體內(nèi)小鼠試驗(yàn)方案

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告抗腫瘤藥物體內(nèi)活性研究一、實(shí)驗(yàn)原理聚合物膠束的粒徑約為0-200 nm,可以利用月中瘤組織的增強(qiáng)滲透保存效應(yīng)(EPR),選擇性地透過月中瘤血管并積累在月中瘤組織，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向；被特定官能 團(tuán)修飾的聚合物膠束那么能響應(yīng)部位的物理化學(xué)變化，實(shí)現(xiàn)靶向部位的載體聚集和藥物定點(diǎn)釋放。抗月中瘤藥物的反復(fù)使用容易導(dǎo)致月中瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性(MDR),月中瘤細(xì)胞對(duì)一種抗月中瘤藥物產(chǎn)生耐藥性后，對(duì)結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制不同的其 它抗月中瘤藥產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象極大的限制了化療藥物的療效。納米藥物傳遞系統(tǒng)如脂質(zhì)體、膠束、納米粒等作為MDR逆轉(zhuǎn)策略越來越引起關(guān)注。膠束能通過EPR效應(yīng)使藥物選擇性地在月中瘤部位累積和

2、釋放， 增加細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，緩控釋 藥物，并通過靶向細(xì)胞上特異受體對(duì)應(yīng)的配體修飾，到達(dá)主動(dòng)靶向，從而逆轉(zhuǎn)月中瘤細(xì)胞耐藥。鹽酸阿霉素(DOX HCl),屬于慈環(huán)類抗生素，能夠抑制癌細(xì)胞遺傳物質(zhì)核 酸的合成，具有廣譜的惡性月中瘤的治療效果，廣泛用于宮頸癌細(xì)胞、卵巢癌、乳 腺癌、惡性淋巴瘤、肺癌、肝癌等的治療。然而，阿霉素的急性和慢性毒副作用 限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，急性毒副作用包括惡心、嘔吐、骨髓抑制和心率 失常;慢性毒性表現(xiàn)為肝臟、大腦和腎臟的損傷，對(duì)心臟具有不可逆的劑量依賴 性的損傷。用聚合物構(gòu)建新型藥物膠束傳遞系統(tǒng)，提高對(duì)疏水性藥物的包載能力 和藥物穩(wěn)定性；通過小分子修飾實(shí)現(xiàn)被動(dòng)和主動(dòng)靶

3、向。此外，通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)考察作 為藥物載體的聚合物膠束的耐藥能力，以此來證明聚合物膠束的生物平安性好、穩(wěn)定性高、載藥量高、響應(yīng)性強(qiáng)、靶向性準(zhǔn)、緩控釋性能好。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.運(yùn)用抗月中瘤藥物在小鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)方法，篩選出具有高表達(dá)、特異性、高親和力 的主動(dòng)/被動(dòng)靶向、無細(xì)胞毒性、抗月中瘤效果好的聚合物膠束。2.動(dòng)物體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)基于活體成像技術(shù)，建立藥物抗月中瘤效果活體動(dòng)物影響研究方法。三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 1.動(dòng)物模型將狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，用培養(yǎng)液稀釋至1X 106cells/mL細(xì)胞密度，吹勻后 于每只小鼠參加細(xì)胞懸液100人，培養(yǎng)。受試溶液每孔參加100 pL,每個(gè)濃度3-5個(gè)平行孔，每組10-15只裸

4、鼠；對(duì)照組，即不加待測藥液，單一補(bǔ)加100小 生理鹽水，培養(yǎng)02 2.體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)給藥后觀察裸鼠體內(nèi)月中瘤體積變化情況。3 3.近紅外成像的研究裸鼠在給藥2和12天后處死，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、月中 瘤組織，置于近紅外成像系統(tǒng)觀察。四、實(shí)驗(yàn)方案1 1.動(dòng)物模型的建立通過MTT實(shí)驗(yàn)選取生物活性好、穩(wěn)定性高、載藥量高的聚合物納米顆粒NPs,為了考察不同給藥劑量的DOX-NPs阿霉素負(fù)載聚合物納米顆粒和DOX HCl溶液的抗月中瘤效果，選取HeLa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞擴(kuò)增至一定數(shù) 量，且生長狀態(tài)良好，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%胰酶消化2 min, 1000rpm離 心5min,棄去

5、上清液，用新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，配制成1X106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。然后用注射器吸取細(xì)胞懸液，排空氣泡，注射于體重在520-22g左右的BALB/C雌性裸鼠左腋皮下組織中，每只接種100 L,約含1M0個(gè)細(xì)胞，大約共接種120只。觀察裸鼠月中瘤生長情況，并定期稱裸鼠體重，測量 月中瘤大小。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物正常飲食喝水。2 2.給藥及抑制月中瘤效果評(píng)價(jià)當(dāng)月中瘤體積長到100150 mm3時(shí)， 將裸鼠隨機(jī)分成4組， 每組10只裸鼠n=4 ,分別為陰性對(duì)照組生理鹽水組,DOX - HCl, NPs和DOX-NPs。陰性 對(duì)照組通過尾靜脈注射100山對(duì)照生理鹽水。DOX HCl, N

6、Ps和DOX-NPs組 分別通過小鼠尾靜脈注射100人的用無菌生理鹽水配制的DOX HCl。并記為 第一天。給藥劑量分別為：5 mg/kg、10 mg/kg、15 mg/kg。隔天給藥一次，給 藥后小鼠正常飼養(yǎng)，每天觀察小鼠的生存狀況，每兩天記錄一次小鼠體重，并用 游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，根據(jù)公式計(jì)算月中瘤體積 V和相對(duì)月中瘤體積Relative tumor volume, RTV,繪制時(shí)間-小鼠相對(duì)體重和時(shí)間-小鼠相對(duì)月中瘤 體積變化曲線。給藥后第12天處死小鼠，摘取皮下月中瘤并稱重。月中瘤體積：V=axb2/2 a為月中瘤的最長徑，b為月中瘤的最短徑公式1相對(duì)月中瘤體積：RTV =

7、Va/VoVa為每日月中瘤體積，V0為起始月中瘤體積 公式2按照以下公式：計(jì)算各給藥組的抑瘤率：Tumor inhibiton ratio % = 1 Vtest/Vcontroi x 100%公式3其中，Vtest為第12天時(shí)給藥組的相對(duì)月中瘤體積，Vcontrol為第12天時(shí)生理鹽水組 的相對(duì)月中瘤體積。3 3.藥物體內(nèi)臟器分布實(shí)驗(yàn)由于DOX HCl自身具有紅色熒光，故可通過近紅外成像儀觀察藥物在裸 鼠體內(nèi)各臟器的分布情況。在尾靜脈注射5mg/kg生理鹽水、游離DOX HCl、NPs和DOX-NPs組生理鹽水溶液后，于第2、12天處死裸鼠，取血液、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟以及腫瘤置于在體

8、近紅外成像系統(tǒng)觀察，分析給藥后阿霉素在各 器官組織的分布情況，4 4.組織切片分析通過腫瘤以及心臟組織切片可以判斷不同制劑對(duì)月中瘤的抑制作用以及阿霉素對(duì)心臟的損傷情況。在尾靜脈注射生理鹽水、5mg/kg游離DOX - HCl、NPs和DOX-NPs組生理鹽水溶液后，在預(yù)設(shè)時(shí)間處死給藥后的裸鼠，剖取心臟以及月中 瘤組織，通過10%多聚甲醛對(duì)組織進(jìn)行固定12小時(shí)以上。依次經(jīng)過50%酒精、70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精兩次進(jìn)行脫水處理每級(jí)35-45分鐘。100%酒精與二甲苯1:1透明處理30-40分鐘，再移入二甲苯中15-20分鐘。將透明后的組織塊置于剛過溶點(diǎn)的融化石蠟中浸漬，取代組織中含有的透明劑，將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯?，組織即被包埋在其中。修整蠟塊，并進(jìn)行切片。經(jīng)過蘇木精-伊紅染色HE染色