細(xì)胞生物學(xué)--細(xì)胞生物學(xué)教案doc

1、細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)方案第一章 序論第一節(jié) 細(xì)胞生物學(xué)的特點(diǎn)1 2 3第二節(jié) 細(xì)胞學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史Aristotle的名言 一 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) Robert Hooke A.V. Leeuwenhoek二 細(xì)胞學(xué)說(shuō)的建立 Schleiden Schwann 細(xì)胞學(xué)說(shuō)的主要內(nèi)容 1. 2. 3. Virchow(1858)的名言 1 2 二細(xì)胞學(xué)的經(jīng)典時(shí)期 1 原生質(zhì)和原生質(zhì)體概念的提出 Mohl l804原生質(zhì)(protoplasm)1880原生質(zhì)體 (protoplasm) 2 細(xì)胞分裂的研究 1841 Remak amitosis Flemming mitosis Beneden meiosi

2、s 3 重要細(xì)胞器的發(fā)現(xiàn)Altmann1894 mitochondrion Golgi Golgi bady三 細(xì)胞學(xué)的分支1遺傳學(xué)的發(fā)展(1) Beneden1876 精卵細(xì)胞染色體數(shù)只是體細(xì)胞染色體數(shù)的一半(2)1900 Mendl孟德爾定律的重新發(fā)現(xiàn)(3)1905 Wilson發(fā)現(xiàn)性別和染色體的關(guān)系 Weissman 預(yù)見遺傳單位有次序的排列在染色體上 (4) Sutton 染色體學(xué)說(shuō) 染色體行為和遺傳因子聯(lián)系起來(lái).(5)1910 Morgan 連鎖 基因圖2 細(xì)胞生理學(xué)3 細(xì)胞化學(xué)四 細(xì)胞生物學(xué)的形成與發(fā)展 1953 Watson Crick DNA空間結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn) 六十年代 "

3、;細(xì)胞生物學(xué)" 產(chǎn)生 七十年代 細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)的開展 八十年代 分子細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展 九十年代 分子細(xì)胞生物學(xué)高科技手段的發(fā)展和運(yùn)用 DNA指紋 PCR技術(shù) 雜交瘤技術(shù)的運(yùn)用 第二章 細(xì)胞基本知識(shí)第一節(jié) 非細(xì)胞形態(tài)的生命體 1 朊病毒(Prion) 巴布亞新幾內(nèi)亞一土著 庫(kù)魯病 笑死癥 羊腦 風(fēng)牛病 2 類病毒 3 病毒第二節(jié) 原核細(xì)胞1 支原體2 衣原體3 立克次氏體4 放線菌5細(xì)菌和藍(lán)藻第三節(jié) 真核細(xì)胞基本知識(shí)概要1 三大系統(tǒng) 2 動(dòng)植物細(xì)胞的比較 第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 自1680年荷蘭學(xué)者列文虎克(Leeuven hoek)用單顯微鏡(單透鏡)第一次看到酵母活細(xì)胞以來(lái),人

4、們一直在努力改革和發(fā)展觀察手段，來(lái)研究細(xì)胞較深層次的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。今天人們已經(jīng)有了具有原子尺度高分辨本領(lǐng)的掃描隧道顯微鏡。與此同時(shí)人們還創(chuàng)造了一系列對(duì)細(xì)胞組分和細(xì)胞生理活動(dòng)進(jìn)行詳盡分析的方法和手段,它們揭示了各種細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子在細(xì)胞內(nèi)的功能和作用。為了提供大量均一的細(xì)胞作為生物學(xué)的研究材料,人們又發(fā)展了一系列細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。這些培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)給人類帶來(lái)了極大的利益?？梢哉J(rèn)為，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察技術(shù)，細(xì)胞組分及功能的分析技術(shù)及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞生物學(xué)賴以發(fā)展的三大技術(shù)手段。在這里我們只能對(duì)某些具有代表性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)作一簡(jiǎn)單的介紹。希望學(xué)生通過(guò)本章的學(xué)習(xí)不但能了解實(shí)驗(yàn)技術(shù)本身，還

5、能夠了解到細(xì)胞生物學(xué)這一實(shí)驗(yàn)科學(xué)的發(fā)展是和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步休戚相關(guān)的,因此發(fā)展和開發(fā)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)也是細(xì)胞生物學(xué)的一項(xiàng)重要內(nèi)容。 第一節(jié) 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一 固定法與活體觀察法 固定法是以一定的化學(xué)物質(zhì)的溶液(有時(shí)是氣體)在盡可能保持細(xì)胞生活結(jié)構(gòu)的情況下迅速殺死組織塊。這一過(guò)程稱為固定(Fixation)。然后制成薄切片,再染色(Staining)進(jìn)行觀察。這種方法比起觀察活細(xì)胞有三個(gè)優(yōu)點(diǎn):第一,它能清楚地顯現(xiàn)細(xì)胞的細(xì)微構(gòu)造,如關(guān)于染色體,各種細(xì)胞器、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的微細(xì)構(gòu)造都是靠這種方法闡明的。第二,這種方法的制片一般均能保存很久,便于前后研究各種現(xiàn)象之比較。第三,應(yīng)用范圍廣,幾乎可用于

6、所有的組織細(xì)胞。 這種方法不僅在細(xì)胞學(xué)發(fā)展的歷史上發(fā)揮過(guò)很大作用,而且在現(xiàn)代細(xì)胞學(xué)中也是重要研究手段之一。例如用電子顯微鏡研究細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)時(shí)通常都使用固定法。固定法在細(xì)胞化學(xué)的研究上也有廣泛的應(yīng)用。固定法的缺點(diǎn)是,在用固定劑(Fixative)殺死細(xì)胞的同時(shí),常常難免使細(xì)胞的某些生活結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變形。因此這種方法不能完全如實(shí)地反映生活細(xì)胞的情況。在實(shí)踐上往往是能保存細(xì)胞某種結(jié)構(gòu)的固定劑,卻不能使另一些結(jié)構(gòu)保留下來(lái)。例如,適于觀察染色體的固定劑,對(duì)于觀察線粒體就不合適。有人因?yàn)楣潭ǚǖ倪@種缺點(diǎn)而對(duì)它抱懷疑主義的態(tài)度。這是過(guò)分偏激的觀點(diǎn)。事實(shí)上只要選擇合適的固定劑,這種方法是能展示給我們細(xì)胞結(jié)

7、構(gòu)的許許多多細(xì)節(jié)的。當(dāng)然,另一方面在應(yīng)用此法時(shí)也不應(yīng)該忘掉它的固有缺點(diǎn)。在研究某種結(jié)構(gòu)時(shí),最好同時(shí)多用幾種固定劑，對(duì)比分析所觀察的現(xiàn)象，以免做出主觀的判斷?；铙w觀察法的優(yōu)缺點(diǎn)與固定法正好相反。它的優(yōu)點(diǎn)是能夠如實(shí)地反映生活細(xì)胞的情況。但完全做到這一點(diǎn)也并不容易，必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，最大限度地使所觀察的細(xì)胞得到正常生活條件。活體觀察的缺點(diǎn)是，顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精細(xì)程度較差。這和在活體情況下細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)的折光率相近有關(guān)。相差顯微鏡的運(yùn)用雖然在一定程度上可以克服這一缺點(diǎn)，但較之固定法在顯示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的精細(xì)程度上仍大有遜色。 由于組織培養(yǎng)方法的進(jìn)步，能夠進(jìn)行活體觀察的細(xì)胞種類也大大增多。 固定法和活體觀察

8、法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能互相代替。只有結(jié)合并用，取長(zhǎng)補(bǔ)短，方有利于全面認(rèn)識(shí)細(xì)胞生活的真相。 二 各種顯微鏡 觀察細(xì)胞離不開顯微鏡（Microscope）。這正象觀察天體要用望遠(yuǎn)鏡一樣。常用的顯微鏡有普通光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡等。 1、普通光學(xué)顯微鏡（Light microscope）的分辨本領(lǐng)各種顯微鏡識(shí)別微觀物象的能力常用分辨力（resolving power）的概念來(lái)表示。分辨力是指能夠區(qū)分相近兩點(diǎn)的最小距離，能夠區(qū)分的兩點(diǎn)間距離越小，表示顯微鏡的分辨力越高。分辨力亦稱分辨本領(lǐng)。顯微鏡的分辨力是由物鏡決定的。它和物鏡的鏡口率、照明光線的波長(zhǎng)有直接關(guān)系。分辨力

9、可按下式計(jì)算： 0.61 R=- (a) NAR-分辨力-照明光源的波長(zhǎng)NA-鏡口率（數(shù)值孔徑） Sin NA= n - (b) 2 n-物鏡與標(biāo)本間的介質(zhì)的折射率-物鏡的鏡口角 所謂鏡口角是指從物鏡光軸上的物點(diǎn)發(fā)出的光線與物鏡前透鏡有效直徑的邊緣所張的角度（2-1）。鏡口角小于180，故Sin1/2的最大值也小于1。 從公式（a）可以看出，為提高分辨力，光源波長(zhǎng)(越小越好，而物鏡的鏡口率NA越大越好。按可視光線的波長(zhǎng)(（400-700毫微米）為540毫微米，物鏡的最大鏡口率為1.3計(jì)算，R=0.25微米。這就是說(shuō)，相近兩點(diǎn)的距離小于0.25微米時(shí)，普通光學(xué)顯微鏡將不能分辨出這兩點(diǎn)。因?yàn)榭梢暪?/p>

10、線的波長(zhǎng)可小到400毫微米。所以一般認(rèn)為普通光鏡的分辨本領(lǐng)的極限約為0.2微米。 細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)如染色體、線粒體、中心體、核仁等大于0.2微米，在光學(xué)顯微鏡中能觀察到。這種結(jié)構(gòu)稱顯微結(jié)構(gòu)（microscopic structure）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜、核膜、微管、微絲等因小于0.2微米，在普通光學(xué)顯微鏡下看不到，稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopie structure）。 從公式(b)可以看出，要增大鏡口率必須提高物鏡與標(biāo)本間介質(zhì)的折射率?？諝獾恼凵渎蕿?，香柏油的折射率為1.515。因?yàn)橐龃箸R口率必須用油浸物鏡。 2、暗視野顯微鏡 暗視野顯微鏡(darkfield microscope)是根

11、據(jù)丁達(dá)爾(Tyndall)效應(yīng)的原理設(shè)計(jì)的。若在暗室中穿入一細(xì)束光線,那么由側(cè)面觀察時(shí),那些在普通照明的散射光下看不見的空氣中的細(xì)小塵埃顆粒,可以看得很清楚。這種現(xiàn)象稱丁達(dá)爾現(xiàn)象。暗視野顯微鏡是因?yàn)橐曇皟?nèi)不能直接看到照明光線,只能看到被檢物體散射或衍射的光線。故視野內(nèi)呈黑暗狀態(tài)。由于被檢物體表面散射的光亮.才使我們能夠在黑暗的視野中觀察到被檢物體的外形和運(yùn)動(dòng)。普通顯微鏡的最高分辨力如上所述為 0.2微米,而暗視顯微鏡雖然對(duì)被檢物體的細(xì)微構(gòu)造分辨不清,但卻可看到0.004微米以上的微粒子的存在。這是普通光學(xué)顯微鏡所不具有的特性。暗視野顯微鏡與普通顯微鏡的構(gòu)造差別,在于集光器的特殊。普通顯微鏡換上

12、暗視野集光器或用中心擋光法(用黑色厚紙或金屬薄片制成圓形擋光片。放在普通集光器下面的濾光玻片上，擋住中央光束)。即可取得暗視野效果。用中心擋光法若想取得良好的暗視野效果，除了選擇適當(dāng)直徑的中心擋光片外，還須考慮反射鏡的角度，光源的強(qiáng)度等各種因素。常見的暗視野集光器是拋物面集光器（圖2-2）。它的集光鏡是一個(gè)單透鏡，周圍成斜度較小的拋物線形式。由顯微鏡的反光鏡反射出的光線，被集光鏡的中部遮光板所阻擋，但側(cè)面光線則自由進(jìn)入遮光板旁和透鏡邊緣之間的縫隙。這些光線在聚光鏡的拋物面的凹面上發(fā)生折射,結(jié)果光線集中到聚光鏡的界面以外,處于觀察標(biāo)本的平面上。由于直線進(jìn)行的光束被遮光板擋住不能進(jìn)入物鏡,因此視野

13、變暗。而折射光線集中到標(biāo)本的物鏡結(jié)構(gòu)時(shí)被散射非常光亮,通過(guò)物鏡達(dá)到觀察者眼中,故觀察細(xì)胞的某些結(jié)構(gòu)(尤其是細(xì)胞質(zhì)顆粒)是亮的(圖2-3)。 3、相差顯微鏡 人們?cè)陲@微鏡下觀察被檢標(biāo)本時(shí),只能靠顏色(光波的波長(zhǎng))和亮度(光波的振幅)的差別看到被檢物的結(jié)構(gòu)?；罴?xì)胞近于無(wú)色透明,當(dāng)光波通過(guò)它時(shí)顏色和亮度變化不大。因此在普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)致觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)是很難的。 三十年代Zernike.F.提出相差顯微鏡(phase contrast microscope)的原理和設(shè)計(jì),四十年代開始制造相差顯微鏡出售。由于有了相差顯微鏡,在一定程度上克服了上述困難可以直接看到活細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)變化。相差是指同一光線經(jīng)

14、過(guò)折射率不同的介質(zhì),其相位發(fā)生的差異。那么什么是相位呢？相位是在某一時(shí)間上光的波動(dòng)所能達(dá)到的位置。當(dāng)光波通過(guò)兩種不同折射率的物質(zhì)時(shí)(如由空氣入水,或由空氣入玻璃),其波長(zhǎng)、振幅和相位皆有不同程度的變化。例如,使光分別通過(guò)1公分厚的水和玻璃時(shí),由于水和玻璃的折射率不同,通過(guò)它們的光波的相位產(chǎn)生一定差異（通過(guò)玻璃的光波的相位落后)。這個(gè)相位差異稱相差(圖2-4)。相差決定于光波所通過(guò)的介質(zhì)的折射率之差與厚度,等于折射率與厚度的乘積之差。介質(zhì)越厚或折射率越大,光波減速也越大。 光線的相差用肉眼分辨不出,只有利用衍射和干涉現(xiàn)象,把相差變?yōu)檎穹?即明暗之差,肉眼才能識(shí)別。光波通過(guò)小顆粒(物體)后產(chǎn)生直

15、射光和衍射光。后者的振幅較小,相位延后(圖2-5)。當(dāng)在光學(xué)系統(tǒng)中,這種直射光和衍射光相遇時(shí),根據(jù)它們相位的異同,其振幅發(fā)生減小或加大的變化,使光線變暗或變亮,這種現(xiàn)象稱為干涉。相差顯微鏡的工作原理如圖2-6和圖2-7所示。光線通過(guò)聚光鏡下的環(huán)狀光闌在物鏡的焦點(diǎn)面聚光。載片上的物體A受來(lái)自環(huán)狀光闌的光線照射,直射光在A處成像，而散發(fā)的衍射光一部分也由于物鏡透鏡的作用在A成像。這時(shí)觀察者看到的是直射光和衍射光在A處干涉形成的像。但如果使用的是普通物鏡，衍射光的相位落后1/4波長(zhǎng)，并且比直射光的成像弱，因此干涉合成的光與背景光線的振幅差別很小。相差顯微鏡的物鏡中安裝有相板。相板有推遲直射光或衍射光

16、的相位和吸收光量，以調(diào)節(jié)直射光或衍射光的亮度的作用。利用相差物鏡的相板，把直射光推遲1/4波長(zhǎng)，使直射光和衍射光維持同一相位（圖2-7、B）兩者的光波由于干涉現(xiàn)象，其振幅為二者之和。因背景只有直射光,故被照射的物體比背景亮,稱明反差(bright contrast)或負(fù)反差(negative contrast)。如用另一種相差物鏡的相板,把衍射光推遲1/4波長(zhǎng),直射光的衍射光的相位差變成1/2波長(zhǎng),由它們干涉合成的光波振幅為二者振幅之差(圖2-7、C),故被照射物體比背景暗,稱暗反差(dark contrast)或正反差(positive contrast)。相差顯微鏡的裝置和普通顯微鏡不同者

17、是前者聚光鏡下加環(huán)狀光闌.物鏡里裝有相板。另外有調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡。不同倍數(shù)的相差物鏡要用相應(yīng)的環(huán)狀光闌。因此環(huán)狀光闌有10×、20×、40×、100×等不同直徑的,裝配在一個(gè)旋轉(zhuǎn)盤內(nèi),按需要調(diào)換使用。物鏡的相板上有一個(gè)半透明環(huán),環(huán)和環(huán)以外的部分涂有不同的物質(zhì),使通過(guò)的光線產(chǎn)生一定的相位差,以取得明反差或暗反差效果。用顯微鏡目鏡看不清光闌亮圈和相板的環(huán)狀圈。只有用調(diào)軸望遠(yuǎn)鏡方能看清楚,以便轉(zhuǎn)動(dòng)調(diào)節(jié)裝置,使兩個(gè)環(huán)圈重合對(duì)齊。這樣才能發(fā)揮相差顯微鏡的效能,看清活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。相差顯微鏡的光源要用強(qiáng)光,并使用波長(zhǎng)較短的單色濾光玻璃,通常用綠色玻片。4、熒光顯微鏡 某些物

18、質(zhì)受紫外線照射時(shí)發(fā)出熒光(可視光線),這種物質(zhì)稱熒光物質(zhì)。例如維生素A、核黃素、硫胺素等都是細(xì)胞內(nèi)的天然熒光物質(zhì)。用熒光顯微鏡(fluorescence microscope)可以觀察這些熒光物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布位置。另外給細(xì)胞中加入熒光染料(如中性紅、甲基綠、吖啶橙、吖啶黃、剛果紅等)可使細(xì)胞中某些物質(zhì)受紫外線照射使誘發(fā)出熒光。例如固定的切片標(biāo)本,用吖啶橙染色,經(jīng)紫外線照射時(shí)可使細(xì)胞內(nèi)的核糖核酸(RNA)發(fā)生紅色熒光,脫氧核糖核酸(DNA)發(fā)生綠色熒光。熒光顯微鏡通常采用高壓水銀燈等做為發(fā)生紫外光的光源。在光源和反光鏡之間放一濾光裝置,把紫外線經(jīng)過(guò)集光器照射到被檢物體上使之發(fā)生熒光。此外,在熒

19、光顯微鏡的接物鏡上方或目鏡下方的鏡筒中裝設(shè)另一個(gè)濾光鏡,把剩余的紫外線吸收掉,以保護(hù)眼睛,但使熒光能夠通過(guò)。這樣就可通過(guò)目鏡觀察細(xì)胞中的熒光現(xiàn)象(圖2-8)。熒光顯微鏡有時(shí)在光源與標(biāo)本間所用的透鏡是用石英制成的,反光鏡是涂鋁的或?yàn)槭⑷忡R。 5，電子顯微鏡(electron microscope) 可見光的波長(zhǎng)制約了普通光學(xué)顯微鏡的分辨能力。人們?cè)诳紤]可能替換的光源。1926年有人發(fā)現(xiàn)了磁場(chǎng)對(duì)電子束的聚焦效應(yīng)，接著魯斯卡(Ruska)借助于磁力線圈把電子束聚焦于盡可能小的點(diǎn)上。這兩項(xiàng)研究成果奠定了制作電子顯微鏡的基礎(chǔ)。1831年魯斯卡等人通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)了和光學(xué)成象的幾何原理一樣，電子照射的物體

20、也可以用磁電子透鏡分二次放大的形式顯示出來(lái)。1933年魯斯卡制成了第一臺(tái)電子顯微鏡，這臺(tái)電鏡被看作是當(dāng)代各種型號(hào)電鏡的祖先。他得到了500 A的圖象。由于當(dāng)時(shí)電鏡技術(shù)尚不完善，他們研究的物質(zhì)經(jīng)常被強(qiáng)烈的電子束碳化。1939年魯斯卡極大的改善了電子顯微鏡，西門子公司開始批量生產(chǎn)并成功的將電子顯微鏡推向了市場(chǎng)。1986年魯斯卡與掃描隧道顯微鏡的發(fā)明人拜寧（Binning)等一起被授于諾貝爾物理獎(jiǎng)。魯斯卡在80高齡得到這次殊榮，是為了獎(jiǎng)勵(lì)他在24歲時(shí)發(fā)明的電子顯微鏡，他可能是歷史上最老又最年輕的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者。電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡的幾何成象原理雖然一樣,但分辨本領(lǐng)卻有了顯著的提高.這首先是由于電子

21、顯微鏡是用電子束作為照明的光源.電子束的波長(zhǎng)遠(yuǎn)比光波的波長(zhǎng)短.其次,電子顯微鏡使用的是電子透鏡。光學(xué)透鏡是由玻璃制成的可見物質(zhì)透鏡.與此相反，電子透鏡不是肉眼可見的物質(zhì)透鏡,他是由磁或電所行成的局部空間來(lái)起透鏡的做用.正如光學(xué)透鏡使光線入射到玻璃時(shí)產(chǎn)生折射一樣,電子束經(jīng)過(guò)電子透鏡也會(huì)產(chǎn)生折射.電子透鏡共有三組,分別起類似光學(xué)顯微鏡的聚光鏡、物鏡和目鏡(投射鏡)的作用。 在電鏡中,透過(guò)被檢物的電子束投打到熒光屏上，電子能轉(zhuǎn)換成光能,成為我們可觀察到的影象。也可以讓電子投射在感光板上,拍被檢物的相片。那么電子束是怎么成象的呢?它和光學(xué)象的形成有何不同？在光學(xué)顯微鏡中，成象的反差度,即亮度差,是因被

22、檢物的不同結(jié)構(gòu)吸收光線的強(qiáng)弱程度不同造成的。就是說(shuō),入射電子與物質(zhì)原子碰撞后產(chǎn)生散射,被檢的不同部位有不同的散射度,這樣就形成了電子象的濃淡.電子束的散射度是由物體的密度與厚之積,以及加速電壓的大小決定的。 電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)是由鏡筒(本體結(jié)構(gòu)) 真空系統(tǒng)和供電系統(tǒng)三部份組成。 鏡筒是由照明系統(tǒng)，標(biāo)本室,成象系統(tǒng)和照相裝置組成。最上部是做為電子源的電子槍.給其中的金屬絲(鎢絲)加熱到達(dá)高溫時(shí)電子就會(huì)從金屬表面發(fā)射出來(lái)。發(fā)射出來(lái)的電子帶負(fù)電荷,可背5-10萬(wàn)伏的高壓電加速。電壓越高電子加速越大，電子運(yùn)動(dòng)速度大致與電壓平方根成正比.加速的電子束經(jīng)第一個(gè)電子透鏡（聚光鏡）集攏并調(diào)節(jié)強(qiáng)度，照射到試料標(biāo)本

23、上.然后在第二個(gè)電子透鏡(物鏡)成象和放大.物鏡是電子顯微鏡的心臟.第三個(gè)電子透鏡是投影鏡（目鏡）它起把物鏡放大的象再放大的做用，即僅放大鏡的作用. 所以，從鏡筒的主要部分的構(gòu)成看,電子顯微鏡和光學(xué)顯微鏡是相似的。但由于電子顯微鏡中是使用電子束代替照明的光源，故在構(gòu)造上有以下主要特點(diǎn)： (1)空氣對(duì)電子束起明顯的阻礙做用，因此鏡筒必須保持高度真空。所以電鏡要配備真空泵裝置。 (2)配備有加速電子用的高壓電源. (3)為電子束的波長(zhǎng)單一化,配備有穩(wěn)壓裝置。 (4)為使電子象變成肉眼可見的光學(xué)象，在觀察部位上設(shè)置熒光屏（觀察室）和照相室. (5)放大倍數(shù)高的電鏡在物鏡和投影鏡之間還裝置一個(gè)中間鏡,

24、以多一級(jí)放大。調(diào)節(jié)中間鏡的電流,可在很大范圍內(nèi)變動(dòng)放大倍數(shù)。 電鏡觀察的標(biāo)本必須是非常干燥的，同時(shí)切片必須很薄(一般位200-900A)因?yàn)殡娮邮且恢袔щ姷牧Ｗ恿?進(jìn)入被檢物體后與物質(zhì)的電子和原子核發(fā)生作用而散射，故只能透過(guò)極薄的物體。 近年來(lái)，電鏡的研究和制造有了很大的進(jìn)展。一方面電鏡的分辨率不斷提高，透射電鏡的分辨率由最初魯斯卡發(fā)明電鏡的10nm提高到了0.20.3nm，晶格分辨率已接近0.1nm;另一方面除透射電鏡(Transmission electron microscope)、掃描電鏡(Scanning electron microscope) 分析電鏡(analytic ele

25、ctron microscope)外，還發(fā)展了其他種電鏡。如高壓電鏡(high voltage electron microscope),加速電壓在120KV以上的電鏡即為高壓電鏡，如果電壓超過(guò)500KV就稱為超高壓電鏡。目前世界上最高的加速電壓可以達(dá)到3000KV，電鏡體積龐大，相當(dāng)于二層樓房的高度。高壓電鏡主要特點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，可用于觀察較厚的樣品，整體培養(yǎng)的細(xì)胞不需超薄切片即可觀察內(nèi)部的三維微細(xì)結(jié)構(gòu)，如微絲、微管等。 6掃描隧道顯微鏡(Scanning tunneling microscope,簡(jiǎn)稱 STM)。 人類永遠(yuǎn)不會(huì)停止對(duì)微觀世界的探索，在電子顯微鏡發(fā)明大約半個(gè)世紀(jì)后，1981年拜

26、寧（Binning）等又發(fā)明了掃描隧道顯微鏡它的成象原理完全不同于光鏡和電鏡?；诹孔恿W(xué)原理，研究者們發(fā)展出了一系列高分辨顯微鏡。這些發(fā)明為人類打開了通向微觀世界的一扇又一扇大門，使人類真正進(jìn)入了納米世界。 STM是這類顯微鏡的代表，它能探索微觀世界物質(zhì)表面原子排列的狀況。STM的探頭有一根探針，針尖只有一個(gè)原子的大小，探針的針尖接近但不接觸觀測(cè)樣品的表面并且同時(shí)進(jìn)行掃描.根據(jù)量子物理學(xué)原理，當(dāng)針尖上的原子與樣品表面的原子的距離小于1納米時(shí)，針尖和樣品間會(huì)產(chǎn)生隧道效應(yīng)，即產(chǎn)生隧道電流.通過(guò)記錄隧道電流的變化就可以獲得樣品表面原子排列的情況并把它轉(zhuǎn)化為圖像。 STM具有其他顯微鏡不可比擬的功能

27、和特點(diǎn)：（1）具有高分辨能力。它平行于物體表面的分辨率,即側(cè)分辯率可以達(dá)到0.10.2nm，而垂直于物體表面方向的分辨率,即縱分辯率可以達(dá)到0.01納米。（）具有搬移能力。STM不僅可以直接觀察物質(zhì)表面的原子排列情況，而且還可以通過(guò)探針對(duì)物質(zhì)表面的原子或分子進(jìn)行搬移.從而人們可以按著自己的意愿在原子水平上進(jìn)行重構(gòu)或組建新的材料。（3）具有刻蝕能力。STM能對(duì)物質(zhì)表面進(jìn)行刻蝕，通過(guò)計(jì)算知道一個(gè)大頭針大小的地方就能記錄下來(lái)象”紅樓夢(mèng)”那樣的一部書.這為制作高密度信息儲(chǔ)存文件和納米的電子原件提供了新途徑。（4）具有在多種多樣下的工作能力。對(duì)于生物學(xué)研究尤其重要的是STM可以在真空、大氣等多種條件下工

28、作。（5）不破壞樣品，STM在工作時(shí)既不接觸樣品又沒有高能電子束的轟擊.因此，可以避免樣品的變形。總之，STM的觀察到的原子是目前人類所能直接看到的微觀世界的最小尺度，這項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的研究領(lǐng)域。用STM得到的DNA照片使人類第一次清楚的看到了它的表面形態(tài)?？梢钥隙?，STM等基于量子力學(xué)原理創(chuàng)建的顯微鏡將在納米生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。第二節(jié) 細(xì)胞組分及功能的分析方法首先人們利用一系列顯微鏡對(duì)細(xì)胞及其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了卓有成效的觀察，并且結(jié)合一些化學(xué)手段確定了細(xì)胞器及一些大分子聚合物在細(xì)胞中的排布.如對(duì)細(xì)胞膜、細(xì)胞核、染色體、細(xì)胞分裂等的觀察。在深入研究中人們不禁要問(wèn)，這些細(xì)胞結(jié)

29、構(gòu)的化學(xué)組成如何？它們?cè)趫?zhí)行著什么樣的功能？要解決這些問(wèn)題只靠觀察手段就不夠了。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展人們逐步創(chuàng)造了一系列分析細(xì)胞組分及功能的方法。這些方法大致可分為三種：第一種方法是把細(xì)胞及大分子分離出來(lái)進(jìn)行研究，即分離分析法；第二種是不破壞細(xì)胞或組分，在原位進(jìn)行組分和功能的研究，既原位分析法.第三種則是在細(xì)胞或細(xì)胞組分生活狀態(tài)下進(jìn)行的動(dòng)態(tài)分析法。當(dāng)然觀察方法和分析的方法并沒有嚴(yán)格的界限。正是觀察方法和分析方法有機(jī)的結(jié)合才使得細(xì)胞生物學(xué)有了長(zhǎng) 足的進(jìn)步。 一、分離分析法 1、細(xì)胞分離技術(shù) 要對(duì)不同類型的細(xì)胞及組分進(jìn)行詳盡的分析研究，首先要得到一定量的同一類型的細(xì)胞，進(jìn)而才能得到純化的細(xì)胞器及其它

30、細(xì)胞組分。 可以用蛋白水解酶（胰蛋白酶和膠原酶）和鈣鏊合劑乙二胺四乙酸（EDTA)處理組織，從中得到大量分上散較好的細(xì)胞懸液。再利用細(xì)胞不同的物理性質(zhì)，通過(guò)沉降和離心把大小不同的細(xì)胞或輕重不同的細(xì)胞分離開。 利用免疫技術(shù)分離細(xì)胞是比較先進(jìn)的方法。將某一種類型細(xì)胞表面特異性抗原的抗體與某種材料結(jié)合（如膠元、多糖小珠或塑料）形成集合表面。這樣當(dāng)各種細(xì)胞通過(guò)這一集合表面時(shí)，只有被這種抗體識(shí)別的細(xì)胞才能粘附在集合表面，然后用輕微的振蕩或用酶破壞可溶性基質(zhì)（如膠元）就可將同一類型的細(xì)胞回收。 目前流式細(xì)胞術(shù)和分類術(shù)（flow cytometry and serting,FCM, FCS)是一項(xiàng)較新的開拓

31、性技術(shù)，可以用此項(xiàng)技術(shù)來(lái)分離細(xì)胞。首先要用熒光染料偶聯(lián)的抗體來(lái)標(biāo)記需要分離的細(xì)胞，然后將這種混合的單細(xì)胞懸液樣品和鞘流液（蒸餾水或等滲鹽水）由氣體壓力裝置送進(jìn)流動(dòng)室，使樣品和鞘流液同軸流動(dòng)。鞘流管末端成圓錐形，具尖端有70100um直徑的孔，這樣迫使細(xì)胞排成單行流出鞘流管尖端小孔進(jìn)入樣品流與激光束交叉區(qū)既檢測(cè)區(qū)。通過(guò)振動(dòng)蕩流動(dòng)室時(shí)細(xì)胞流束已成為小水滴。荷電環(huán)系對(duì)帶有熒光細(xì)胞的小水滴充電。當(dāng)帶電小水滴通過(guò)高壓偏轉(zhuǎn)板時(shí)，充電的小水滴就會(huì)偏離原來(lái)的流向，而不帶電的小水滴（其中含有未標(biāo)記細(xì)胞）不偏向。收集偏向的小水滴就可以得到大量標(biāo)記的特殊細(xì)胞。 現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)是結(jié)合計(jì)算機(jī)科學(xué)、激光技術(shù)、單克隆抗體制

32、劑、定量細(xì)胞化學(xué)等的一項(xiàng)綜和技術(shù)，它不但可以分離細(xì)胞而且還可以測(cè)量細(xì)胞的多種參數(shù)，其中包括象細(xì)胞大小、形狀等不經(jīng)染色處理就可直接測(cè)量的固有（intrinsic)參數(shù)，還包括經(jīng)過(guò)的熒光劑染色后可測(cè)出的細(xì)胞DNA含量、RNA含量和細(xì)胞總蛋白量等的外源（extrinsic)參數(shù)。例如當(dāng)排成單列的細(xì)胞通過(guò)激光束時(shí)，熒光染色的單個(gè)細(xì)胞受到激光束的激發(fā)，會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，信號(hào)檢測(cè)器可測(cè)定出標(biāo)記細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度。從而對(duì)許多外源參數(shù)進(jìn)行測(cè)定（表 ）。 流式細(xì)胞計(jì)可在1小時(shí)內(nèi)分類收集一億八千萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，純度可達(dá)9099%?？稍?分鐘內(nèi)測(cè)出10000個(gè)細(xì)胞的DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞體積。此儀器應(yīng)用廣泛但價(jià)格十

33、分昂貴（圖 ）。 2、細(xì)胞器及生物大分子的分離技術(shù) 通過(guò)細(xì)胞分離方法可以得到純化的細(xì)胞群體，并且可以在細(xì)胞整體水平上進(jìn)行研究。如果要深入研究各種細(xì)胞器及細(xì)胞內(nèi)含物就需要用低滲、超聲波等方法使細(xì)胞崩解，造成細(xì)胞勻漿，這一 過(guò)程叫做細(xì)胞的勻漿化（homogenigation)。然后便可以根據(jù)需要將亞細(xì)胞組分或各種顆粒分別分離出來(lái)。分離的方法主要應(yīng)用的是離心技術(shù)。 離心機(jī)是一種借離心力把顆粒從中心向外推移的機(jī)器，當(dāng)離心力超過(guò)地球引力時(shí)，懸浮在液體里的顆粒就會(huì)離開中心向外沉降。用普通離心機(jī)可以很快使紅細(xì)胞沉降下來(lái)，也可把鮮奶分成奶油和較重的脫脂奶兩部分。然而要分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)只有普通離心機(jī)是不夠的。19

34、20年代，瑞典化學(xué)家斯維德伯格（Theodor Svedberg)發(fā)明了一種超速離心機(jī)，它的轉(zhuǎn)數(shù)可達(dá)每分鐘十幾萬(wàn)轉(zhuǎn)，產(chǎn)生的離心力相當(dāng)于地心引力的幾十萬(wàn)倍。超速離心機(jī)的出現(xiàn)極大的推動(dòng)了細(xì)胞生物學(xué)的研究.有了一系列離心機(jī)還不夠，為了更精確的分離研究對(duì)象，人們還創(chuàng)造了各種離心方法以適應(yīng)不同研究層次的需要。(1) 差速離心法（differential centrifugation) 差速離心法是利用不同的離心速度所產(chǎn)生的不同的離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離開.勻漿液在離心場(chǎng)中，不同大小的顆粒沉向離心管底部的速度不同，當(dāng)離心力不高并且離心時(shí)間不長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞核首先沉到管底。取出上清液進(jìn)行離心并加大離

35、心力，這時(shí)可分離出線粒體，這樣進(jìn)行下去不斷增大離心力，最后可分離出核糖體(圖 )。怎樣對(duì)分離出的物質(zhì)進(jìn)行純度鑒別呢？一般有兩種方法，一種是用電鏡作形態(tài)學(xué)鑒定。更為簡(jiǎn)便的是利用各種細(xì)胞器的特征酶或特殊分子做生化分析。 用差速離心法對(duì)細(xì)胞器的分離只是初步的，要取得比較純的細(xì)胞器還需要進(jìn)一步的分離純化。另外，經(jīng)離心分離出核糖體以后所剩的上清液是可溶性部分和極微小的顆粒及一些生物大分子所組成。這些成分需要用更嚴(yán)格的超速離心才能分離出來(lái)，為此人們又發(fā)展出了密度梯度離心法。(2)密度梯度離心法(density gradient centrifugation)這種方法是利用離心溶液形成梯度來(lái)維持重力的穩(wěn)定性

36、和抑制對(duì)流的。這需要在溶液中加入化學(xué)惰性物質(zhì)，如蔗糖、甘油及鹽類（如氯化銫、氯化銣）。這些物質(zhì)不影響分離物的物理及化學(xué)性質(zhì)，分離物的密度一定要在梯度柱密度的范圍內(nèi)，經(jīng)高速離心后，不同密度的分離物就會(huì)集中在等密度帶中而得到相互的分離. 蔗糖密度梯度離心 這種方法比較適合于對(duì)細(xì)胞器的進(jìn)一步分離（表 ）。這需要預(yù)先制成不同濃度的蔗糖液（一般濃度在5%20%或10%60%）。用一定的方法在離心管中做成自下而上遞減的濃度梯度，將待分離的懸液加在最上面，經(jīng)超速離心，不同大小、密度的顆粒由于沉降速率不同，它們將會(huì)分別集中在不同的區(qū)帶中，這樣就達(dá)到了分離它們的目的(圖 )。 氯化銫（CsCl)密度梯度離心 氯

37、化銫是重金屬鹽類，它的溶解度高，其溶液密度可達(dá)1.7g/ml，它在離心場(chǎng)中會(huì)自動(dòng)形成密度梯度。用來(lái)分離的物質(zhì)可直接和金屬氯化銫溶液混合，然后進(jìn)行等密度離心。這種方法適合于測(cè)定大分子或顆粒的浮力密度（圖 ）。也就是說(shuō)，它是根據(jù)檢測(cè)對(duì)象的浮力密度的差異而不是根據(jù)他的大小來(lái)進(jìn)行分離的.比如線粒體、溶酶體或過(guò)氧化物酶體的大小相近，但密度不同，我們可以根據(jù)浮力密度對(duì)它們做進(jìn)一步的分離。這種方法的精確和靈敏是令人信服的，早在1957年人們就用氯化銫密度梯度離心技術(shù)將含有N標(biāo)記的細(xì)菌DNA和未標(biāo)記的細(xì)菌DNA分子分離開，這個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)直接證明了DNA的半保留復(fù)制。利用離心特別是超速離心技術(shù)對(duì)細(xì)胞及其組分進(jìn)行分

38、離分析,在細(xì)胞生物學(xué)的研究中起著極重要的作用。例如，從對(duì)分離純化出的線粒體和葉綠體的研究中人們了解到了這些細(xì)胞器在能量轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用。用分離分析方法可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的封閉泡互相分離開。粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)分離形成的小泡稱微粒體（microsome)，它給內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的研究帶來(lái)了極大的方便.正是對(duì)微粒體分離研究使我們得到了關(guān)于分泌蛋白合成機(jī)制等許多成果。又如，在蛋白質(zhì)合成機(jī)制的研究中，當(dāng)初發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞粗提液中能使RNA翻譯成蛋白質(zhì)。然后將粗提液分步分離，依次得到了核糖體、tRNA和各種酶，是否是這些物質(zhì)構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成體系呢？我們可以向這個(gè)體系中加入或不加入各種純組分，這樣就可以研究出每個(gè)組分在整個(gè)過(guò)程

39、中發(fā)揮準(zhǔn)確作用。事實(shí)上，在研究細(xì)胞及其組分的功能過(guò)程中,分離分析的方法是在構(gòu)建一種非細(xì)胞體系（cell-free system)。這種體系來(lái)源于細(xì)胞，但不具有完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它包含了部分細(xì)胞提取物，這些提取物能夠進(jìn)行正常的生物學(xué)反應(yīng)。用這種方法使細(xì)胞中各種生物學(xué)過(guò)程相互分開，不受細(xì)胞中復(fù)雜副反應(yīng)的干擾，因而可以確定這些生物學(xué)過(guò)程的詳細(xì)的分子機(jī)制。近年來(lái)，非細(xì)胞體系有了更廣泛的應(yīng)用，以非洲瓜蟾卵提取物非細(xì)胞體系為例，來(lái)自非洲瓜蟾的卵首先去膠膜后，經(jīng)活化、裂解、然后超速離心，去掉上層脂類和下層卵黃、色素顆粒后剩下的提取物即是非細(xì)胞反應(yīng)體系。向該體系中加入外源DNA，孵育一段時(shí)間后即可重構(gòu)成新的細(xì)胞

40、核。人們利用這一體系研究探討了許多細(xì)胞生物學(xué)的重要問(wèn)題。如細(xì)胞周期調(diào)空、DNA復(fù)制，核膜及染色質(zhì)組裝、核質(zhì)運(yùn)輸?shù)取Ｐ枰f(shuō)明的是,離心技術(shù)有二個(gè)主要參數(shù).一是離心力，一般用離心機(jī)的每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min)來(lái)表示。文獻(xiàn)中也經(jīng)常直接用離心力（g)來(lái)表示。它們之間的換算關(guān)系是： 。二是沉降系數(shù)（sedimetation coeffient），它是用來(lái)表示大分子沉降速度的，各種大分子顆粒均具有一定的沉降系數(shù)。為了紀(jì)念諾貝爾獎(jiǎng)獲得者斯維德伯格，沉降系數(shù)的單位用了他的名字命了名，即斯維德伯格單位（Svedberg unit)，1S=1x1013秒，簡(jiǎn)稱S。二、細(xì)胞的原位分析方法人們除了用分離的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行

41、研究外，同時(shí)還發(fā)展出了一系列對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原位分析的方法。顧名思義，這種方法要求被測(cè)定的物質(zhì)必須保持在細(xì)胞的原來(lái)位置不動(dòng)。一般的細(xì)胞化學(xué)方法都屬于這一類。比如為了測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸、多糖和脂類等細(xì)胞組分，通常利用一些顯色劑與被檢物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性的結(jié)合，通過(guò)這種結(jié)合所產(chǎn)生的顏色和顏色深淺度的不同來(lái)判斷各種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應(yīng)呈黑色，用以證明脂肪滴的存在。用氮-汞試劑與組織中蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應(yīng),形成紅色沉淀。這是著名的米倫(Millon)反應(yīng)。原位分析的方法很多，我們?cè)谶@里僅作一簡(jiǎn)單的介紹.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法在一些經(jīng)典的蛋白質(zhì)細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)中，如米倫反應(yīng)、

42、重氮反應(yīng)等，都只是一種一般蛋白質(zhì)的定位反應(yīng)，如果想了解其一特殊蛋白質(zhì)的情況需要用特殊蛋白質(zhì)的原位分析法。近些年發(fā)展起來(lái)的免疫細(xì)胞化學(xué)法（immunocytochemistry)開創(chuàng)了這方面研究工作的新領(lǐng)域.這項(xiàng)技術(shù)主要是利用抗原和其相應(yīng)的抗體能作特異性結(jié)合即免疫反應(yīng)這一原理，來(lái)定位組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)抗原成分的一類技術(shù)。我們可以利用這一技術(shù)來(lái)對(duì)蛋白類抗原進(jìn)行定位定性分析。雖然抗原和抗體的結(jié)合具有高度的敏感性和特異性，但是抗體與抗原的結(jié)合是看不見的，為了解決這一問(wèn)題，早在四十年代Coons巧妙的使熒光素和抗體項(xiàng)結(jié)合，然后用這種被標(biāo)記的抗體同被檢測(cè)的抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)，這樣就很容易在熒光顯微鏡下檢測(cè)到

43、組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。從而創(chuàng)建了這項(xiàng)技術(shù).后來(lái)，用于標(biāo)記抗體的物質(zhì)不斷得到改進(jìn)，先后出現(xiàn)了免疫酶標(biāo)記技術(shù)、免疫鐵蛋白技術(shù)。特別是1971年Faulk和Taylor創(chuàng)造的免疫膠體金技術(shù)是目前最受歡迎的免疫電鏡技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)的特點(diǎn)是，膠體金能迅速而穩(wěn)定地與蛋白質(zhì)即抗體相結(jié)合.這是一種由于蛋白質(zhì)被膠體金表面負(fù)電荷吸引而結(jié)合的過(guò)程。這種結(jié)合主要是物理過(guò)程，不會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性.另外金顆粒容易識(shí)別，能產(chǎn)生強(qiáng)烈的二次電子，是理想的掃描電鏡的標(biāo)記物。今天，免疫電鏡技術(shù)已得到了廣泛的應(yīng)用，如分泌蛋白的研究、胞內(nèi)酶的研究、一些結(jié)構(gòu)蛋白的研究，包括膜蛋白的定位與細(xì)胞骨架蛋白的定位等。膠體金不但能與免疫球蛋白即抗

44、體相結(jié)合形成金標(biāo)記抗體，而且還可以同其他蛋白相結(jié)合形成金標(biāo)記酶、金標(biāo)記凝集素等。因此金標(biāo)記酶不僅可用于光鏡和電鏡的免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，還可以用于其它物質(zhì)的檢測(cè)。2 孚爾根(Feulgen)反應(yīng) 1924年德國(guó)化學(xué)家 孚爾根（Robert Feulgen)在研究核酸時(shí)找到了一種方法，它只能使DNA著色，而RNA不著色。他發(fā)現(xiàn)DNA在細(xì)胞核里，特別是在染色體里。他用此方法證明，DNA普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞核中。后來(lái)，人們稱這種能特異顯示DNA存在部位的方法為孚爾根反應(yīng)。這一技術(shù)的基本步驟是：首先用酸處理已固定好的材料，酸水解可以除去RNA,保留DNA，并在DNA的嘌呤脫氧核糖苷鍵水平上除去嘌呤，使脫氧

45、核糖的醛基暴露。然后用希夫試劑(Shiff)處理，所暴露的自由醛基就會(huì)與希夫試劑起反應(yīng)而呈現(xiàn)紫紅色.在顯微鏡下可以看到紫紅色的核，無(wú)色的胞質(zhì)和核仁,即細(xì)胞核的福爾根反應(yīng)為正，而胞質(zhì)為負(fù)反應(yīng)。核中異染色質(zhì)區(qū)為強(qiáng)的正反應(yīng)，核仁為負(fù)反應(yīng)。3 原位雜交技術(shù) 福爾根技術(shù)可使我們了解到一般DNA在細(xì)胞中的存在位置.但如果我們想知道某段特殊核苷酸順序在染色體上或在細(xì)胞中的確切位置，福爾根技術(shù)便無(wú)能為力了，這需要用原位雜交技術(shù)。 原位雜交（in situ hybridization)是一項(xiàng)核酸分子雜交技術(shù)（nuclear acid molecular hybridization technique)。其原理是

46、，兩條具有互補(bǔ)核苷酸順序的單鏈核苷酸分子片斷,在一定條件下通過(guò)氫鍵的結(jié)合形成DNADNA,DNARNA或RNARNAd 的雙鏈分子。進(jìn)行原位雜交首先要制作探針，即對(duì)一段特異的核酸序列進(jìn)行放射性同位素或熒光素的標(biāo)記.然后要把所要研究的樣品如細(xì)胞或染色體固定于載玻片上,并使DNA或RNA原位變性,再注入探針，使樣品與標(biāo)記的核酸進(jìn)行原位雜交反應(yīng)。將未反應(yīng)的標(biāo)記核酸分離后，用放射自顯影術(shù)或螢光技術(shù)對(duì)雜交分子進(jìn)行觀察和定位。例如，1974年Steffensen等從HeLa細(xì)胞的多核糖體中分離出5SrRNA，并以I標(biāo)記制成探針，并測(cè)探出5SrRNA的基因在染色體上的位置。具體過(guò)程是這樣的，首先對(duì)載片上的人

47、體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行原位變性，并加入探針.這時(shí)，探針只能和產(chǎn)生它的模板DNA互補(bǔ)，即進(jìn)行分子雜交，而其他部位則不行。放射自顯影暴露二個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)在所有制片的染色體組中，一對(duì)一號(hào)染色體均被標(biāo)記，標(biāo)記的位置是短臂末端，這說(shuō)明5SrRNA基因位于第一號(hào)染色體的短臂末端。原位雜交技術(shù)首先是在光鏡水平上發(fā)展起來(lái)的。近年來(lái)隨著免疫電鏡技術(shù)的不斷進(jìn)步，電鏡原位雜交技術(shù)也得到了發(fā)展。電鏡原位雜交和光鏡原位雜交的基本原理是一致的，區(qū)別是探針的標(biāo)記物不同，一般以生物素等一些小分子取代同位素或螢光素來(lái)標(biāo)記特異核苷酸序列來(lái)制作探針進(jìn)行原位雜交。然后用與膠體相連的生物素的特異性抗體對(duì)原位雜交樣品進(jìn)行免疫反應(yīng)，這樣就可在

48、電鏡下觀察到探針的位置，從而把特異核酸序列的定位與細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)合了起來(lái)。 三、 細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析的方法 事實(shí)上，在生活狀態(tài)的細(xì)胞中生物大分子總是呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的。人們?cè)缇拖Ｍ苷业揭恍┓椒?可以對(duì)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)的分析研究. 第一位在這個(gè)方向上努力的是德國(guó)生物化學(xué)家努普（Franz Knoop）。早在1904年他就用苯環(huán)標(biāo)記脂肪分子對(duì)脂肪代謝進(jìn)行研究，得出了在體內(nèi)脂肪代謝過(guò)程中脂肪分子每次斷裂下兩個(gè)碳原子的結(jié)論。這個(gè)結(jié)果被40年后的進(jìn)一步研究所證實(shí)。1913年德國(guó)化學(xué)家帕內(nèi)斯（Fridrich Adolf Paneth）等人想到可以用放射性同位素標(biāo)記生物大分子來(lái)研究大分子在細(xì)胞中的活動(dòng)和代

49、謝情況。這樣就有了放射自顯影技術(shù)（radioautograpgy）。 放射自顯影技術(shù)是利用放射性同位素的電離輻射對(duì)含有AgBr乳膠的感光作用來(lái)研究生物大分子在細(xì)胞內(nèi)代謝過(guò)程的一種技術(shù)。開始，帕內(nèi)斯等曾用放射性鉛作為標(biāo)記，然而鉛的同位素極容易打亂活細(xì)胞正常的代謝過(guò)程。后來(lái)逐漸摸索到了一些常用的同位素（表 ）。這些同位素都是細(xì)胞生命活動(dòng)中基本的起重要作用的元素。放射性同位素技術(shù)所以能被應(yīng)用是由于存在兩個(gè)基本條件，一是放射性同位素不影響機(jī)體的正常代謝。二是機(jī)體細(xì)胞對(duì)某種元素及其不穩(wěn)定同位素“一視同仁”。該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得細(xì)胞生物學(xué)取得了很大的進(jìn)展.例如象檸檬酸循環(huán)，尿素循環(huán)過(guò)程的發(fā)現(xiàn)；首次證明核仁是

50、合成RNA的場(chǎng)所；DNA半保留復(fù)制的證明等都是應(yīng)用這項(xiàng)技術(shù)得到的成果。 制造帶有放射性同位素的小分子并不復(fù)雜，只要把普通化合物放在核反應(yīng)堆里用中子轟擊，取出后就帶有放射性同位素了。如今用于標(biāo)記的幾乎所有小分子前體都可以通過(guò)商品銷售得到。因此現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用已十分廣泛。這種方法的基本過(guò)程是，先使細(xì)胞含有示蹤原子（例如H,C,P或其他）的化合物，然后把這種組織細(xì)胞做成切片，使液體乳膠涂于其上，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的暴光（即放射性物質(zhì)放出的射線落在乳膠上使其溴化銀還原而析出金屬銀，這個(gè)過(guò)程稱為自顯過(guò)程，亦稱曝光），再進(jìn)行顯影和定影。根據(jù)乳膠上出現(xiàn)的銀粒在細(xì)胞中的位置，便可判斷放射性物質(zhì)（或由這種放射性物質(zhì)

51、以及其他物質(zhì)合成的化合物）在細(xì)胞內(nèi)的分布.這種方法的基本過(guò)程是,先使細(xì)胞含有示蹤原子的化合物，然后把這種組織細(xì)胞制成切片，使液體乳膠涂與其上，經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間暴光(即放射性物質(zhì)放出的射線落在乳膠上使其溴化銀還原而析出金屬銀,這個(gè)過(guò)程稱為自選過(guò)程，亦稱暴光),在進(jìn)行顯影和定影手續(xù)。根據(jù)乳膠上出顯的銀粒在細(xì)胞中的位置，便可判斷放射性的物質(zhì)（或由這種放射性物質(zhì)以及它物質(zhì)合成的化合物）在細(xì)胞內(nèi)的分布. 自顯過(guò)程的具體操作步驟是：(1)將染色或未染色的切片標(biāo)本先覆蓋一層明膠保護(hù)膜;(2)在暗室將凝膠壯液體加熱融化，然后將盛乳膠的小杯放入40攝氏度的水浴鍋中，再將切片浸入乳膠內(nèi)片刻；(4)取出載片，立于染色

52、缸內(nèi)自干,或揩去載片被面的乳膠，平放在溫臺(tái)內(nèi)烘干;(5)將干燥的乳膠片放入暴光暗匣內(nèi),再4-10攝氏度低溫下暴光;(6)顯影 定影后，再用常規(guī)方法制片,最后用樹膠封藏. 制備電子顯微鏡的放射自顯影標(biāo)本的程序是把用H等放射性同位素標(biāo)記的化合物引入組織細(xì)胞,制成超薄切片,放在有支持膜(火棉膠加碳)的載網(wǎng)上，噴碳膜后再涂一薄層核乳膠。然后放在暗處暴光（暴光時(shí)間的長(zhǎng)短視條件而不同,例如溫度,切片中放射性物質(zhì)的量和半衰期等，常要靠實(shí)踐來(lái)確定,一般要幾周乃至數(shù)月的時(shí)間）,暴光后進(jìn)行顯影 定影和沖洗.再經(jīng)電子染色制成的標(biāo)本即可在電鏡下觀察(圖 )。 放射自顯影術(shù)不但在定位研究上有靈敏度高，定位精確的特點(diǎn)，它

53、還是動(dòng)態(tài)研究中最有效的手段。針對(duì)活細(xì)胞一般都采用放射自顯影的追蹤標(biāo)記也稱脈沖標(biāo)記(pulsechase)的方法。這種方法是先用帶同位素標(biāo)記的前體分子摻入到生活細(xì)胞的代謝中去，標(biāo)記一段時(shí)間后便把它徹底洗掉，再用不帶標(biāo)記的前體分子代替。然后在不同時(shí)間取樣并分析同位素的量和它所在的位置，從而了解它們的代謝途徑。許多生物大分子在細(xì)胞中的合成、修飾、排出、蓄積、更新等作用的機(jī)制和部位的研究結(jié)果都是利用脈沖標(biāo)記的方法得到的.第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)和單克隆抗體技術(shù)一 細(xì)胞培養(yǎng)在細(xì)胞生物學(xué)及其它有關(guān)細(xì)胞的研究中，如何取得充足的高質(zhì)量的細(xì)胞始終是一個(gè)需要解決的基本問(wèn)題。特別是高等動(dòng)物或人的細(xì)胞.從生物個(gè)體上取細(xì)胞不但

54、費(fèi)用貴而且不方便。解決這 一問(wèn)題的有效方法就是體外培養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)際上人們?cè)缇烷_始了細(xì)胞的體外培養(yǎng)工作。1885年，德國(guó)學(xué)者Roux發(fā)現(xiàn)雞脛細(xì)胞可在溫?zé)岬纳睇}水中存活一段時(shí)間，他稱這項(xiàng)試驗(yàn)為 “explanation” ，即體外種植的意思。1907年美國(guó)動(dòng)物學(xué)家Harrison從兩棲類胚胎中取下一塊神經(jīng)管組織，放在一滴淋巴液中作懸滴培養(yǎng)，他觀察到了神經(jīng)管分化或神經(jīng)元，并且向培養(yǎng)液中伸出了軸突。這些可以說(shuō)是細(xì)胞培養(yǎng)的開拓性工作。從這些工作可以看出細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)是指將細(xì)胞從機(jī)體中分離出來(lái)，進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)。近年來(lái)，這項(xiàng)技術(shù)得到了很大的發(fā)展，許多動(dòng)植物細(xì)胞都可以在人工配制的特定

55、的培養(yǎng)基中存活，有的培養(yǎng)細(xì)胞還可以分裂增殖甚至分化。目前細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已在細(xì)胞生物學(xué)，分子生物學(xué)，遺傳學(xué)，免疫學(xué)等許多領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。1 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)人們?cè)谘芯考?xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，雖然動(dòng)物細(xì)胞的種類繁多，性質(zhì)各異，但它們?cè)隗w外培養(yǎng)的生長(zhǎng)方式上大致可分為二種類型.一類是貼壁依賴性細(xì)胞，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬這一類型.另一類型是非貼壁依賴性細(xì)胞，比如來(lái)源于血液，淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞屬于這一類型。 (1)貼壁培養(yǎng)剛接種的細(xì)胞常成圓形并游離于培養(yǎng)液中，經(jīng)數(shù)十分鐘到數(shù)小時(shí)后細(xì)胞從游離期進(jìn)入貼附期，細(xì)胞伸展并貼附于瓶壁。這叫細(xì)胞貼壁。圓形細(xì)胞一經(jīng)貼壁就立刻鋪展成多種形態(tài)并開始有絲分裂，細(xì)胞在分

56、裂過(guò)程中并沒有停止移動(dòng)，由于細(xì)胞數(shù)目不斷增多，細(xì)胞間的距離也越來(lái)越小了。平展生長(zhǎng)數(shù)天后就會(huì)形成致密的細(xì)胞單層.這時(shí)細(xì)胞彼此之間已經(jīng)接觸，這使細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)受到抑制，這種現(xiàn)象叫接觸抑制(Contact inhibition)。然而接觸抑制實(shí)際上只抑制了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)而并沒有抑制細(xì)胞的分裂。所以我們看到細(xì)胞長(zhǎng)滿生存平面后仍能繼續(xù)分裂，直到細(xì)胞達(dá)到一定密度，才停止分裂。這后一種抑制叫密度抑制（Density inhibition）。這時(shí)如果要細(xì)胞繼續(xù)分裂增殖就要進(jìn)行及時(shí)的分散，分瓶接種于新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。這一過(guò)程叫傳代培養(yǎng)（Subculture）。這種直接從有機(jī)體取出的細(xì)胞培養(yǎng)至第一次傳代為止，稱原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳到10代左右，大部份細(xì)胞才會(huì)進(jìn)入退化期，出現(xiàn)細(xì)胞的大量死亡。有人據(jù)此而把培養(yǎng)10代以前的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)10代培養(yǎng)的細(xì)胞仍有極少數(shù)存活下來(lái)，這些細(xì)胞往往會(huì)繼續(xù)順利傳代4050次。雖然這些細(xì)胞的形態(tài)有了很大的變化，但它們?nèi)员３种旧w的2倍體數(shù)量和接觸抑制的行為。多數(shù)學(xué)者把這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞株（Cell strain）。經(jīng)過(guò)50次左右傳代的細(xì)胞，已不能