第十章發(fā)酵工程各論-氨基酸發(fā)酵工藝

1、第十章第十章 氨基酸發(fā)酵工藝氨基酸發(fā)酵工藝10.1 概述10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝10.1 概述氨基酸的應(yīng)用 1、食品工業(yè)：營養(yǎng)強化劑；鮮味劑；甜味劑。 2、飼料工業(yè)：營養(yǎng)強化劑。 3、醫(yī)藥工業(yè)：氨基酸輸液；氨基酸衍生物；氨基酸鹽。 4、化學工業(yè)：洗滌劑；護膚品；人造革。 5、農(nóng)業(yè)：無公害農(nóng)藥。10.1 概述氨基酸的應(yīng)用食品工業(yè)：食品工業(yè)： 強化食品強化食品：谷物中缺賴氨酸，蘇氨酸，色氨酸、蛋氨酸。 增鮮劑：增鮮劑：谷氨酸單鈉和天冬氨酸。 苯丙氨酸與天冬氨酸可用于制造低熱量二肽甜味劑(-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此產(chǎn)品1981年獲FDA批準

2、,現(xiàn)在每年產(chǎn)量已達數(shù)萬噸。10.1 概述氨基酸的應(yīng)用食品工業(yè)：食品工業(yè)： 大豆蛋白的氨基酸組大豆蛋白的氨基酸組成影響其營養(yǎng)效價。成影響其營養(yǎng)效價。 10.1 概述氨基酸的應(yīng)用醫(yī)藥工業(yè)：醫(yī)藥工業(yè)： 多種復合氨基酸制劑可通過輸液治療營養(yǎng)或代謝失調(diào) 苯丙氨酸與氮芥子氣合成的苯丙氨酸氮芥子氣對骨髓腫瘤治療有效,且副作用低。10.1 概述氨基酸的生產(chǎn)方法 1、發(fā)酵法 （1）直接發(fā)酵 野生菌株 營養(yǎng)缺陷型突變 抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株 抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的營養(yǎng)缺陷型菌株 營養(yǎng)缺陷型回復突變株 （2）添加前體的發(fā)酵10.1 概述氨基酸的生產(chǎn)方法 2、酶法：利用酶來制造氨基酸。 3、提取法：蛋白質(zhì)水解液

3、中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 4、合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸 傳統(tǒng)的提取法、酶法和化學合成法由于前體物的成本高,工藝復雜,難以達到工業(yè)化生產(chǎn)的目的。10.1 概述氨基酸的國內(nèi)外生產(chǎn)概況 日本和德國為世界主要氨基酸生產(chǎn)國。日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三巨頭。它們能生產(chǎn)高品質(zhì)的氨基酸，可直接用于輸液制劑的生產(chǎn)。日本在美國、法國、中國等建立了合資的氨基酸生產(chǎn)廠家，生產(chǎn)氨基酸和天冬甜精等衍生物。10.1 概述氨基酸的國內(nèi)外生產(chǎn)概況 國內(nèi)生產(chǎn)主要氨基酸生產(chǎn)廠： 天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司 生產(chǎn)規(guī)模及產(chǎn)品質(zhì)量與國外

4、大廠有較大差距。 在80年代中后期,我國從日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以技貿(mào)合作的方式引進輸液制劑的制造技術(shù)，1991年銷售量為二千萬瓶，1996年達六千萬瓶，主要廠家有無錫華瑞，北京費森尤斯，昆明康普萊特，但生產(chǎn)原料都依賴進口。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制發(fā)酵的環(huán)境條件 氨基酸發(fā)酵受菌種的生理特性和環(huán)境條件的影響，對專性需氧菌來說環(huán)境條件的影響更大。 谷氨酸產(chǎn)生菌因環(huán)境條件的影響會引起發(fā)酵的轉(zhuǎn)換，生成各種不同的產(chǎn)物。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制溶解氧：溶解氧：乳酸或琥珀酸谷氨酸酮戊二酸 （通氣不足） （適中） （通氣過量、轉(zhuǎn)速過快）NH4+： 酮戊二酸谷氨酸谷酰胺 （缺乏） （適量） （過

5、量）pH： 谷酰胺，N乙酰谷酰胺谷氨酸 （NH4+過多） （中性或微堿性）磷酸：磷酸： 纈 氨 酸谷氨酸 （高濃度磷酸鹽）生物素：生物素： 乳酸或琥珀酸谷氨酸 （過量） （限量）10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制細胞滲透性 代謝產(chǎn)物的細胞透性是氨基酸發(fā)酵的重要因素，只有使細胞內(nèi)的氨基酸滲透到細胞外，才能大量積累氨基酸。 （1）生物素、油酸和表面活性劑，引起細胞膜的脂肪酸成分的改變。 （2）青霉素：抑制細胞壁的合成，由于細胞內(nèi)外的滲透壓的差異使谷氨酸泄漏出來。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制控制旁路代謝 例如：L異亮氨酸的生物合成可由L蘇氨酸改為D蘇氨酸途徑，即采用旁

6、路代謝。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制降低反饋作用物的濃度 控制反饋作用物濃度，克服反饋抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反應(yīng)能夠順利進行。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用 消除終產(chǎn)物的反饋抑制與阻遏作用，是通過使用抗氨基酸結(jié)構(gòu)類似物突變株的方法來進行。 例：利用抗性突變株消除S（氨基乙酸）L半胱氨酸（即AEC）（賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物）與L蘇氨酸的協(xié)同抑制。10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制促進ATP的積累，增加氨基酸的生物合成 氨基酸的生物合成需要能量，ATP的積累可促進氨基酸的生物合

7、成。 10.2 氨基酸發(fā)酵的代謝控制10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基pH溫度氧10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 1、碳源：、碳源： 淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙醇、烷烴 碳源濃度要適當，避免碳源濃度過高，否則對菌體生長不利，氨基酸的轉(zhuǎn)化率降低。 菌種性質(zhì)、生產(chǎn)氨基酸種類和所采用的發(fā)酵操作決定碳源種類10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 2 2、氮源：、氮源： 銨鹽、尿素、氨水；同時調(diào)整pH值。 營養(yǎng)缺陷型添加適量氨基酸主要添加有機氮源水解液。 需生物素和氨基酸，以玉米漿作氮源。 尿素滅菌時分解或形成磷酸銨鎂鹽，須單獨滅菌，40的尿素可在108 40min，高溫會生產(chǎn)縮脲。 氨水用pH自動

8、控制連續(xù)流加10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 3 3、碳氮比、碳氮比 氮源除用于菌體生長外，還用于氨基酸合成，在氨基酸發(fā)酵中常常是用氨水、尿素來調(diào)節(jié)pH，所以氨基酸發(fā)酵所用的C/N比一般微生物發(fā)酵的低，或者說氮源用量更高。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基 3 3、碳氮比、碳氮比 谷氨酸發(fā)酵在C/N大于100:11才開始積累谷氨酸，所以發(fā)酵的C/N為100:(1530)。 合成菌體使用36的氮源；合成谷氨酸用去3080氮源。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基4 4、NHNH4 4+ +濃度：濃度：過低增加-酮戊二酸積累，過高使谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷酰胺。5 5、磷酸鹽：、磷酸鹽：對發(fā)酵有顯著影

9、響。不足時糖代謝受抑制。6 6、鎂：、鎂：是已糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶和羧化酶的激活劑，并促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活力。7 7、鉀：、鉀：促進糖代謝。谷氨酸產(chǎn)酸期鉀多利于產(chǎn)酸，鉀少利于菌體生長。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基8 8、鈉：、鈉：調(diào)節(jié)滲透壓作用，一般在調(diào)節(jié)pH值時加入。9 9、錳：、錳：是許多酶的激活劑。1010、鐵：、鐵：是細胞色素、細胞色素氧化酶和過氧化氫酶的活性基的組成分，可促進谷氨酸產(chǎn)生菌的生長。1111、銅離子：、銅離子：對氨基酸發(fā)酵有明顯毒害作用。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制培養(yǎng)基生長因子：生長因子：生物素 作用：影響細胞膜透性和代謝途徑。 濃度：過多促進菌體

10、生長，氨基酸產(chǎn)量低。過少菌體生長緩慢，發(fā)酵周期長。 與其它培養(yǎng)條件的關(guān)系：氧供給不足，生物素過量時，發(fā)酵向其它途徑轉(zhuǎn)化。 種類：玉米漿、麩皮水解液、甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜為來源。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 作用機理：作用機理：主要影響酶的活性和菌的代謝。 控制控制pHpH方法方法：流加尿素和氨水 流加方式：流加方式：根據(jù)菌體生長、pH變化、糖耗情況和發(fā)酵階段等因素決定。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制pH對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制 控制：控制： （1）菌體生長或耗糖慢時，少量多次流加尿素，避免pH過高 （2）菌體生長或耗糖過快時，流加尿素可多些，以抑制菌體生長。 （

11、3）發(fā)酵后期，殘?zhí)巧?，接近放罐時，少加或不加尿素，以免造成氨基酸提取困難。 （4）氨水對pH影響大，應(yīng)采取連續(xù)流加。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制溫度對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制菌體生長達一定程度后再開始產(chǎn)生氨基酸，因此菌體生長最適溫度和氨基酸合成的最適溫度是不同的。谷氨酸前者3032C，后者3437C。菌體生長階段溫度不宜過高，否則菌體易衰老，pH增高，糖耗減慢，酸產(chǎn)量低。當菌體生長溫度過高時：要減少通風量，少量多次流加尿素，來促進菌體生長。發(fā)酵中后期：維持合成溫度，以利氨基酸合成。10.3 氨基酸發(fā)酵的工藝控制氧對氨基酸發(fā)酵的影響及其控制要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸發(fā)酵：要求供氧充足的谷氨酸

12、族氨基酸發(fā)酵：生物合成與TCA循環(huán)有關(guān)。適宜在缺氧條件下進行的亮氨酸、苯丙氨酸和適宜在缺氧條件下進行的亮氨酸、苯丙氨酸和纈氨酸發(fā)酵：纈氨酸發(fā)酵：菌體呼吸受阻時產(chǎn)量最大。供氧不足時產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基供氧不足時產(chǎn)酸受輕微影響的天冬氨酸族氨基酸發(fā)酵酸發(fā)酵10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸生產(chǎn)概述起初工業(yè)化生產(chǎn)采取小麥或大豆蛋白質(zhì)水解制取。1957年，日本率先采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)，并實現(xiàn)工業(yè)化，被譽為現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)的重大創(chuàng)舉，使發(fā)酵工業(yè)進入調(diào)節(jié)調(diào)控水平。目前世界產(chǎn)谷氨酸鈉30噸/年，占氨基酸總量的2/3。我國現(xiàn)有200余家生產(chǎn)，年產(chǎn)量達15萬噸，居世界首位。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸產(chǎn)生菌株特

13、點革蘭氏陽性不形成芽胞沒有鞭毛，不能運動需要生物素作為生長因子在通氣條件下才能產(chǎn)生谷氨酸10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸生物合成機理 由三羧酸循環(huán)中產(chǎn)生的a-酮戊二酸，在谷氨酸脫氫酶和氫供體存在下進行還原性氨化作用而得到。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝淀粉的酸水解工藝1 1、調(diào)漿：、調(diào)漿：干淀粉用水調(diào)成10-11Bx的淀粉乳，加鹽酸0.5-0.8至pH1.5。2 2、糖化：、糖化：蒸汽加熱、加壓糖化25min。3 3、中和：、中和：冷卻至80，燒堿中和至pH4.0-5.0（避免產(chǎn)生焦糖又保證過濾，中和為沉淀膠體）。4 4、脫色：、脫色：活性炭脫色和脫色樹脂。活性炭用量為0.6-0.8，在70及酸性條件

14、下攪拌后過濾。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝淀粉的酶法糖化工藝 以大米或碎米為原料時采用大米浸泡磨漿，再調(diào)成15Bx，pH6.0，加細菌-淀粉酶在85 下液化30min，加糖化酶60糖化24h，過濾后可供配制培養(yǎng)基。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝糖蜜原料 不宜直接用來作為谷氨酸發(fā)酵的碳源，因含豐富的生物素。 預(yù)處理方法：活性炭或樹脂吸附和亞硝酸法破壞以減少糖蜜中的生物素。 也可以在發(fā)酵液中加入表面活性劑吐溫60或添加青霉素。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴大培養(yǎng) 1 1、斜面培養(yǎng)：、斜面培養(yǎng)：主要產(chǎn)生菌是棒狀桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬、節(jié)桿菌屬。 我國各工廠目前使用的菌株主要是鈍齒棒桿菌和北京棒桿菌及各種誘

15、變株。生長特點：適用于糖質(zhì)原料，需氧，以生物素為生長因子。 斜面培養(yǎng)基：蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉組成的pH7.0-7.2瓊脂培養(yǎng)基，32培養(yǎng)18-24h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴大培養(yǎng) 2 2、一級種子培養(yǎng)：、一級種子培養(yǎng)：由葡萄糖、玉米漿、尿素、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵及硫酸錳組成。pH 6.56.8。1000ml裝200-250ml振蕩，32 培養(yǎng)12h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝菌種擴大培養(yǎng) 3 3、二級種子培養(yǎng)：、二級種子培養(yǎng)：用種子罐培養(yǎng)，料液量為發(fā)酵罐投料體積的1，用水解糖代替葡萄糖，于32 進行通氣攪拌7-10h。種子質(zhì)量要求：二級種子培養(yǎng)結(jié)束時，無雜菌或噬菌體污染，菌體大小

16、均一，呈單個或八字排列?；罹鷶?shù)為108-109 /ml。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵 1 1、適應(yīng)期：、適應(yīng)期：尿素分解出氨使pH上升。糖不利用。2-4h。措施：接種量和發(fā)酵條件控制使該期縮短。 2 2、對數(shù)生長期：、對數(shù)生長期：糖耗快，尿素大量分解使pH上升，氨被利用pH又迅速下降；溶氧急劇下降后維持在一定水平；菌體濃度迅速增大，菌體形態(tài)為排列整齊的八字形；不產(chǎn)酸；12h。措施：措施：采取流加尿素辦法及時供給菌體生長必須的氮源及調(diào)節(jié)pH在7.5-8.0；維持溫度30- 3210.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵 3 3、菌體生長停止期：、菌體生長停止期：谷氨酸合成，糖和尿素分解產(chǎn)生-酮戊二

17、酸和氨用于合成谷氨酸。措施：措施：及時流加尿素以提供足夠的氨并使pH維持在7.2-7.4。大量通氣，控制溫度34-37 。 4 4、發(fā)酵后期：、發(fā)酵后期：菌體衰老，糖耗慢，殘?zhí)堑?。措施：措施：營養(yǎng)物耗盡酸濃度不增加時，及時放罐。 發(fā)酵周期一般為30h。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （1 1）生物素：）生物素：作為催化脂肪酸生物合成最初反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰CoA的輔酶，參與脂肪酸的生物合成，進而影響磷酯的合成。當磷酯含量減少到正常時的一半左右時，細胞發(fā)生變形，谷氨酸能夠從胞內(nèi)滲出，積累于發(fā)酵液中。生物素過量，則發(fā)酵過程菌體大量繁殖，不產(chǎn)或少產(chǎn)谷氨酸，代謝產(chǎn)物中乳酸和琥珀酸明顯增多10.4

18、谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （2 2）種齡和種量的控制）種齡和種量的控制 一級種子控制在11-12h，二級控制在7-8h。接種量為1。過多，菌體嬌嫩，不強壯，提前衰老自溶，后期產(chǎn)酸量不高。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （3 3）pHpH 發(fā)酵前期，幼齡細胞對pH較敏感，pH過低，菌體生長旺盛，營養(yǎng)成分消耗大，轉(zhuǎn)入正常發(fā)酵慢，長菌不長酸。 谷氨酸脫氫酶最適pH為7.0-7.2，轉(zhuǎn)氨酶最適pH 7.2-7.4。在發(fā)酵中后期，保持pH不變。過高轉(zhuǎn)為谷氨酰胺，過低氨離子不足10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸發(fā)酵控制 （4 4）通風：）通風：不同種齡、種量，培養(yǎng)基成分，發(fā)酵階段及發(fā)酵罐大小要求通風量不同。 在長菌體階段，通風量過大，生物素缺乏，抑制菌體生長。 在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，需要大量通風供氧，以防過量生成乳酸和琥珀酸，但過大通風，則大量積累a-酮戊二酸。10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝10.4 谷氨酸生產(chǎn)工藝谷氨酸的提取 1 1、等電點法：、等電點法：操作簡單，收率60。周期長，占地面積大。 2 2、離子交換法：、離子交換法：用陽離