DNA同源重組機(jī)制的確立

1、Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCEdoi:10.3969/j.issn.0253-9608.2015.04.007DNA同源重組機(jī)制的確立向義和?清華大學(xué)物理系，北京100084摘要 介紹了 DN洞源重組機(jī)制確立的過(guò)程。其主要內(nèi)容包括基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，交叉假設(shè)的提岀，斷裂重接假設(shè)和復(fù)制選擇假設(shè)的出現(xiàn)，同源重組的三個(gè)模型(Holliday模型、單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型)的確立。關(guān)鍵詞 連鎖基因；同源重組；交叉假設(shè)；Holliday模型；單鏈斷裂模型；雙鏈斷裂模型#Chinese Journa

2、l of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCEDNA重組(recombination)是指發(fā)生在DNA分 子內(nèi)部或DNA分子之間核苷酸序列的交換、重 排和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，是已有遺傳物質(zhì)的重新組合過(guò) 程。同源重組(homologous recomb in ati on)是在兩 個(gè)DNA分子的同源序列之間直接進(jìn)行交換的一 種重組形式。進(jìn)行交換的同源序列可能是完全相 同的，也可能是非常相近的。同源生物體通過(guò)重 組可以產(chǎn)生

3、新的基因或等位基因的組合，還可以 提高種群內(nèi)遺傳物質(zhì)的多樣性，而人們可使用同 源重組進(jìn)行遺傳作圖。本文介紹了 DNA同源重組機(jī)制確立的過(guò) 程。20世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)了基因連鎖和重組現(xiàn)象，在探 討重組現(xiàn)象出現(xiàn)的原因時(shí)又提出了交叉假設(shè)，形 成了交換概念。20世紀(jì)30年代中期在探討基因交 換的機(jī)制時(shí)，出現(xiàn)了染色體交換的兩種假設(shè)：斷 裂重接假設(shè)和復(fù)制選擇假設(shè)。1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)后，科學(xué)家開(kāi)始在分子水平上探討同 源重組的機(jī)制。20世紀(jì)60 80年代，科學(xué)家分 別提出了 DNA同源重組的三種模型：Holliday模型，單鏈斷裂模型和雙鏈斷裂模型。1 基因連鎖和重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1.1 連鎖現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)190

4、5年，英國(guó)生物學(xué)家貝特森 (Bateson W.,1851 1926)和龐尼特(Punnet R. C.)研究香豌豆 兩對(duì)性狀的遺傳。他們選擇的一對(duì)性狀是花的顏 色，有紫色和紅色兩種；另一對(duì)是花粉粒的形 狀，有長(zhǎng)形和圓形兩種。將紫花長(zhǎng)花粉粒和紅花 圓花粉粒的植株作親本進(jìn)行雜交，結(jié)果F1代都是紫花長(zhǎng)花粉粒，可見(jiàn)紫花對(duì)紅花是顯性，長(zhǎng)花 粉粒對(duì)圓花粉粒是顯性。將 F1代自交得到的F2代 有紫長(zhǎng)、紫圓、紅長(zhǎng)、紅圓4種表型。這4種表型 的比率不符合孟德?tīng)柕膬蓪?duì)遺傳因子的分離比 9: 3 : 3 ： 1，其中紫長(zhǎng)和紅圓的表型的比率遠(yuǎn)遠(yuǎn) 超出9/16和1/16，而相應(yīng)的紫圓和紅長(zhǎng)的表型卻 大大少于3/16(

5、表1)。表1香豌豆紫長(zhǎng)x紅圓雜交試驗(yàn)F2紫長(zhǎng)紫圓紅長(zhǎng)紅圓總數(shù)實(shí)得數(shù)4 8313903931 3386 952預(yù)計(jì)數(shù)3 910.51 303.51 303.5434.56 952?通信作者，E-mail: xiangyhts將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與由孟德?tīng)栕杂山M合定律所預(yù) 期結(jié)果相比較，F(xiàn)2代中性狀的親本組合類型遠(yuǎn)遠(yuǎn) 多于重組組合的類型。這等于說(shuō)，兩對(duì)基因在雜 交子代中的組合并不是隨機(jī)的，在 F1雜種形成配 子時(shí)，原來(lái)屬于同一親本的兩個(gè)基因更傾向于進(jìn) 入同一配子中，有更多保持親本原來(lái)組合的傾 向，而且這種傾向與顯隱性無(wú)關(guān)。這是在自由組 合定律方面第一次出現(xiàn)的顯著的例外，無(wú)疑，這是一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)。1.2 重組

6、現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1910年，美國(guó)遺傳學(xué)家摩爾根(Morgan T. H., 1866 1945)和他的學(xué)生布里吉斯 (Bridges C. B., 1889 1938)用果蠅進(jìn)行了大量的雜交試驗(yàn)，研 究了兩對(duì)基因的遺傳，發(fā)現(xiàn)了完全連鎖、不完全 連鎖和重組現(xiàn)象。在黑腹果蠅中，灰體(B)對(duì)黑體(b)是顯 性，長(zhǎng)翅(V)對(duì)殘翅(v)為顯性，這兩對(duì)基因 在常染色體上。他們將灰體長(zhǎng)翅(BBVV)和黑體殘翅(bbvv)的果蠅雜交，F(xiàn),代都是灰體長(zhǎng)翅 (BbVv)。用F1的雜合體進(jìn)行下列兩種方式的 測(cè)交，所得到的結(jié)果卻完全不同。取F!雄蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雌蠅測(cè)交。按 兩對(duì)基因的自由組合定律來(lái)預(yù)

7、測(cè)，應(yīng)產(chǎn)生灰 體長(zhǎng)翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長(zhǎng)翅 (bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型的后代，且比 率為1 ： 1 ： 1 ： 1。可是實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并非如此， 而是只有數(shù)目相同的灰體長(zhǎng)翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型。如果用F,雌蠅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)的雄蠅測(cè)交，后代中就出現(xiàn)了 灰體長(zhǎng)翅(BbVv)、灰體殘翅(Bbvv)、黑體長(zhǎng)翅 (bbVv)、黑體殘翅(bbvv)4種表型，但比率是 0.42 : 0.08 : 0.08 : 0.42。摩爾根的解釋是：假定基因B和V同處于一條染色體上，基因b和v同處于同源染色體的另一 條染色體上。他將這種處于同一條

8、染色體上的 基因遺傳時(shí)較多地聯(lián)系在一起的現(xiàn)象稱為連鎖 (linkage)。對(duì)于上述第一種測(cè)交結(jié)果摩爾根稱為 完全連鎖(complete linkage)(圖 1)。由于尸!雜合雄蠅(BbVv)完全連鎖，即在同 一染色體上的連鎖基因(如B、V基因或b、v基因)100%聯(lián)系在一起傳遞到下一代。因此只產(chǎn)生 數(shù)目相等的兩種配子 BV和bv，所以和黑體殘翅 (bbvv)的雌蠅測(cè)交時(shí)，后代只能有數(shù)目相等的灰 體長(zhǎng)翅(BbVv)和黑體殘翅(bbvv)兩種類型(圖1)。第2種方式的測(cè)交，后代出現(xiàn)數(shù)目不等的4種表型，其中親本的類型遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于新類型。摩爾 根稱這種連鎖為不完全連鎖(in complete lin k

9、age)(圖2)。不完全連鎖是指位于同一染色體上的2個(gè)或2個(gè)以上的等位基因，不總是作為一個(gè)整體傳 遞到子代。It(tt)圖1果蠅的完全連鎖新類型是由于同源染色體上的不同對(duì)等 位基因之間重新組合的結(jié)果，這種現(xiàn)象稱為重 組(recombi natio n)。在本項(xiàng)測(cè)交實(shí)驗(yàn)中，出現(xiàn) 的新類型共占16%，該數(shù)值表示基因Bb和Vv之間的重組值(recombination value) 或重組頻率 (recombination frequency, RF)。重組值用百分?jǐn)?shù) 表示，其計(jì)算公式如下：重組值(RF)=重組型數(shù)目/(親組型數(shù)目+重 組型數(shù)目)重組值從050%變化。重組值的大小反映 了個(gè)體在側(cè)交中同

10、一條染色體上的基因的連鎖 程度。重組值小，親組型基因的連鎖程度大， 當(dāng)重組值是0時(shí)，為完全連鎖；重組值大，親組 型基因的連鎖程度小，當(dāng)重組值達(dá)到50%，則4種配子成1 : 1 : 1 ： 1的比例，也就是自由組合 了。大量的實(shí)驗(yàn)資料表明，連鎖現(xiàn)象在生物界 普遍存在。凡是位于同一條染色體上的基因群， 均稱為一個(gè)連鎖群(linkage group)。摩爾根等在 1914年已發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅有4個(gè)連鎖群，到1967年，在果蠅中至少測(cè)定了將近1 000個(gè)基因分別屬于這4個(gè)連鎖群。在遺傳學(xué)上，凡是充分研究 過(guò)的生物中，連鎖群的數(shù)目都應(yīng)該等于單倍體染 色體數(shù)(n)。289第37卷第4期自然科學(xué)史#第37卷第4

11、期自然科學(xué)史貳仝2后代b -B _El _42%b-b -黑體殘翅#第37卷第4期自然科學(xué)史42%42c-n圖2果蠅的不完全連鎖#第37卷第4期自然科學(xué)史#第37卷第4期自然科學(xué)史2 交叉假設(shè)的提出和交換概念的證實(shí)2.1 交叉假設(shè)的提出在同一染色體上相互連鎖的基因?yàn)槭裁磿?huì)出 現(xiàn)一定頻率的重組？換言之，在兩對(duì)基因連鎖遺 傳時(shí)，形成親代所沒(méi)有的新組合的機(jī)制是什么？在摩爾根等確立遺傳的染色體學(xué)說(shuō)之前， 1909年比利時(shí)的細(xì)胞學(xué)家詹森斯 (Ja nsse ns F. A.) 在研究?jī)蓷惡椭背崮坷ハx(chóng)的減數(shù)分裂時(shí)， 觀察到二價(jià)體(相互配對(duì)的兩條同源染色體， bivale nt)的交叉，提出交叉型假設(shè)(c

12、hiasmatypehypothesis)，這是最早的重組理論。他認(rèn)為每次 交叉都表明父、母本的一條染色單體接觸、斷裂 和重接，形成一個(gè)新的組合，其他兩條染色單體 仍保持完整狀態(tài)。因此每個(gè)交叉是重組行為可見(jiàn) 的表現(xiàn)形式，其要點(diǎn)是：生物在形成配子的過(guò) 程中，都要經(jīng)減數(shù)分裂，在第一次減數(shù)分裂前 期，兩個(gè)同源染色體配對(duì)，形成4條染色單體。配對(duì)中的同源染色體不是簡(jiǎn)單地平行靠攏，而是 在非姊妹染色單體間的某些點(diǎn)上出現(xiàn)交叉纏結(jié) 的圖像，每一個(gè)點(diǎn)上這樣的圖像稱為一個(gè)交叉 (chiasma)，這是同源染色體間對(duì)應(yīng)片段發(fā)生過(guò)交 換(crossing-over)的地方(圖3)。處于同源染色 體的不同座位的相互連鎖

13、的兩個(gè)基因之間如果發(fā) 生了交換，就導(dǎo)致這兩個(gè)連鎖基因的重組。著絲粒圖3配對(duì)的同源染色體有兩個(gè)交叉，交叉結(jié)處表示非姊妹 染色單體間發(fā)生過(guò)交換這個(gè)學(xué)說(shuō)的核心是：交叉是交換的結(jié)果， 而不是交換的原因。也就是說(shuō)，遺傳學(xué)上的交換 發(fā)生在細(xì)胞學(xué)上的交叉出現(xiàn)之前。由圖3可見(jiàn)，交換曾發(fā)生在非姊妹染色單體 2和 3及2和4之間。如果交換發(fā)生在兩個(gè)特定的所 研究的基因之間，則出現(xiàn)染色體內(nèi)重組，形成 交換的產(chǎn)物。否則，交換發(fā)生在所研究的基因之外，則得不到特定基因的染色體內(nèi)重組的產(chǎn)物。一般情況下，染色體愈長(zhǎng)，顯微鏡下可以 觀察到的交叉數(shù)愈多。一個(gè)交叉就代表一次交 換。一般是兩個(gè)基因在染色體上的距離越遠(yuǎn)，其 互換的比率

14、越大；距離越近，互換率越小，同源重組要求兩個(gè) DNA分子的序列同源， 同源區(qū)域越長(zhǎng)越有利，同源區(qū)太短，越難發(fā)生重 組。大腸桿菌染色體重組，至少要求有2040bp是相同的。因此，交換值 (crossing-over value)的大小就 可以用來(lái)表示基因間距離的長(zhǎng)短。交換值無(wú)法直 接測(cè)定，而只有通過(guò)基因之間的重組頻率來(lái)估計(jì) 所發(fā)生交換的頻率。既然連鎖基因的交換率(即重組頻率)可以代表基因在同一染色體上的相對(duì) 距離，那么人們就有可能根據(jù)基因的重組頻率來(lái) 確定它們?cè)谌旧w上的相對(duì)位置?；蚨ㄎ?gene mapping)即根據(jù)重組值確定 不同基因在染色體上的相對(duì)位置和排列順序。遺 傳圖(geneti

15、c map)或染色體圖 (chromosome map) 也是依據(jù)基因之間的重組值(或交換值)，確定連鎖基因在染色體上的相對(duì)位置而繪制的一種 簡(jiǎn)單線性示意圖。兩個(gè)基因在染色體圖上距離 的數(shù)量單位稱為圖距(map distanee)。1%重組值 去掉其百分率的數(shù)值定義為一個(gè)圖距單位 (map unit, mu)。后人為了紀(jì)念現(xiàn)代遺傳學(xué)的奠基人 摩爾根，將圖距單位稱為 "厘摩”(centimorgan, cM) , 1 cM=1%重組值去掉%的數(shù)值。連鎖和交換這一對(duì)名詞在遺傳學(xué)上被延用下 來(lái)。1912年摩爾根提出連鎖互換定律，其基本內(nèi)容 是：處在同一染色體上的兩個(gè)或兩個(gè)以上基因遺傳 時(shí)，

16、聯(lián)合在一起的頻率大于重新組合的頻率。重組 型的產(chǎn)生是由于配子形成過(guò)程中，同源染色體的非 姊妹染色單體間發(fā)生了局部交換的結(jié)果。2.2 交叉假設(shè)的證實(shí)交叉理論雖然得到遺傳學(xué)家的支持，卻遭 到細(xì)胞學(xué)家的反對(duì)，因?yàn)檎也怀隼碚撝杏嘘P(guān)斷裂 和重接的任何證據(jù)。從顯微鏡照片上來(lái)看確實(shí)很 難想象存在斷裂和融合的現(xiàn)象。直到1928年，貝林(Belling)提出交換發(fā)生在減數(shù)分裂較早時(shí)期，此時(shí)同源染色體精密相連，因此在雙線期觀察到 的交叉并不表明交換的過(guò)程，而是交換的直接結(jié) 果，這一解釋結(jié)束了近十年的爭(zhēng)論。但有一個(gè)問(wèn) 題仍使人們感到困惑，那就是交叉點(diǎn)是在變化 的，在接近細(xì)胞分裂中期1時(shí)明顯減少了，而交換一旦發(fā)生數(shù)目

17、應(yīng)是固定的，因此科學(xué)家仍然懷 疑交叉學(xué)說(shuō)。1931年，英國(guó)的植物細(xì)胞學(xué)家達(dá)林 頓(Darlington C. D.)發(fā)現(xiàn)，交叉數(shù)目減少是交叉 端化的結(jié)果，此時(shí)才排除了異議2。1978年蒂斯(Tease C.)和瓊斯(Jones C. H.)采 用姊妹染色單體差別染色(SCD)來(lái)直接檢驗(yàn)交叉 和重組的關(guān)系。SCD法可將姊妹染色單體一條染 上顏色呈現(xiàn)深紫色，顯示為暗的；另一染不上 色，顯示為明的。他們用 SCD法來(lái)處理蝗蟲(chóng)細(xì)胞 減數(shù)分裂的染色體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)明暗轉(zhuǎn)換發(fā)生在交 叉處(圖4)。這就澄清了前面留下的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn) 表明交叉正是發(fā)生交換的位點(diǎn)。交叉(c)(a)(b)圖4在減數(shù)分裂中非姊妹染色單體深

18、色鏈和淺色鏈之間發(fā)生交換：(a)表明交叉；(b)當(dāng)著絲粒附著到紡錘絲上拉 向兩極時(shí)，形成中央帶有交叉的十字形結(jié)構(gòu)；(c)十字形結(jié)構(gòu)的照片摩爾根在1926年的言論中提到線性排列的 基因通過(guò)“互換”而重新組合的概念，這種“交換”的真實(shí)存在性直到1931年才被芭芭拉？麥克 林托克(McClintock B.)在玉米中以及柯特？斯特恩 (Stern C.)在果蠅中證實(shí)。3 染色體交換模型在20世紀(jì)30年代中期出現(xiàn)了染色體交換的兩 種假設(shè)：復(fù)制選擇模型和斷裂重接模型。按照復(fù)制 選擇模型，兩個(gè)染色單體作為復(fù)制的模板進(jìn)行復(fù)制，在復(fù)制過(guò)程中相互交換模板，從而造成交換。 按照斷裂重接模型，兩個(gè)染色單體在同一位置

19、上斷 裂，然后彼此和另一染色單體重新連接起來(lái)。3.1 斷裂重接模型同源重組涉及參與重組的雙方 DNA分子的斷 裂與重接。人們已從細(xì)胞水平上證明在減數(shù)分裂前 期，同源染色體配對(duì)，兩條非姊妹染色單體之間發(fā) 生斷裂、重接和交叉。1937年，達(dá)林頓仔細(xì)地觀察 研究了減數(shù)分裂的過(guò)程，提出重組的斷裂和重接的 模型。他認(rèn)為在減數(shù)分裂中一對(duì)同源染色體相互分 離就像將繩子的兩股分開(kāi)一樣，會(huì)產(chǎn)生扭曲，為了 消除張力，只有當(dāng)兩姊妹染色單體在對(duì)應(yīng)點(diǎn)發(fā)生斷 裂才能使張力達(dá)到平衡，然后非姊妹染色單體的“斷頭”相互重接，產(chǎn)生了重組。根據(jù)這個(gè)模型重 組應(yīng)發(fā)生在四線期，因重組是一個(gè)相互的過(guò)程，所 以重組的產(chǎn)物也應(yīng)當(dāng)是對(duì)稱的。染

20、色體斷裂并發(fā)生再連接的最有力的證據(jù) 是來(lái)自于哈佛大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室的分子生物學(xué)家梅 塞爾森(Meselson M.)和韋格勒(Weigle J.)所做的 實(shí)驗(yàn)。1961年，他們用兩個(gè)品系的入噬菌體同時(shí) 感染大腸桿菌(E. coli )。一個(gè)品系入噬菌體在染 色體一端具有標(biāo)記基因 c和mi,這個(gè)品系用同位 素13c和15n進(jìn)行標(biāo)記，因而形成“重”鏈。另一個(gè)品系的相應(yīng)座位帶有 c卡和mi +標(biāo)記基因，并以 12C和14N作為標(biāo)記，因而具有“輕”的DNA鏈。兩種噬菌體混合感染大腸桿菌細(xì)胞后，培養(yǎng)在正 常的培養(yǎng)基中，直到裂解。后代噬菌體從裂解細(xì) 胞中釋放出來(lái)，收集后進(jìn)行子代噬菌體DNA的氯化銫密度梯度離心

21、，結(jié)果獲得了很寬的噬菌體 帶。在一系列的條帶中，既有重鏈和輕鏈兩個(gè)親 本類型的染色體，也有一系列重鏈與輕鏈發(fā)生斷 裂重新接合的中間類型。從遺傳標(biāo)記方面也證 明了不僅具有c mi和c+ mi卡親本組合，同時(shí)也有 c mi +和c+ mi新組合(圖5)。由此表明，重組的發(fā) 生必定是通過(guò)DNA的物理斷裂與再接合而實(shí)現(xiàn) 的。3.2 模板選擇模型模板選擇模型是由貝林首先提出的，但1933wiC+(c)圖5 l噬菌體的染色體斷裂與重接的證據(jù)：(a)兩個(gè)品系的入噬菌體(c mi, + )感染大腸桿菌；(b)氯化銫密度梯度離心顯示輕鏈親本(上層)、中間類型(中)和重鏈親本(下)三種條帶；(c)兩個(gè)標(biāo)記(c m

22、i)間的交換所產(chǎn)生的重 組(c,+ )后代，進(jìn)一步證明了 DNA的斷裂與重接年他又撤回了這一假設(shè)。1 948年，赫爾希 (Hershey A. D., 1908 1997)發(fā)現(xiàn)在噬菌體的雜交 中產(chǎn)生的重組子有時(shí)是非對(duì)稱的。為了解釋這個(gè)現(xiàn)象，他接受了斯特蒂文特 (Sturteva nt A. H.)的建議，提出了在噬菌體中重組可能不是遺傳結(jié)構(gòu) 的斷裂和重接，而是復(fù)制時(shí)改變了模板所致，即 兩條染色單體作為復(fù)制的模板，新的染色單體各 以一個(gè)單體模板進(jìn)行復(fù)制，在復(fù)制過(guò)程中相應(yīng)交 換模板，從而造成重組(圖6)2。、.<rs. f.柄(空(a)斷裂重接模型(b)選擇復(fù)制模型圖6斷裂重接模型和選擇復(fù)制

23、模型的比較模板選擇模型能夠很好地解釋基因轉(zhuǎn)變的 現(xiàn)象，因此在20世紀(jì)50年代興盛起來(lái)。1964年， Holliday模型的提出者霍利德 （Holliday R.）在 真菌中基因轉(zhuǎn)換的機(jī)制一文中對(duì)模板選擇模 型受到支持提出了緣由。他寫(xiě)道：“模板選擇假設(shè)的好處是它做出了幾個(gè)十分特別的預(yù)測(cè)：基 因物質(zhì)的復(fù)制是連續(xù)不斷的；基因配對(duì)先于基 因復(fù)制或與基因復(fù)制同時(shí)發(fā)生；如果把這個(gè)假 設(shè)用于解釋交換和轉(zhuǎn)換，并消除通過(guò)斷裂和再接 合引起的姊妹鏈交換，那么沿著染色體長(zhǎng)度連續(xù) 的交換應(yīng)該包含相同的兩個(gè)染色單體；在一個(gè) 給定的雜合子位置處，從突變體轉(zhuǎn)換到野生型等 位基因和從野生型轉(zhuǎn)換到突變體等位基因應(yīng)該以 相同的頻

24、率出現(xiàn)；在相同的基因內(nèi)，在不同的 突變體之間的交叉中，轉(zhuǎn)換到野生型等位基因的 頻率應(yīng)該正比于這些突變體之間的距離，于是 允許用附加的重組頻率構(gòu)建線性基因圖譜?！苯又?，霍利德又指出模板選擇模型遇到的困難。 他指出：“顯然，預(yù)測(cè)暫時(shí)沒(méi)有得到實(shí)驗(yàn) 證據(jù)的支持，在別處已經(jīng)充分討論了模板選擇模型的這些困難。此外，累積的證據(jù)不支持預(yù)測(cè) 。1962年Kaniti等發(fā)現(xiàn)在芽抱顏色突變體和野 生型的交叉中，從突變體到野生型等位基因的轉(zhuǎn) 換頻率大約是在反方向上轉(zhuǎn)換頻率的1/5在許多研究中似乎是證明了預(yù)測(cè)。” 34 同源重組分子機(jī)制的確立4.1 Holliday模型1964年美國(guó)分子生物學(xué)家霍利德提出了揭示 同源重

25、組關(guān)鍵步驟的模型，這是一個(gè)解釋同源重組 的簡(jiǎn)單但在遺傳學(xué)歷史上極為重要的模型。它很好 地解釋了 DNA鏈侵入、分支移位和Holliday聯(lián)結(jié)體 拆分等同源重組的核心過(guò)程。Holliday模型的主要內(nèi)容是：在減數(shù)分 裂前期1的雙線期，同源染色體相互靠近，兩 條染色單體（雙鏈DNA分子）聯(lián)會(huì)（圖7（a）。兩 個(gè)DNA分子中兩個(gè)方向相同的單鏈（圖7中鏈2和進(jìn)2和王新裂毎1和4斷裂和冉接合杓再接令圖7同源染色單體的重組和有效配對(duì)的各個(gè)階段的圖解說(shuō)明：兩條實(shí)線表示染色單體的DNA雙鏈，而兩條虛線表示其他染色單體的DNA雙鏈；箭頭表示這些鏈的極性；水平短線給岀基因中斷處或連接處位置鏈3），在DNA內(nèi)切酶作

26、用下，在相同的位置上 同時(shí)被切開(kāi)。在每個(gè)切開(kāi)的地方雙螺旋稍微解 開(kāi)，釋放出單鏈（圖7（b）。釋放的單鏈通過(guò)和295Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE另一分子中沒(méi)有斷裂的鏈互補(bǔ)配對(duì)，而在兩個(gè) DNA分子間進(jìn)行交換，形成一個(gè)由于單鏈交叉 使兩個(gè)DNA分子連接在一起的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生了關(guān) 鍵的重組中間體 Holliday聯(lián)結(jié)體(圖7(c)。 重組過(guò)程的完成需要通過(guò)切斷交叉點(diǎn)附近DNA鏈以拆分Holliday聯(lián)結(jié)體，恢復(fù)兩個(gè) DNA分子。 Holliday聯(lián)結(jié)體的拆分方式有兩種：第一種方式 是相對(duì)的鏈2和鏈3，在

27、交叉處第二次被切開(kāi)并再 連接，結(jié)果在斷開(kāi)處外產(chǎn)生與原來(lái)完全相同的兩 個(gè)非重組DNA，在兩個(gè)切口之間的單倍體區(qū)域 內(nèi)出現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)換(conversion)，即一個(gè)基因使 相對(duì)位置上的基因發(fā)生相應(yīng)的變化所致；第二種 分離方式是另外兩條鏈，鏈1和鏈4被切開(kāi)，然后 再重新連接，于是會(huì)把半條染色單體的互換變 為整條染色單體的互換，由此產(chǎn)生重組的DNA(圖 7(d) o支持Holliday模型最為有力的證據(jù)是 Potter 和Dressier使用特殊的方法在電子顯微鏡下看到 了Holliday中間體的結(jié)構(gòu)(圖8)。0.5圖8 Holliday聯(lián)結(jié)體的電子顯微照片不久以后，人們對(duì) Holliday模型進(jìn)行了

28、補(bǔ) 充，在Holliday聯(lián)接形成之后，引入了聯(lián)結(jié)體的 移動(dòng)步驟：一個(gè)Holliday聯(lián)結(jié)體可以通過(guò)配對(duì)堿 基連續(xù)的解鏈和配對(duì)而沿著DNA移動(dòng)。每次移動(dòng)時(shí)，親本DNA鏈上配對(duì)堿基斷開(kāi)，由相同的 堿基配對(duì)形成重組中間體，該過(guò)程稱為分支移位 (branch migration)。這種移位提高了交換 DNA的 長(zhǎng)度。如果兩個(gè) DNA分子并不完全相同，如同 一基因不同的等位基因間常有的少量序列上的差 異，發(fā)生在這些區(qū)域的分支移位形成的DNA雙螺旋將帶有1個(gè)或若干個(gè)序列錯(cuò)配，這種區(qū)域被 稱為異源雙螺旋DNA o4.2 單鏈斷裂模型1975年，哈佛大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室的分子生物 學(xué)家梅塞爾森和耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的分

29、子生物和生 物化學(xué)系教授拉丁 (Radding C. M.)在美國(guó)國(guó)家 科學(xué)院院刊上發(fā)表題為基因重組的一般性模 型的論文。該文的摘要指出4: “對(duì)于基因重 組提出的一般性模型，它的新的主要特征是假設(shè) 由單鏈(或不對(duì)稱的)轉(zhuǎn)移起始的，在同分異構(gòu)化 之后，它可能變?yōu)殡p鏈(或?qū)ΨQ的)交換。從不對(duì) 稱到對(duì)稱的鏈交換的轉(zhuǎn)變可能確定了在任何特別 的有機(jī)體中一定的特征?！敝劣贖olliday聯(lián)結(jié)接的形成以及后來(lái)的拆分，與原來(lái)的Holliday模型相比并沒(méi)有做多少變動(dòng)。由此模型可知，在重組 事件的起始階段只有一條 DNA分子含有非對(duì)稱 異源雙鏈區(qū)，到后來(lái)由于異構(gòu)化和分支遷移才使 兩條DNA分子上出現(xiàn)對(duì)稱異源雙

30、鏈區(qū)。這一點(diǎn) 已由新發(fā)現(xiàn)的異源雙鏈區(qū)上下游部分基因轉(zhuǎn)換頻 率和比例的不同而得到證實(shí)。關(guān)于單鏈斷裂模型，它的基本內(nèi)容是： 兩個(gè)進(jìn)行重組的DNA分子在同源區(qū)域相應(yīng)的位點(diǎn)上只產(chǎn)生一個(gè)單鏈裂口。產(chǎn)生裂口的鏈被 DNA聚合酶催化的新鏈合成取代后，侵入到另 一條同源的DNA分子之中，與該分子中的互補(bǔ) 序列配對(duì)，并在后者中產(chǎn)生了一個(gè)單鏈裂口。 如圖9(AP)所示，進(jìn)一步的鏈轉(zhuǎn)移來(lái)自于在箭頭 處聚合酶作用和在箭尾處外切核酸酶作用，鏈置換和鏈同化作用協(xié)調(diào)操作的結(jié)果。因?yàn)檫@個(gè)反 應(yīng)只在兩個(gè)相互作用的分子中的一個(gè)上產(chǎn)生一 束異源雙鏈DNA，我們稱之為非對(duì)稱鏈轉(zhuǎn)移。 從聚合作用反應(yīng)獲得的化學(xué)能，迅速地推動(dòng)這 個(gè)雙鏈體

31、必要的轉(zhuǎn)動(dòng)。酶的解離允許結(jié)構(gòu)Ap重新排列，或同分異構(gòu)化（i），給出結(jié)構(gòu)Ar，如圖 9所示。在結(jié)構(gòu)Ap中，與交換位置相接的這條臂 是在親代的構(gòu)型中，而在結(jié)構(gòu) Ar中，這條臂是在 重組構(gòu)型中。由于兩個(gè) DNA分子旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散的 緣故，在結(jié)構(gòu)Ar中的交叉連接可在任何方向上自 由遷移。在另一方面，異源雙鏈DNA可能預(yù)先非對(duì)稱地形成，現(xiàn)在鏈轉(zhuǎn)移是對(duì)稱的，而且可能 在兩個(gè)分子上形成異源雙鏈DNA（S，圖9）。在上一步中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu) 5可能經(jīng)歷一個(gè)比上述過(guò) 程更加復(fù)雜的、可逆的同分異構(gòu)化的過(guò)程（i ）,而且也交換兩個(gè)側(cè)臂的親本的和重組的構(gòu)型， 形成結(jié)構(gòu)Spo這個(gè)結(jié)構(gòu)Sp在物理學(xué)上，而不是在 遺傳學(xué)上，等同于Hol

32、liday模型中的對(duì)稱性的異 源雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。通過(guò)切開(kāi)結(jié)構(gòu)Sr也能直接產(chǎn)生 結(jié)構(gòu)Sp。如果能夠起始旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散也能獲得這個(gè)產(chǎn)泊對(duì)稱圖9單鏈斷裂模型示意圖。（a）在非對(duì)稱的狀態(tài)中只在一條 染色單體上形成異源雙鏈 DNA結(jié)構(gòu)。在第一個(gè)特殊的 中間體Ap中，側(cè)臂是親本構(gòu)型。由同分異構(gòu)化i產(chǎn)生結(jié)構(gòu)Ar,在結(jié)構(gòu)Ar中異源雙鏈DNA仍然限于一條染色單 體，但需要側(cè)臂有重組構(gòu)型。由旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散推動(dòng)的分支 移動(dòng)，把結(jié)構(gòu)Ar轉(zhuǎn)換成Sr，而異源雙鏈DNA隨之在兩 個(gè)染色單體上對(duì)稱地形成。（b）在對(duì)稱的狀態(tài)中，由同 分異構(gòu)化i，能夠重新安排側(cè)臂的構(gòu)型。結(jié)構(gòu)Sp也可以由旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散從Ap直接產(chǎn)生（虛線）。在人的一條鏈中顯 示的

33、中斷在某個(gè)時(shí)間由多核苷酸連接酶閉合這個(gè)裂口物。Holliday結(jié)構(gòu)的同分異構(gòu)化使在交換位置 的類似鏈的兩個(gè)配對(duì)發(fā)生交換，造成它們兩者對(duì) 內(nèi)切核酸酶的攻擊產(chǎn)生敏感，該酶通過(guò)切開(kāi)交叉 鏈而終止這個(gè)交換。最后，這個(gè)模型像許多其 他流行的模型一樣，假定在異源雙鏈區(qū)域中錯(cuò)誤 的堿基配對(duì)必須得到酶的修復(fù)。接著，作者描述了同分異構(gòu)化的細(xì)節(jié)，如 圖10（ I V ）所示。從Holliday結(jié)構(gòu)開(kāi)始，可以 把同分異構(gòu)化設(shè)想如下：在交叉連接處4個(gè)堿基配對(duì)不堆積，產(chǎn)生了對(duì)稱性的結(jié)構(gòu)，如圖 10（ II）所示。分子ab和 AB繞著通過(guò)交叉連接處 的軸a彼此相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)180°就產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)川。分 子模型的檢驗(yàn)揭示

34、出這種轉(zhuǎn)動(dòng)只能在立體空間的 意義上才能完成。分子 aB和Ab繞著垂直于第 一條軸的第二條軸b彼此相對(duì)轉(zhuǎn)動(dòng)180 °給出了 結(jié)構(gòu)Wo這種轉(zhuǎn)動(dòng)也只能在立體空間的意義上才 能完成。在這個(gè)新的交叉連接的任一邊上堿基 配對(duì)的再堆積給出了重組結(jié)構(gòu)Vo4.3 雙鏈斷裂模型雙鏈斷裂模型主要是在酵母中獲得的一些 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上提出來(lái)的。和Holliday模型一樣，這個(gè)過(guò)程也是由同源染色體聯(lián)會(huì)開(kāi)始，但 在這個(gè)模型里，始發(fā)事件是兩條DNA分子中的一條發(fā)生了雙鏈斷裂，而另外一條保持完整。因?yàn)殡p鏈DNA斷裂較易發(fā)生，與 Holliday模型 中所提到的同源成對(duì)斷裂作為起始事件相比， 雙鏈DNA斷裂更有說(shuō)服力

35、。然而，兩條DNA分子的非對(duì)稱始發(fā)斷裂，導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂模型的后期重組過(guò)程也是非對(duì)稱的。雙鏈斷裂模型 認(rèn)為，一個(gè)DNA分子上兩條鏈的斷裂才啟動(dòng)了 鏈的交換。兩個(gè)重組 DNA分子中產(chǎn)生斷裂的雙 鏈被稱為受體雙鏈（recipient duplex），不產(chǎn)生斷 裂的被稱為供體雙鏈（donor duplex）。隨后發(fā)生 的DNA修復(fù)合成及切口連接導(dǎo)致形成Holliday聯(lián)結(jié)o1983年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系史佐斯 泰克（Szostak J. W.）等在細(xì)胞雜志上發(fā)表了 題為重組的雙鏈斷裂修復(fù)模型的論文，提出 了雙鏈斷裂啟始重組的模型。具體步驟如圖11所#Chinese Journal of Nat

36、ure Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE(編輯：段艷芳)#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCEAAa1一卜r二13(ITT、(編輯：段艷芳)#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE(編輯：段艷芳)#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE圖10同分異構(gòu)化的示意圖(編輯：段艷芳)

37、#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE(編輯：段艷芳)#Chinese Journal of Nature Vol. 37 No. 4HISTORY OF NATURAL SCIENCE示，由以下5個(gè)階段組成：(1) 內(nèi)切核酸酶切開(kāi)一條染色單體(雙鏈 DNA分子)的兩條鏈，導(dǎo)致這個(gè) DNA分子雙鏈 發(fā)生斷裂，從而啟動(dòng)重組過(guò)程。這個(gè)雙鏈斷裂的DNA分子既是啟動(dòng)重組的“入侵者”，又是遺傳信息的受體(受體雙鏈)。受到外切核酸酶 的作用，雙鏈切口擴(kuò)大而產(chǎn)生具有3-單鏈末端的空隙。(2) 個(gè)自由的3'-

38、端入侵供體雙鏈DNA分子 同源的區(qū)域，形成異源雙鏈。供體雙鏈的一條鏈 被取代，另一條鏈提供了修復(fù)合成反應(yīng)的遺傳信息，產(chǎn)生取代環(huán)(displacement loop, D環(huán))。(3) 由入侵的3'端引發(fā)的DNA修復(fù)合成導(dǎo)致 D環(huán)延伸。D環(huán)最終大到覆蓋受體雙鏈的整個(gè)空隙。新合成的DNA是由被入侵的DNA雙鏈作為 模板，于是新合成的 DNA序列由被入侵的DNA 決定。(4) 當(dāng)供體雙鏈被取代的鏈到達(dá)受體雙鏈空隙的另外一側(cè)，它將和空隙末端的另一個(gè)3-單鏈末端退火。于是被取代的單鏈提供了序列，填補(bǔ)了受體雙鏈一開(kāi)始被切除的序列。由 DNA 聚合酶催化的修復(fù)合成將供體雙鏈的 D環(huán)轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA。D

39、NA連接酶縫合缺口，形成兩個(gè)Holliday 聯(lián)結(jié)。圖11雙鏈斷裂模型(5) Holliday聯(lián)結(jié)的拆分有兩種可能的途徑：一種途徑是兩個(gè)切口一個(gè)在內(nèi)側(cè)的鏈，另 一個(gè)在外側(cè)的鏈，那么分離得到的是交換產(chǎn)物 (crossover product);另一種途徑是兩個(gè)切口要么 都在內(nèi)側(cè)的鏈，要么都在外側(cè)的鏈，得到的是非 交換的產(chǎn)物(non-crossover product)。1994年美國(guó)俄勒岡州立大學(xué)分子生物研究 所斯塔赫(Stahl F. W.)在遺傳學(xué)雜志上發(fā)表Holliday聯(lián)結(jié)30周年一文。在概述了雙鏈斷 裂模型后，作者敘述了雙鏈切口的實(shí)驗(yàn)證明， 他寫(xiě)道：“通過(guò)論證減數(shù)分裂重組的啟動(dòng)，已 經(jīng)

40、在酵母菌減數(shù)分裂重組的啟動(dòng)中證實(shí)了雙鏈 切口的重要性，由發(fā)源于它們的基因轉(zhuǎn)換的梯 度(gradients of gene conversion) 推斷出重組的存 在，重組位于天然的特殊的減數(shù)分裂的雙鏈切口 處。這些切口位置的缺失既消除了這些切口又 消除了在它們附近的高速率重組?！苯又麛⑹隽穗p鏈斷裂模型與其他兩個(gè)模型的關(guān)系，寫(xiě) 道：“應(yīng)該注意這個(gè)雙鏈斷裂模型不僅保留了Holliday 結(jié)構(gòu)，而且也保留了 Meselson-Radding 模型的主要特征：由于在切口位置處產(chǎn)生的3端伸出，在切口的每一邊上出現(xiàn)了一個(gè)非對(duì)稱 的異源雙鏈DNA的區(qū)域。一旦形成 Holliday聯(lián) 結(jié)，它就可能向外滑動(dòng)，形成一個(gè)對(duì)稱的異源 雙鏈DNA的區(qū)域。”最后作者又談到Holliday聯(lián) 結(jié)在三個(gè)模型中的作用。作者指出： “ Holliday 聯(lián)結(jié)的引入，使得該聯(lián)結(jié)已經(jīng)成為重組模型的 基礎(chǔ)，因此，生物化學(xué)的調(diào)查研究聚焦于此。通過(guò)在試管中對(duì)分離結(jié)構(gòu)的研究，證實(shí)了在Meselson-Radding 模型中假設(shè)的，由 Meselson 主 張的聯(lián)結(jié)滑動(dòng)的能力。后來(lái)的研究揭示了在細(xì)菌 中酶促進(jìn)了這種滑動(dòng)。”(2014年9月 12日收稿)參考文獻(xiàn)1 王亞馥，戴灼華.遺傳學(xué)M.北京：高等教育出版社,2001: 60-65, 197-199.2 徐晉麟，徐沁，陳淳.現(xiàn)代遺傳學(xué)原理M.北京：科學(xué)出版社,2001: