jīng)濟的支柱產(chǎn)業(yè),鰻沙星,孔雀石綠殘留等事件造成的損失還歷歷在捷可靠的檢測手段,是目前福建大批量出口鰻魚中磺胺類藥物殘留的初篩方法,值得進一步研究應(yīng)用.參考文獻1美國Charm公司生產(chǎn)的CharmII/7600操作說明.2美國Charm公司生產(chǎn)的磺胺類藥物CharmII定性測定試劑盒的說明書方法.食品中藥物殘留分析方法M.福建省進口食品412.56.烤鰻中氯霉素殘留J.水產(chǎn)養(yǎng)殖,2003,24(4)四環(huán)素族藥物殘留J.福建水產(chǎn),2005(3)RapidDetectionofSulfonumidesinEelbyRadioimmunoassayMethodChenJhm,