CHO細(xì)胞表達(dá)抗體

1、CHO細(xì)胞表達(dá)抗體基因工程抗體表達(dá)體系酵母細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞昆蟲(chóng)細(xì)胞CHO 細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞CHO（Chinese hamster ocary）CHO細(xì)胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細(xì)胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的u對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化，其糖型與人類基本一致u不易傳播人類病毒，比其他哺乳細(xì)胞基因組更容易進(jìn)行改造和擴(kuò)增u遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長(zhǎng)期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達(dá)有功能活性抗體u利于抗體純化：非分泌型細(xì)胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無(wú)血清培養(yǎng)CHO Classification補(bǔ)充：1980年CHO-K1經(jīng)化學(xué)突變得到CHO-DXB11 （一個(gè)等位基因缺失）1983年的電離輻

2、射經(jīng)誘變株CHO-DG44 （兩個(gè)等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不徹底，很快被完全無(wú)DHFR活性 的CHO-DG44取代注釋： ATCC （American Type Culture Collection） 美國(guó)菌種保藏中心 ECACC（ European Collection of Authenticated Cell Cultures） 歐洲細(xì)胞株/微生物保藏中心DHFR缺陷型宿主細(xì)胞野生型宿主細(xì)胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達(dá)系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達(dá)系

3、統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細(xì)胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標(biāo)記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主細(xì)胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標(biāo)記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細(xì)胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標(biāo)記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell抗體真核高效表達(dá)策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位

4、點(diǎn)弱化選擇標(biāo)致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴(kuò)增選擇標(biāo)志基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、強(qiáng)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)翻譯翻譯型增強(qiáng)子，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)加工組裝輕重鏈表達(dá)平衡，宿主細(xì)胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導(dǎo)肽，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)其他選擇適宜的宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達(dá)量很大程度上由質(zhì)粒載體的各表達(dá)調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定CHO表達(dá)載體組成表達(dá)載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標(biāo)志基因u 表達(dá)盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細(xì)胞中大量擴(kuò)增和制備原核基因序列在哺乳動(dòng)物中

5、有效的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件、終止子PolyA序列在CHO細(xì)胞中大量表達(dá)目的蛋白真核基因序列抗生素類篩選標(biāo)（Neo）細(xì)胞代謝類篩選標(biāo)記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達(dá)較多抗體的細(xì)胞株篩選標(biāo)記選擇標(biāo)志基因共擴(kuò)增基因（DFHR和GS）非擴(kuò)增基因（neo）當(dāng)環(huán)境中存在高濃度（MTX 、MSX）時(shí)，標(biāo)記基因可自發(fā)在染色體上擴(kuò)增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴(kuò)增，共擴(kuò)增序列可達(dá)上千個(gè)bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對(duì)目的基因的拷貝數(shù)沒(méi)有影響，如主要用于構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體。表達(dá)盒抗體基因表達(dá)盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動(dòng)子啟動(dòng)子下游有真核的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，通常為GCCGCC

6、 A/GCCAUGG+4的共有序列IRES具有較強(qiáng)的起始翻譯的能力，研究發(fā)現(xiàn)，某些動(dòng)物的基因前存在類似IRES的序列，可以獨(dú)立啟動(dòng)翻譯，并且翻譯效率很高，可稱之為翻譯型增強(qiáng)子核糖體進(jìn)入位點(diǎn)影響mRNA的有效合成和穩(wěn)定性，提高胞漿中能進(jìn)行有效翻譯的 mRNA濃度，提高表達(dá)水平。使用廣泛的有BGH polyA site，轉(zhuǎn)錄終止作用強(qiáng)于SV40.轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)和PolyA加尾信號(hào)啟動(dòng)子和相應(yīng)的增強(qiáng)子是最關(guān)鍵的元件真核啟動(dòng)子含有TATA盒（確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)）和下游富含GC的序列（決定轉(zhuǎn)錄起始頻率）常用的CHO細(xì)胞表達(dá)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性依次 為 C M V 啟 動(dòng) 子 SV40 啟動(dòng)子 LTR啟動(dòng)子 Pc

7、DNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)GS系統(tǒng)DHFR系統(tǒng) 常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細(xì)胞，但是有報(bào)道CHO（DHFR-)細(xì)胞，很難馴化，生長(zhǎng)也不好。DHFR系統(tǒng)表達(dá)水平雖較GS系統(tǒng)低，但細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴(kuò)增效率，但細(xì)胞長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)狀況不佳。PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng) 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽(yáng)性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。u 進(jìn)一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓

8、力下，dhfr基因與其共轉(zhuǎn)染的目的基因一起擴(kuò)增，提高目的蛋白表達(dá)。GS系統(tǒng)Sigma、藥明康德等公司都在自己構(gòu)建載體使用（只要知道載體的幾個(gè)原件可以自己全部合成）宿主細(xì)胞：CHO-K1質(zhì)粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司 1992年，Bebbington等首次使用GS基因細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)重組抗體 PEE12.4PEE12.4412.4GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理 L-谷氨酸+氨+ATP L-谷氨酰胺+ADP+PiGS DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked）培液：CD-FortiCHO Medium 限制性內(nèi)切酶： AvrII/Bs

9、tZ17I ，EcoRV /Pacl線性化酶：NruI轉(zhuǎn)化：Neon electroporation Transfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法u 四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。u 當(dāng)葉酸類似物MTX不可逆結(jié)合后，阻止四氫葉酸合成。細(xì)胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細(xì)胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理CHO細(xì)胞的培養(yǎng) 一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng) 含10血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng) 無(wú)血清培養(yǎng)基 基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建（密碼子優(yōu)化） 2-3weeks 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 1-2 weeks 轉(zhuǎn)染CHO-s 2

10、days 細(xì)胞pool篩選 6-8weeks 單克隆Cell篩選 4-5weeks 單克隆擴(kuò)增、評(píng)估 2-3weeks 擴(kuò)大培養(yǎng)u 小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達(dá)細(xì)胞株。u 大幅度加壓可以在短期內(nèi)得到高表達(dá)克隆株細(xì)胞，但是細(xì)胞株表達(dá)不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后，表達(dá)水平往往下降。THEENDTHANK YOU ！CHO（Chinese hamster ocary）CHO細(xì)胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細(xì)胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的u對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化，其糖型與人類基本一致u不易傳播人類病毒，比其他哺乳細(xì)胞基因組更容易進(jìn)行改造和擴(kuò)增u遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長(zhǎng)期穩(wěn)定

11、傳代并穩(wěn)定表達(dá)有功能活性抗體u利于抗體純化：非分泌型細(xì)胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無(wú)血清培養(yǎng)DHFR缺陷型宿主細(xì)胞野生型宿主細(xì)胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達(dá)系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達(dá)系統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細(xì)胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標(biāo)記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主細(xì)胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4

12、（Amp抗性，GS標(biāo)記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細(xì)胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標(biāo)記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO CellCHO表達(dá)載體組成表達(dá)載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標(biāo)志基因u 表達(dá)盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細(xì)胞中大量擴(kuò)增和制備原核基因序列在哺乳動(dòng)物中有效的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件、終止子PolyA序列在CHO細(xì)胞中大量表達(dá)目的蛋白真核基因序列抗生素類篩選標(biāo)（Neo）細(xì)胞代謝類篩選標(biāo)記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達(dá)較多抗體的細(xì)胞株篩選標(biāo)記PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng) 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽(yáng)性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。u 進(jìn)一步用G418和MTX