保健食品中西地那非和他達拉非的快速檢測膠體金免疫層析法

1、附件1保健食品中西地那非和他達拉非的快速檢測 膠體金免疫層析法（KJ201901）i范圍本方法規(guī)定了保健食品中西地那非和他達拉非的膠體金免疫層析快速篩查方法。本方法適用于聲稱具有抗疲勞、調節(jié)免疫等功能的保健食品中西地那非和他達拉非成分的快 速篩查。2原理本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中的西地那非和他達拉非等物質經(jīng)提取后與膠體金 標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條或檢測卡中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中西地那非和他達拉非成分進行定性判定。3試劑材料3.1 試劑除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T

2、 6682規(guī)定的二級水。3.1.1 甲醇：色譜純。3.1.2 三羥甲基氨基甲烷，Tris堿。3.1.3 濃鹽酸。3.1.4 吐溫-20。3.1.5 鹽酸溶液：量取濃鹽酸（3.1.3）16.7 mL，用水溶解并稀釋至 100 mL。3.1.6 緩沖液：稱取12.1 g Tris堿（3.1.2），加適量水溶解，混勻，用鹽酸溶液（3.1.5）調節(jié)pH至8.0，加入5.0 g吐溫-20（ 3.1.4）攪拌均勻，定容至 1000 mL。3.2 參考物質參考物質的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子量見表1,純度均99%。表1參考物質信息表序號中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量序號

3、中文名稱英文名稱CAS登錄號分子式相對分子量1西地那非Sildenafil139755-83-2C22H 30N6O4S474.582他達拉非Tadalafil171596-29-5C22H19N3O4389.40注：或等同可溯源物質。3.3 標準溶液配制3.3.1 西地那非標準儲備液（1.0 mg/mL ）:精密稱取適量西地那非參考物質 （3.2）,用甲醇（3.1.1） 溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液。-20 C避光保存，有效期1年。3.3.2 西地那非標準工作液（10卩g/mL）：精密移取適量西地那非標準儲備液 （1.0 mg/mL）（ 3.3.1） 分

4、別置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為 10卩g/mL的標準 工作液。-20 C避光保存，有效期 3個月。3.3.3 他達拉非標準儲備液（0.5 mg/mL ）:精密稱取適量他達拉非參考物質 （3.2）,用甲醇（3.1.1） 溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為0.5 mg/mL的標準儲備液。-20 C避光保存，有效期1年。3.3.4 他達拉非標準工作液 （10卩g/mL）:精密移取適量他達拉非標準儲備液 （0.5mg/mL ） （3.3.3） 分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.1）稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為 10卩g/mL的標準工 作液。-2

5、0C避光保存，有效期 3個月。3.4 材料西地那非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質為保健食品。 他達拉非膠體金免疫層析試劑盒及配套的試劑（可選），適用基質為保健食品。4設備與儀器4.1 設備4.1.1 天平：感量為 0.1 mg和0.01 g。4.1.2 渦旋混合器。4.1.3 移液器：20-200 X, 100-1000 譏，5 mL。4.1.4 離心機：轉速可達 4000 r/min以上。4.2 儀器4.2.1 讀數(shù)儀：產(chǎn)品配套可使用的檢測儀器（可選）。4.2.2 環(huán)境條件：溫度 10-40 C,相對濕度W 80%。5分析步驟5.1 試樣制備液體樣品充分混勻，固體樣品充分

6、粉碎混勻。5.2 試樣提取和凈化5.2.1 液體基質量取0.5 mL ±）.02 mL試樣于15 mL離心管中，加入 4 mL緩沖液（3.1.6）,渦旋混合 30 s, 作為待測液。5.2.2 固體基質5.2.2.1 檢測西地那非準確稱取試樣 0.5 g ±01 g于15 mL離心管中，加 1 mL甲醇（3.1.1），渦旋 30 s，4000 rpm 離心2 min或靜置2 min。取250丄上清液于2 mL離心管中，加入 750山緩沖液（3.1.6），渦 旋混合30s,作為待測液。5.2.2.2 檢測他達拉非準確稱取試樣 0.5 g ±.01 g于15 mL離心

7、管中，加 1 mL甲醇（3.1.1），渦旋 30 s, 4000 rpm 離心2 min或靜置2 min。取200丄上清液于15 mL離心管中，加入 3 mL緩沖液（3.1.6），渦旋 混合30 s,作為待測液。注：試樣提取和凈化（ 5.2 ）過程可按照試劑盒說明書操作,不做限定。5.3 測定步驟5.3.1 試紙條與金標微孔測定步驟吸取200 L樣品待測液于金標微孔中， 抽吸510次使混合均勻，室溫溫育5 min ;溫育結束 后，將試紙條吸水海綿端垂直向下插入金標微孔中，室溫溫育5 min，從微孔中取出試紙條， 去掉試紙條下端的吸水海綿,進行結果判定。注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。5.3.

8、2 檢測卡與金標微孔測定步驟吸取200卩1上述待測液于金標微孔中， 上下抽吸510次使混合均勻。室溫溫育5 min ,將反 應液全部加入到檢測卡的加樣孔中，將金標微孔中全部溶液滴加到檢測卡上的加樣孔中，溫育5min ,進行結果判定。注：測定步驟建議按照試劑盒說明書。5.4 質控試驗每批樣品應同時進行空白試驗和加標質控試驗。5.4.1 空白試驗準確稱取固體空白試樣 0.5 g ±.01 g或量取液體空白試樣 0.5 mL ±0.02 mL于15 mL離心管中， 按照 5.2 和 5.3步驟與試樣同法操作。5.4.2 加標質控試驗準確稱取固體空白試樣 0.5 g ±.

9、01 g或量取液體空白試樣 0.5 mL ±0.02 mL于15 mL離心管中， 加入適量標準工作液 （3.3.2），使西地那非參考物質濃度為1.0 g/g或1.0 g/mL，按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。準確稱取固體空白試樣0.5 g ±.01 g或液體空白試樣 0.5 mL ±0.02 mL于15 mL離心管中，加入適量標準工作液（3.3.4）,使他達拉非參考物質濃度為1.0 gg/g或1.0 gg/mL ,按照5.2和5.3步驟與試樣同法操作。6 結果判定通過對比控制線（C線）和檢測線（T線）的顏色深淺進行結果判定。目視判定示意圖見圖1。結果判定也可

10、根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。6.1 無效控制線（C線）不顯色，表明不正確操作或試紙條無效。6.2 陰性結果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或檢測線（T線）顏色與控 制線（C線）顏色相當，均表示樣品中不含待測組分或含量低于方法檢測限，判為陰性。6.3 陽性結果控制線（C線）顯色，檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色明顯淺或檢測線（T線）不顯 色，均表示樣品中待測組分含量高于方法檢測限，判為陽性。6.4 質控試驗要求空白試驗測定結果應為陰性，加標質控試驗測定結果應為陽性。結論當檢測結果為陽性時，應對結果進行確證。性能指標8.1檢出限固體樣品1.0卩g/g液體樣品1.0卩g/m

11、L>8.2靈敏度靈敏度95%。8.3 特異性特異性90%。8.4 假陰性率假陰性率w 5%。8.5 假陽性率假陽性率w 10%。注： 性能指標計算方法見附錄 A。9 其他本方法分析步驟和結果判定可以根據(jù)廠家試劑盒的說明書進行，但應符合或優(yōu)于本方法規(guī)定 的性能指標。本方法所述試劑、試劑盒信息及操作步驟是為給方法使用者提供方便，在使用本方法時不做 限定。但方法使用者應使用經(jīng)過驗證的滿足本方法規(guī)定的各項性能指標的試劑、試劑盒。本方法參比標準為食品補充檢驗方法BJS201710保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測藥品檢驗補充檢驗方法 2009030補腎壯陽類中成藥中 PDE-5型抑制劑的快速檢

12、測方法。本方法使用西地那非試劑盒可能與那莫西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、偽伐 地那非、伐地那非、硫代艾地那非存在交叉反應；他達拉非試劑盒可能與氨基他達拉非、去甲基 他達拉非存在交叉反應；當結果判定為陽性應對結果進行確證。附錄A定性方法性能指標計算表表A.1性能指標計算方法樣品情況a檢測結果b總數(shù)陽性陰性陽性N11N12N1.=N11+N12陰性N21N22N2.=N21+N22總數(shù)N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或 N.1+N.2顯著性差異（乎）F=（ |N12-N21 -1）2/（ N12+N21），自由度（df）=1靈敏度（P+，%）p+=N11/N1.特異性（P-，%）p-=N22/N2.假陰性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-靈敏度假陽性率（pf+，%）pf+-N21/N2=100-特異性相對準確度，%c（N11+N22）/（N1.+N2.）注：a由參比方法檢驗得到的結果或者樣品中實際的公議值結果； b由待確認方法檢驗得到的結果。靈敏度的計算使用確