葉綠素含量的測(cè)定之歐陽音創(chuàng)編

1、葉綠素含量的測(cè)定時(shí)間：2021.03. 11創(chuàng)作：歐陽音二、原理根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見光譜的 吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其 吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的 含量。根據(jù)朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度A 與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即人= aCL式中：a比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為 單位，液層厚度為1cm時(shí)，a為該物質(zhì)的吸光 系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光 系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng) 下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某 一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長(zhǎng)下 吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲 測(cè)定葉

2、綠體色素混合提取液中葉綠素a. b和類 胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特 定波長(zhǎng)下的吸光度A,并根據(jù)葉綠素a、b及類 胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃 度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)為了排除類胡蘿卜素 的干擾，所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光 區(qū)的最大吸收峰。已知葉綠素已、葉綠素b的80%丙酮溶液在紅外 區(qū)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。已知 在波長(zhǎng)663nm下葉綠素a、葉綠素b在該溶液中 的吸光系數(shù)的分別為82.04和9.27；在波長(zhǎng) 645nm處的吸光系數(shù)分別為16. 75和45. 60o根 據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：A663二82. 04Ca+9. 27Cb(1)A

3、645二 16. 76Ca+45. 60Cb(2)式(1)(2) A663nm和A645nm為葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度，Ca S分別為葉綠素 a、葉綠素b的濃度，以mg/L為單位。解方程(1)(2)組得Ca=12. 72A6632. 59Am5（3）A6454. 67Cb二22. 88人663將Ca+Cb相加即得葉綠素總量CtCt= Ca 十 Cb=20. 29Am5 8. 05 人663(5)從公式（3）、（4）、（5）可以看出，就可 計(jì)算出提取液中的葉綠素a、b濃度另外，由于 葉綠素a葉綠素b在652nm的吸收峰相交，兩 者有相同的吸光系數(shù)（均為30.5）,也可以在 此

4、波長(zhǎng)下測(cè)定一次吸光度（A）而求出葉綠素 a、葉綠素b總量所測(cè)定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含 量可按下式進(jìn)行計(jì)算：人52 X 1 000Ct345（6）有葉綠素存在的條件下，用分光光度法可同時(shí) 測(cè)出溶液中類胡蘿卜素的含量。Licht- entha I er等對(duì)Arnon進(jìn)行了修正，提出了 80% 丙酮提取液中3種色素含量的計(jì)算公式：12.21A6632.59(7)Cb二20. 1 3A646 5. 03人663(8)1000A470-3.27Cfl-104C/,Cx. C=229(9)式中：ca Cb分別為葉綠素a、葉綠素b 的濃度；CX. C為類胡蘿卜素的總濃度；A663 A646 A4

5、70分別為葉綠素提取液在波長(zhǎng)663nm 646nm 470nm下的吸光度。由于葉綠素在不同溶劑中的吸收光譜有差異， 因此，在使用其他溶劑提取色素時(shí)，計(jì)算公式 也有所不同。綠素a、葉綠素b在95%乙醇中 最大吸收峰的波長(zhǎng)分別為665nm和649nm,類胡 蘿卜素為470nm,可據(jù)此列出以下關(guān)系式；Ca=1 3. 95人665 6. 8Ag9 (10)Cf24.96 A647. 32A665(11)1000心一2.05(?。一114.廻Cx. C=248(12)三、材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料新鮮(或烘干)的植物葉片。(二)儀器設(shè)備1. 分光光度計(jì)；2.電子頂載天平（感量 0.01g） ； 3.

6、研缽；4.棕色容量瓶；5.小漏 斗；6.定量濾紙；7.吸水紙；8.擦境紙；9. 滴管。（三）試劑1.96%乙醇（或80%丙酮）o2. 石英砂。3. 碳酸鈣粉。三、實(shí)驗(yàn)步驟1.取新鮮植物葉片 （或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。四、稱取剪碎的新鮮樣品0. 2g,共3份，分別放 入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2 3ml95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml,繼續(xù) 研磨至組織變白。靜置35m i n。五、取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤(rùn)，沿玻 棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量 瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù) 次，最后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分?。?/p>

7、、用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全 部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o綠色為 止。最后用乙醇定容至25ml,搖勻。七、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯 內(nèi)。以95%乙醇為空白，在波長(zhǎng)665nmx 649nm 下測(cè)定吸光度。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算與分析 按公式(10) x (11) x (12)(如用80%丙酮，按公 式7、8、9)分別計(jì)算綠素a、葉綠素b和類 胡蘿卜素的濃度(mg/L) o (10)、(門)式相加 即得葉綠素總濃度。求得色素的濃度后再按下式計(jì)算組織中個(gè)色素 的含量(mg/L鮮質(zhì)量或干質(zhì)量表示)：CxVxN葉綠素含量(mg/g) = Wxiooo式中：C為色素含量(mg/L) ;V為提取液體積 (mL)； N為稀釋倍數(shù)；W為樣品鮮質(zhì)量或干質(zhì)量(g)； 1000 BP 1L=1000mlo注意事項(xiàng)為了避免葉綠素光解，操作時(shí)應(yīng)在弱光下進(jìn) 行，淹沒時(shí)間應(yīng)盡量短些。葉綠體色素提取液不能渾濁?？稍?10nm 或750nm下測(cè)量吸光度，其值應(yīng)小于當(dāng)波長(zhǎng)為 葉綠素a吸收峰時(shí)吸光之哦的5%,否則應(yīng)重新 過濾。用分光光度計(jì)法測(cè)定葉綠素含量，對(duì)分光光度 計(jì)的波長(zhǎng)精確度要求較高。如果波長(zhǎng)與原吸收 峰波長(zhǎng)相差1nm,則葉綠素a的測(cè)定誤差為2%, 葉綠素b為19%,使用前必須對(duì)分光光度計(jì)的波 長(zhǎng)進(jìn)行校正。校正方法除按儀器說明書外，還 應(yīng)以純的葉綠素a和葉綠素來校正（表2-12- 1