蛋白質(zhì)組學及其主要研究方法

1、蛋白質(zhì)組學及其主要研究方法摘要：蛋白質(zhì)組學是對機體、組織或細胞的全部蛋白質(zhì)的表達和功能模式進行研究。蛋白質(zhì) 組是動態(tài)的，隨內(nèi)外界刺激而變化，對蛋白質(zhì)組的研究可以使我們更容易接近對生命過程的認識。本文就蛋白質(zhì)組學研究所使用的主要技術(shù)如二維凝膠電泳、質(zhì)譜、酵母雙雜交系統(tǒng)、 生物信息學等進行了相關(guān)綜述。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜；酵母雙雜交；生物信息學Proteomics and its main research techniquesAbstract: Proteomics aims at the analysis and identification of entire protei

2、ns present in the cell tissue or the organism, and of the functions and the linkage of these proteins.the proteome of an organism is dynamic.It changes with the intro and outer stimulus.The study on proteomics can make us easily know how the vital progress goes. The article will introduce these tech

3、-niques of proteomics such as two-dimensional gel electrophoresis、 mass spectrometry、two-hybrid system and bioinformatics etc.Key words: Proteomics;Two-dimensional gel electrophoresis;Mass spectrometry;Two-hybrid system; Bioinformatics眾所周知，始于20世紀90年代初的龐大的人類基因組計劃業(yè)已取得了巨大的成就，人 類基因組序列草圖已經(jīng)繪制完成1。但是，由于基因的主

4、要功能是通過其表達產(chǎn)物一一蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的，因此要揭示整個生命活動的規(guī)律，就必須對蛋白質(zhì)進行研究。蛋白質(zhì)在合成之后具有相對獨立的修飾、轉(zhuǎn)運和相互間作用能力，同時還具有對外界因素發(fā)生反應(yīng)的能力。因此，只有從蛋白質(zhì)組學的角度對生物體整體水平上的蛋白質(zhì)進行研究，才能更好地幫助人們 了解生命的本質(zhì)，各器官的分子結(jié)構(gòu)、功能及其行使該功能的機制等。蛋白質(zhì)組學的發(fā)展是伴隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)，尤其是雙向凝膠電泳和新型質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學的發(fā)展而發(fā)展的，本文將對蛋白質(zhì)組學的主要研究技術(shù)作一概述。1 .蛋白質(zhì)組學產(chǎn)生背景、概念及內(nèi)容蛋白質(zhì)組學研究的興起在后基因組時代，研究的重點已從揭示遺傳信息轉(zhuǎn)移到功能基因組學上來

5、。但是，由于生物功能主要表達者是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)有其自身特有的活動規(guī)律。如蛋白質(zhì)修飾加工、轉(zhuǎn)運定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用等，均無法在基因組水平上獲得。因為基因組學有這樣的局限性，促使人們從整體水平上探討細胞蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律2。蛋白質(zhì)組學概念的提出蛋白質(zhì)組被定義為細胞，器官或組織型的蛋白質(zhì)成分的總稱3;而蛋白質(zhì)組學是研究這些成分在指定的時間或特定的環(huán)境條件下的表達，具體說它是對不同時間和空間上發(fā)揮功能性特定蛋白質(zhì)群組進行研究，即在蛋白質(zhì)水平上探索其作用模式、功能機理、調(diào)節(jié)調(diào)控，以及蛋白質(zhì)群組內(nèi)相互作用。其目的是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)

6、組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。因 為蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接表達者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機制。蛋白質(zhì)組學的研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學從其研究內(nèi)容方面可分為表達蛋白質(zhì)組學，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學和功能蛋白質(zhì)組學4。表達蛋白質(zhì)組學主要研究細胞或組織在不同條件如藥物或疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達和 功能，這將有助于識別疾病特異蛋白、藥物作用靶點、藥物成效和毒性標記等；結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學的目標是識別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并研究蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)之間的相互作用與控制細胞生長、復(fù)制等的代謝和信號通路有關(guān)，蛋白質(zhì)之

7、間相互作用的改變可能引起人類疾??； 功能蛋白質(zhì)組學是位于對個別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。從理論的角度講，因此,對“全部蛋白質(zhì)”的研究是非常困難的 ，而功能蛋白質(zhì)組學則注重于從局部入手 ，把目標定位在蛋白質(zhì)群體上。這樣的群體可大可小，取決于要研究的功能特點和所用的研究手段。功能蛋白質(zhì)組學研究可只注重那些可能涉及到特定功能機理的蛋白質(zhì)群體。2 .蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)典型的蛋白質(zhì)組學分析是在蛋白提取后，先凝膠的或非凝膠的方法別離蛋白質(zhì)，然后以不同的質(zhì)譜分析方法進行蛋白分析、鑒定，接著以生物信息學輔助獲取和深入分析全面的信息，并可以指導(dǎo)更深層的功能蛋白質(zhì)學研

8、究5。通?？刹捎眉毎蚪M織中的全蛋白質(zhì)組分進行蛋白質(zhì)組分析。也可以進行樣品預(yù)分級即采用各種方法將細胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分分別進行蛋白質(zhì)組研究。樣品預(yù)分級的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細胞中不同的細胞器定位進行分級，如專門別離出細胞核、線粒體或高爾基體等細胞器的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測，還可以針對某一細胞器的蛋白質(zhì)組進行研究。色譜技術(shù)色譜技術(shù)的原理是溶于流動相中的各組分經(jīng)過固定相時，與固定相發(fā)生相互作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等 ）,由于作用的大小、強弱等不同，各組分在固定相中滯留的時間不同，由此從固定相中流出的先后也不同，最終使

9、不同組成成分得到別離。色譜法根據(jù)別離原理分類，有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜、凝膠滲透色譜及親和色譜 等。按操作形式可分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法等 6。根據(jù)流動相的物理狀態(tài)不同 可分為：氣相色譜法和液相色譜法。高效液相色譜法（HPLC）是以液體作為流動相，并采用顆粒極細的高效固定相的柱色譜別 離技術(shù)。它是在傳統(tǒng)液相色譜的基礎(chǔ)上，輔以高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器及電腦技術(shù)的應(yīng)用，從而實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作，因此被稱為HPLC它對樣品的適用性廣，不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適于別離分析沸點高、熱穩(wěn)定性差、分子量大的許多有機物和一些無機

10、物，但是HPLC的固定相的別離效率、檢測器 的檢測范圍以及靈敏度等。雙向凝膠電泳雙向凝月電泳（Two-dimensional gel electrophoresis,2DE）仍是蛋白質(zhì)組學研究的核心技 術(shù)。其基本原理：第一項基于蛋白質(zhì)的等電點不同在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦；第二項則根據(jù)分子量的不同大小進行 SDS-PAGE別離，把復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。 根據(jù)第一項等電聚焦條件和方式的不同，可將雙相電泳分為三種系統(tǒng) 7。第一種是在聚丙烯酰胺管中進行，載體兩性電解質(zhì)在外加電場作用下形成pH梯度，它的最大缺點是不穩(wěn)定，易發(fā)生陰極漂移，重復(fù)性差。第二種系統(tǒng)主要是采用丙烯酰胺和不同的p

11、H值的固定化電解質(zhì)共聚所形成的具有pH梯度的膠，此種膠條的形成需要一些能與丙烯酰胺單體結(jié)合的分子，每 個含有一種酸性或堿性緩沖基團。第三種系統(tǒng)是非平衡 pH梯度電泳，常常被用來別離堿性蛋 白質(zhì)。由于雙向電泳利用了蛋白質(zhì)兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)別離，其分辨率非常高。蛋白質(zhì)被別離以后用考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色或放射性標記等方法顯示。其中銀染比考馬斯亮藍染色靈敏度高，蛋白質(zhì)分辨率可以達ng級I8。但是銀染的線性效果并不是很好，并且對質(zhì)譜分析干擾大；考馬斯亮藍染色線性、均一性較高，對質(zhì)譜干擾較小，但 其敏感性較低；較理想的是熒光染色，但其成本較高。質(zhì)譜技術(shù).1質(zhì)譜技術(shù)的原理質(zhì)譜（mass spe

12、ctrometry）是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（或質(zhì)量）的大小順序排列的圖譜?，F(xiàn)在多通過質(zhì)譜儀對蛋白樣品進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析的基本原理是，用于分析的樣品分子（或原子）在離子源中離子化成具有不同質(zhì) 量的單電荷分子離子和碎片離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動能并形成一束離子，進入由電場和磁場組成的分析器 ，離子束中速度較慢的離子通過電場后編轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)?。辉诖艌鲋须x子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉(zhuǎn)，即速度慢的離子依然偏轉(zhuǎn)大 ，速度快的偏轉(zhuǎn)??；當兩個場的偏轉(zhuǎn)作用彼此補償時，它們的軌道便相交于一點。 與此同時，在磁場中還能發(fā)生質(zhì)量的別離，這樣就使具有同一質(zhì)荷比而速度不同的離子聚焦在

13、同一點上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點上，其焦面接近于平面，在此處用檢測系統(tǒng)進行檢測即可得到不同質(zhì)荷比的譜線，即質(zhì)譜9。通過質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位 素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息。.2蛋白質(zhì)組學研究中主要運用的質(zhì)譜技術(shù)蛋白質(zhì)組學研究中應(yīng)用的質(zhì)譜技術(shù)有：電噴霧質(zhì)譜：是噴射過程中以連續(xù)離子化方式使多肽樣品電離；基質(zhì)輔助激光解吸質(zhì)譜：是利用基質(zhì)吸收激光的能量使得固相的多肽樣 品離子化，它常與飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用，稱為基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜。另外還有快原子轟擊質(zhì)譜和同位素質(zhì)譜等。外表加強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜 SELDI-TOF-MS：是一種新的蛋白質(zhì)檢測技術(shù)

14、，操作簡單、靈敏度高，檢測所需樣品量 少。串聯(lián)質(zhì)譜MS/MS：在這種情況下，經(jīng)質(zhì)譜分析的肽段進一步斷裂并再次進行質(zhì)譜 分析，這樣可得到肽序列的部分信息10。應(yīng)用于較普遍的是蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀。原理是利用經(jīng)過特殊處理的固相支持物或芯片基質(zhì)外表，制成蛋白質(zhì)芯片，根據(jù)蛋白質(zhì)生化特性不同，選擇性地從待測生物樣品中捕獲配體，將其結(jié)合在芯片的固相基質(zhì)外表上，用激光脈沖輻射使芯片外表的分析物解析成帶電離子，質(zhì)荷比不同離子在電場中飛行時間不同，據(jù)此繪制出質(zhì)譜圖。 檢測結(jié)果經(jīng)過軟件處理后可直接顯示樣品中各種蛋白質(zhì)的分子量、含量等信息，可檢測分子量在500kD以下的化合物。測定過程迅速、敏捷大大提高了蛋白質(zhì)

15、鑒定能力，可用于生物標志物發(fā)現(xiàn)、鑒定與蛋白質(zhì)譜分析。.3質(zhì)譜技術(shù)的評價質(zhì)譜技術(shù)能清楚地鑒定蛋白質(zhì)并能準確地測量肽和蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、氨基酸序列及翻譯后的修飾。目前MS/MS是唯一能夠迅速測序 N-端封閉或共價修飾肽段的方法。質(zhì)譜 技術(shù)很靈活，能與多種蛋白別離、捕獲技術(shù)聯(lián)用，對普通的緩沖液成分相對耐受，能快速鑒定大量蛋白質(zhì)點，而且很靈敏，但它只能別離氣體狀態(tài)的帶電分子，而且一次只能分析帶正電或帶負電的分析物。 質(zhì)譜分析很難區(qū)分兩種同源性極高的蛋白。由于質(zhì)譜分析只是描述蛋白的少量多肽，因此可能把刪節(jié)的蛋白當成是原來的蛋白。通常只用于象酵母等基因組序列已知的個體。酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的建

16、立得益于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式，即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其中DNA結(jié)合域簡稱為DB）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（簡稱為AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。DB和AD分別能與多肽 X和Y結(jié)合，由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”和“獵物”或“靶蛋白”11。如果在X和Y之間存在相互作用，那么分別位于這兩個融 合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子，

17、從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間相互作用的基因稱之為報道基 因。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測，反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)不僅可用于驗證兩個已知蛋白間的相互作用或找尋它們相互作用的結(jié) 構(gòu)域，還可以用來從cDNA文庫中篩選與已知蛋白作用的蛋白基因。由酵母雙雜交系統(tǒng)衍生 的酵母單雜交系統(tǒng)、酵母三雜交系統(tǒng)和反向雙雜交系統(tǒng)等使這一技術(shù)得到了更廣泛的應(yīng)用。 大規(guī)模酵母雙雜交系統(tǒng)如酵母雙雜交系統(tǒng)芯片的建立為蛋白質(zhì)組學研究提供了支持12。酵母雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強有力的方法，但是它只能

18、反映蛋白質(zhì)間可能發(fā)生作用，還必須結(jié)合其它試驗才能確認，尤其是要與生理功能研究相結(jié)合。因此該方法仍在不斷的完善中，如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與小分子肽、蛋白質(zhì) 與DNA、蛋白質(zhì)與RNA間的相互作用，而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的功能蛋白質(zhì)和研究蛋白質(zhì)的 功能，而且在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認識上發(fā)揮著重 要的彳用口司。生物信息學生物信息學是把核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子數(shù)據(jù)庫作為主要研究對象，用數(shù)學、統(tǒng)計、電腦科學等為主要研究手段 ，對大量生物學原始試驗數(shù)據(jù)進行存儲、整理、管理、注釋、加 工，使之成為具有明確生物學意義的生物信息14。通過對生物信息的查詢、搜索、比

19、較、分析,從中獲取基因編碼、基因調(diào)控、核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能及其相互關(guān)系等知識，從而探索未知世界。.1生物信息學與蛋白質(zhì)分析在蛋白質(zhì)組分析過程中，生物信息學的作用不僅僅表達在數(shù)據(jù)庫的查閱和資料的整合中，生物信息學軟件在蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域的作用更是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)分析軟件應(yīng)用主要集中在蛋白質(zhì)組研究中的別離技術(shù)和鑒定技術(shù)，對有價值的未知蛋白進行分析和預(yù)測。應(yīng)用生物信息學，可以對蛋白質(zhì)進行以下4個方面的分析預(yù)測。蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)預(yù)測從蛋白質(zhì)序列出發(fā)，預(yù)測蛋白質(zhì)的許多物理性質(zhì)，包括等電點、分子量、酶切特性、疏 水性、電荷分布等。相關(guān)工具有Compute pI/MW（等電點和分子量工具 ）；Peptide

20、Mass（酶切特性工具）；TGREASE（疏水性工具）；SAPS（電荷分布工具）等15。.蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析根據(jù)20種氨基酸的理化性質(zhì)可以分析電泳等實驗中的未知蛋白質(zhì)，同樣也可以分析已知蛋白質(zhì)的物化性質(zhì)。ExPASy是一個由Swiss-Prot;TrEMBL;EMBL 等多個數(shù)據(jù)庫的集合，主 要專注的領(lǐng)域是蛋白質(zhì)分子和蛋白質(zhì)組學，可以利用數(shù)據(jù)庫中提供的一系列相應(yīng)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行分析。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的基本依據(jù)是每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結(jié)構(gòu)的 傾向。因此進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測需要通過統(tǒng)計和分析發(fā)現(xiàn)這些傾向或者規(guī)律。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法有3種16。一是由已知結(jié)構(gòu)統(tǒng)計

21、各種氨基酸殘基形成二級結(jié)構(gòu)的構(gòu)象趨勢，其中最常用的是Chou和Fasman法;二是基于氨基酸的物理化學性質(zhì)，包括堆積性、疏水性、電荷性、氫鍵形成能力等；三是通過序列比對，由已知三維結(jié)構(gòu)的同源蛋白推斷未知蛋白的二級結(jié) 構(gòu)。各種方法預(yù)測的準確率隨蛋白質(zhì)類型的不同而變化。一般對于“螺旋預(yù)測精度較好，對3折疊差些，而對除a螺旋和3折疊等之外的無規(guī)則二級結(jié)構(gòu)則效果很差。.1.4蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是預(yù)測時最復(fù)雜和最困難的預(yù)測技術(shù)。序列差異較大的蛋白質(zhì)序列也可能折疊成類似的三維構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)的折疊過程并不十分清晰，從理論上解決蛋白質(zhì)折疊的問題還有待進一步的科學發(fā)展，但也有了一些有一定作用的三維

22、結(jié)構(gòu)預(yù)測方法。即與已知 結(jié)構(gòu)的序列比較，同源模建，threading算法和折疊識別方法17。.2生物信息學與蛋白質(zhì)功能生物信息學發(fā)展到今天，不僅可以對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進行分析和預(yù)測，而且可以對已知或者未知的基因產(chǎn)物進行功能上全面的分析和預(yù)測。生物信息學最常用的分析方法是模式識別。 主要是利用存在于蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)中的某些特殊的特征模體來識別相關(guān)蛋白質(zhì)性質(zhì)。換而言之，就是從新的蛋白序列中發(fā)現(xiàn)標志性的序列或者結(jié)構(gòu)，以此建立模式，然后在已經(jīng)建立好的已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中，搜集與此相似的模式，來確定未知蛋白質(zhì)的歸屬，從而預(yù)測它的功能18。許多基因是在特定時期和條件下被激活，才能表達出來，在正常人工模擬的環(huán)境下根

23、本無法表達。類似于這樣的未知蛋白質(zhì)也需要通過生物信息學的方法計算分析預(yù)測，以獲得它的功能信息。3.結(jié)束語蛋白質(zhì)組學為直接在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模研究基因功能提供了有力工具。利用質(zhì)譜技術(shù)研究凝膠別離的蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)功能研究具有重要作用。蛋白質(zhì)鑒定將在高通量、高靈敏度、完整性等方面進一步完善19；分析手段將向自動化、微量化、平行化方向發(fā)展。21世紀將是一個整體細胞生物學的時代，DNA和RNA的信息加上相應(yīng)的蛋白質(zhì)信息的補充和提高，將構(gòu)成完整的細胞分子生物學的研究20。參考文獻： 1Wilkina MR,Ppasquali C, Appel RS,et al.Fom proteins to proteo

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