CHO細胞表達抗體

1、CHO細胞表達抗體基因工程抗體表達體系酵母細胞哺乳動物細胞昆蟲細胞CHO 細胞骨髓瘤細胞CHO（Chinese hamster ocary）CHO細胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的u對蛋白質(zhì)進行糖基化，其糖型與人類基本一致u不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增u遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體u利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)CHO Classification補充：1980年CHO-K1經(jīng)化學突變得到CHO-DXB11 （一個等位基因缺失）1983年的電離輻

2、射經(jīng)誘變株CHO-DG44 （兩個等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不徹底，很快被完全無DHFR活性 的CHO-DG44取代注釋： ATCC （American Type Culture Collection） 美國菌種保藏中心 ECACC（ European Collection of Authenticated Cell Cultures） 歐洲細胞株/微生物保藏中心DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系

3、統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO Cell抗體真核高效表達策略作用環(huán)節(jié)相應(yīng)策略整合位

4、點弱化選擇標致基因；染色體定位篩選基因劑量弱化的可擴增選擇標志基因轉(zhuǎn)錄強啟動子、增強子、強轉(zhuǎn)錄終止信號、適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)翻譯翻譯型增強子，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)加工組裝輕重鏈表達平衡，宿主細胞修飾分泌適宜的抗體分泌前導肽，適宜的抗體基因結(jié)構(gòu)其他選擇適宜的宿主細胞、宿主細胞修飾，盡量去除非生產(chǎn)性克隆抗體mRNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄效率與mRNA的穩(wěn)定性是其中最重要的因素因此，抗體的表達量很大程度上由質(zhì)粒載體的各表達調(diào)控元件及組織方式?jīng)Q定CHO表達載體組成表達載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標志基因u 表達盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細胞中大量擴增和制備原核基因序列在哺乳動物中

5、有效的轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子元件、終止子PolyA序列在CHO細胞中大量表達目的蛋白真核基因序列抗生素類篩選標（Neo）細胞代謝類篩選標記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達較多抗體的細胞株篩選標記選擇標志基因共擴增基因（DFHR和GS）非擴增基因（neo）當環(huán)境中存在高濃度（MTX 、MSX）時，標記基因可自發(fā)在染色體上擴增拷貝數(shù)，連帶其上下游的序列一起擴增，共擴增序列可達上千個bp，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍。對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，如主要用于構(gòu)建瞬時表達載體。表達盒抗體基因表達盒的組織形式已較為固定，但其中各元件的選擇仍有值得探討的地方啟動子啟動子下游有真核的核糖體進入位點，通常為GCCGCC

6、 A/GCCAUGG+4的共有序列IRES具有較強的起始翻譯的能力，研究發(fā)現(xiàn)，某些動物的基因前存在類似IRES的序列，可以獨立啟動翻譯，并且翻譯效率很高，可稱之為翻譯型增強子核糖體進入位點影響mRNA的有效合成和穩(wěn)定性，提高胞漿中能進行有效翻譯的 mRNA濃度，提高表達水平。使用廣泛的有BGH polyA site，轉(zhuǎn)錄終止作用強于SV40.轉(zhuǎn)錄終止信號和PolyA加尾信號啟動子和相應(yīng)的增強子是最關(guān)鍵的元件真核啟動子含有TATA盒（確定轉(zhuǎn)錄起始位點）和下游富含GC的序列（決定轉(zhuǎn)錄起始頻率）常用的CHO細胞表達啟動子的轉(zhuǎn)錄活性依次 為 C M V 啟 動 子 SV40 啟動子 LTR啟動子 Pc

7、DNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)GS系統(tǒng)DHFR系統(tǒng) 常用的較早的商業(yè)化載體系統(tǒng)適用于DHFR缺陷細胞，但是有報道CHO（DHFR-)細胞，很難馴化，生長也不好。DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳。PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng) 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。u 進一步用G418和MTX篩選，在MTX濃度選擇壓

8、力下，dhfr基因與其共轉(zhuǎn)染的目的基因一起擴增，提高目的蛋白表達。GS系統(tǒng)Sigma、藥明康德等公司都在自己構(gòu)建載體使用（只要知道載體的幾個原件可以自己全部合成）宿主細胞：CHO-K1質(zhì)粒：PEE12.4篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）瑞士的Lonza公司 1992年，Bebbington等首次使用GS基因細胞系統(tǒng)表達重組抗體 PEE12.4PEE12.4412.4GS（谷氨酰胺合成酶）篩選原理 L-谷氨酸+氨+ATP L-谷氨酰胺+ADP+PiGS DHFR系統(tǒng)宿主：CHO-S Cell （cGMP-banked）培液：CD-FortiCHO Medium 限制性內(nèi)切酶： AvrII/Bs

9、tZ17I ，EcoRV /Pacl線性化酶：NruI轉(zhuǎn)化：Neon electroporation Transfection篩選試劑：Puromycin/MTX篩選方法：兩輪加壓篩選單克隆篩選：有限稀釋法u 四氫葉酸是一碳單位的載體，在核苷酸的合成中起到重要作用。u 當葉酸類似物MTX不可逆結(jié)合后，阻止四氫葉酸合成。細胞必須產(chǎn)生更多的DHFR才能維持細胞代謝。DHFR（二氫葉酸還原酶）篩選原理CHO細胞的培養(yǎng) 一般采用F12培養(yǎng)基培養(yǎng) 含10血清的常規(guī)培養(yǎng)基里培養(yǎng) 無血清培養(yǎng)基 基因合成與質(zhì)粒構(gòu)建（密碼子優(yōu)化） 2-3weeks 轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10 1-2 weeks 轉(zhuǎn)染CHO-s 2

10、days 細胞pool篩選 6-8weeks 單克隆Cell篩選 4-5weeks 單克隆擴增、評估 2-3weeks 擴大培養(yǎng)u 小梯度多次加壓有利于最終得到穩(wěn)定的高表達細胞株。u 大幅度加壓可以在短期內(nèi)得到高表達克隆株細胞，但是細胞株表達不穩(wěn)定，在撤掉篩選壓力后，表達水平往往下降。THEENDTHANK YOU ！CHO（Chinese hamster ocary）CHO細胞生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的首選細胞系目前70%以上的治療性抗體蛋白都是由CHO細胞產(chǎn)生的u對蛋白質(zhì)進行糖基化，其糖型與人類基本一致u不易傳播人類病毒，比其他哺乳細胞基因組更容易進行改造和擴增u遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)染效率高、可長期穩(wěn)定

11、傳代并穩(wěn)定表達有功能活性抗體u利于抗體純化：非分泌型細胞，本身很少分泌內(nèi)源性蛋白；可用無血清培養(yǎng)DHFR缺陷型宿主細胞野生型宿主細胞DG44DUXB11CHO-K1CHO-SPcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng)Life Technology公司GS基因表達系統(tǒng)瑞士的Lonza公司DHFR基因表達系統(tǒng)Life Technology公司Freedom CHO-S Kit宿主細胞：DG44質(zhì)粒：共轉(zhuǎn)染PcDNA3.3（Neo抗 性基因，￥2000）和Poptivec（DHFR標記基因，￥3500）篩選試劑：G418（遺傳霉素）/MTX （氨甲喋呤）宿主細胞：CHO-K1SV質(zhì)粒：PEE12.4

12、（Amp抗性，GS標記基因，￥2000）篩選試劑：MSX（氨基亞砜蛋氨酸）宿主細胞：CHO-s Cells (cGMP-banked)質(zhì)粒：pCHO1.0（嘌呤霉素和DHFR標記基因，￥10000）篩選試劑：Puromycin/MTX（氨甲喋呤）CHO CellCHO表達載體組成表達載體結(jié)構(gòu)組成u 骨架序列u 選擇性標志基因u 表達盒u 特殊的調(diào)控序列大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因在原核細胞中大量擴增和制備原核基因序列在哺乳動物中有效的轉(zhuǎn)錄啟動子、增強子元件、終止子PolyA序列在CHO細胞中大量表達目的蛋白真核基因序列抗生素類篩選標（Neo）細胞代謝類篩選標記(MTX MSX)篩選出穩(wěn)定表達較多抗體的細胞株篩選標記PcDNA3.3/Poptivec載體系統(tǒng) 將右圖質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO（DHFR-）u 宿主菌須在含有GHT（甘氨酸、次黃嘌呤、胸腺嘧啶）的培養(yǎng)基中生長u 重組質(zhì)粒Poptivec-target整合到宿主菌染色體組上后的陽性菌可在不含GHT的培養(yǎng)基中生長。u 進一步用G418和MTX