產纖維素酶的篩選

1、主講人：何 園 學 號：2014103015 時 間：2014.11.131. 研究背景研究背景2. 試驗目的試驗目的3. 技術路線技術路線4. 試驗方法試驗方法5. 預期效果預期效果6. 參考文獻參考文獻講解內容講解內容一一.研究背景研究背景纖維素作為地球上最豐富的可再生有機資源，其轉化和利用對解決能源危機、糧食短缺、環(huán)境污染等問題具有十分重要的意義。纖維素酶是能夠作用于纖維素底物-1,4葡萄糖苷鍵的一類生物酶的總稱。由于開發(fā)利用木質纖維資源對人類社會的今后發(fā)展具有重大意義，而纖維素酶對纖維素資源的開發(fā)起到極為關鍵的作用，對其研究一直是國內外的熱點。纖維素代謝也是地球生物圈碳素循環(huán)的重要組成

2、部分，尋找和開發(fā)高產纖維素酶菌種，是充分利用纖維素資源的關鍵。研究進展研究進展： 該類酶上世紀40年代首次被發(fā)現(xiàn)。早期發(fā)現(xiàn)的纖維素酶主要由絲狀真菌的木霉、根霉等菌種產生，通常為酸酸性性 酶酶其最適作用pH值在3-5，在堿性條件下基本沒有酶活或活力很低。上世紀70年代，在嗜堿性的枯草芽孢桿菌(Bacillus sp. N-4 和 Bacillus sp.1139 菌株)中發(fā)現(xiàn)了最適作用pH在堿性范圍的纖維素酶，即堿性纖維素酶。隨后發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的數(shù)十株嗜堿性菌株均能夠產生堿性纖維素酶，此外，動物源堿性纖維素酶開始被報道，并成為開發(fā)堿性纖維

3、堿性纖維素酶素酶的重要方向。二二. .試驗目的試驗目的目前，酸性纖維素酶主要用于纖維素的水解糖化，而堿性纖維素酶則廣泛用于洗滌工業(yè)。不過，至今所研發(fā)的纖維素酶仍存在酶活力不足等問題，有必要挖掘新的酶資源。三三. 技術路線技術路線產纖維素酶菌株的初篩產纖維素酶菌株的初篩產纖維素酶菌株的復篩產纖維素酶菌株的復篩菌株形態(tài)觀察菌株形態(tài)觀察菌株分子鑒定菌株分子鑒定誘變育種誘變育種產高活性纖維素酶菌株的鑒定產高活性纖維素酶菌株的鑒定菌株生化鑒定菌株生化鑒定優(yōu)化產酶菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化產酶菌株的培養(yǎng)條件制備酶液制備酶液測定酶活力測定酶活力繪制菌株生長曲線和產酶曲線圖繪制菌株生長曲線和產酶曲線圖測定測定CMC酶

4、的最適作用條件酶的最適作用條件確定產纖維素酶菌株的屬種確定產纖維素酶菌株的屬種比較兩種菌株酶活力比較兩種菌株酶活力測其透明圈及酶活力測其透明圈及酶活力四四. .試驗方法試驗方法1. 材料和儀器材料和儀器(1).用于菌株分離的樣品采自畜禽堆肥。(2).所用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、CMC-剛果紅平板篩選培 養(yǎng)基、CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基、Bug培養(yǎng)基 (3).儀器:菌種鑒定96孔板2.方法方法 (1).菌株初篩菌株初篩：取樣品1 g，加10 mL無菌蒸餾水，充分振搖，靜止30 min，取上清液稀釋105倍，涂布接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基，30培養(yǎng)72 h至菌落長出，挑取透明水解圈較大的菌落。(2).

5、菌株復篩菌株復篩：挑取透明水解圈較大的菌落，接種CMC液體發(fā)酵培養(yǎng)基，37、200rpm搖瓶培養(yǎng)24 h，測定培養(yǎng)液的堿性CMC酶活力，選取活力最高的培養(yǎng)瓶，取菌液劃線接種CMC-剛果紅平板篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，純化菌種次，最后得到產堿性纖維素酶的高產菌株，命名，斜面和冷凍干燥保藏。(3).菌株的形態(tài)觀察：菌株的形態(tài)觀察：LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體用革蘭氏染色，顯微鏡觀察菌株形態(tài)。(4).分子鑒定分子鑒定：提取菌體DNA(CTAB法)，以該基因組DNA為模板，采用通用引物27F/1492R，PCR擴增菌株的16SrRNA序列。PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測、分離，然后用Agarose Gel DNA Pu

6、rification Kit 試劑盒切膠回收，用T4 ligase連接到Pmd-18T載體上。將帶有目的片段的載體通過轉化E.coli DH 5菌株擴增培養(yǎng)后，選擇陽性克隆提取質粒測序。將測序得到的16S rRNA序列用NCBI的BLAST2.0進行同源分析，搜索Genebank核酸數(shù)據(jù)庫，根據(jù)比對結果對菌株進行分子鑒定。(5).菌株生化鑒定菌株生化鑒定:采用Biolog 微生物鑒定系統(tǒng)進行。操作按儀器的說明書進行。(6).誘變育種誘變育種：制備孢子懸液：取試管斜面，用無菌水洗下孢子，裝入帶玻璃珠的三角瓶中，27振蕩2-3h，用脫脂棉過濾后，以10倍稀釋法作一系列稀釋，挑選一個稀釋度，用移液管

7、移l ml飽子懸液到小塑料離心管中，待用。紫外(UV)誘變方法：距離紫外燈30cm左右照射60s、70s、80s、90s、100 s，并不斷搖動。硫酸二乙酯(DES)誘變方法:分別吸取1ml孢子懸液10ulDES(終濃度為1%)和30ul乙醇溶液于一小塑料離心管中，于30水浴振蕩45min、60min、75min，處理完畢后加入30ul 25%的硫代硫酸鈉溶液終止反應。 UV-硫酸二乙酯(DES)復合誘變(7) .測定誘變后菌株的透明圈并將其菌株發(fā)酵測其酶活測定誘變后菌株的透明圈并將其菌株發(fā)酵測其酶活力。力。(8).菌株生長及產酶特性測定菌株生長及產酶特性測定:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基，接

8、種量5，30、200rpm下培養(yǎng)，定時取樣測定培養(yǎng)液的OD600和CMC酶活力，觀察菌株生長和產纖維素酶情況，繪制菌株生長曲線與產酶曲線圖。優(yōu)化菌株的培養(yǎng)條件，對3-12的pH值條件以及25-37溫度條件下菌株生長也進行觀察。(9). 酶液制備酶液制備:活化菌株接種CMC發(fā)酵培養(yǎng)基30、200 rpm培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液，4，4000 rpm離心10 min，取上清，55%(NH4)2SO4溶液沉淀粗蛋白,4，10000 rpm離心10 min，收集沉淀，加入培養(yǎng)液同體積的pH值8.0，0.1 mol/L的Tris-HCL緩沖液溶解，保存，用于測定酶的活力，2 d內使用。(10).酶活力測定

9、酶活力測定:以CMC鈉鹽為底物，測定CMC酶活力。酶反應體系含粗酶液0.5mL，CMC鈉鹽1%(g/ mL)，0.1mol/L的Tris-HCL(pH值為8.0)緩沖液2.0 mL。50水浴反應60 min，立刻用DNS法測定CMC水解所釋放的葡萄糖量。以作用CMC鈉鹽底物1min釋放1 mg葡萄糖所需的酶量定義為個酶活力單位。(11).比較誘變菌株與原菌株的酶活力。(12).繪制菌株生長曲線與產酶曲線圖繪制菌株生長曲線與產酶曲線圖:以最適的pH, 溫度條件培養(yǎng)產酶菌株，每隔4 h 取一次發(fā)酵液，測定OD600 值與纖維素酶活力，繪制菌株生長曲線與產酶曲線圖。(13).測定CMC酶的最適作用p

10、H值，最適作用溫度以及熱穩(wěn)定性。五五. .預期試驗結果預期試驗結果1.可以分離出一株產纖維素的菌株。2.鑒定出該菌株所屬的屬種。3. 對該菌株所產的纖維素酶有一定的了解，繪制出產 酶曲線圖和菌株生長曲線，用來指導發(fā)酵工業(yè)。4.用誘變后的菌株看能否提高產酶活性，以更好的生 產出纖維素酶。六六. .參考文獻參考文獻1.禤金彩, 廖龍, 龍寒, et al. 一株產纖維素酶蠟樣芽孢桿菌 的分離鑒定及酶學性質初步研究 J. 南方農業(yè)學報, 2014, 45(6): 984-988.2.蘆志龍, 張穗生, 吳仁智, et al. 產纖維素酶新菌株的篩選 及其產酶特性研究 J.廣西科學, 2014, 21(1): 22-27. 3.封曄