藥物敏感性試驗(yàn)方法

1、2022-1-51(Antimicrobial Susceptibility Test) 北京協(xié)和醫(yī)院 檢驗(yàn)科 細(xì)菌室 楊啟文2022-1-52 當(dāng)一細(xì)菌是需要抗微生物藥治療的某感染過程的病原菌，而其敏感性不能從細(xì)菌的種屬特性可靠地推知時(shí)，就需要進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 當(dāng)病原菌被認(rèn)為是屬于對(duì)常用抗生素能產(chǎn)生耐藥的菌種時(shí)，更需進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。2022-1-53v若感染的性質(zhì)不清楚、標(biāo)本含數(shù)種混合生長的菌或正常菌群，而且這些菌與正在治療的感染關(guān)系很小時(shí)，通常不必作藥敏試驗(yàn)，因?yàn)槠鋵?shí)驗(yàn)結(jié)果可能有誤導(dǎo)作用。v若感染是由公認(rèn)的對(duì)高效藥物敏感的微生物引起，就很少需要作藥敏試驗(yàn)。2022-1-54Selective

2、Reporting Each laboratory should decide which agents in the tables to report routinely(Group A) and which might be reported only selectively (from Group B),in consultation with the infectious disease practitioners and the pharmacy,as well as the pharmacy and therapeutics and infection control commit

3、tees of the medical staff of the hospital. CLCI M100-s152022-1-55 測(cè)試菌 藥敏方法v普通需氧菌和兼性厭氧菌 紙片擴(kuò)散法(M2-A8)v苛養(yǎng)菌 瓊脂稀釋法 v厭氧菌 稀釋法 (M7-A6) 宏量(2ml) 肉湯稀釋法 微量(0.1ml)2022-1-56（青霉素類、B-內(nèi)酰胺/B-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合藥、頭孢類、 碳青酶烯類、單環(huán)B-內(nèi)酰胺類）（主要針對(duì)G+菌）（G+菌或苛養(yǎng)的G-菌）（氯霉素、克林霉素、利福平、呋喃妥因） 2022-1-572022-1-58vA組：常規(guī)首選藥敏試驗(yàn)組合vB組：包括一些臨床上重要的，特別是針對(duì)醫(yī)院內(nèi)

4、感染的藥物。在下列情況時(shí)可以選擇性報(bào)告：(1)對(duì)A組同類抗生素耐藥時(shí)(2)特定的標(biāo)本來源（如三代頭孢對(duì)腦脊液中的腸道桿菌，TMP/SMZ對(duì)泌尿道中的分離菌株）（3)多種細(xì)菌感染（4)多部位感染（5)對(duì)A組藥過敏、耐受或無效的病例（6)為流行病學(xué)調(diào)查目的向感染控制組報(bào)告。vC組：包括某些醫(yī)院需要測(cè)試的替代性或補(bǔ)充性抗生素（由于該地區(qū)存在對(duì)某些首選藥物耐藥的菌株）。vU(Urine)組： 僅用于尿道中分離細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)，其他部位的感染不用此組藥物進(jìn)行試驗(yàn)。vO(Other)組：可能有臨床使用指征，但在美國不作為常規(guī)測(cè)試和報(bào)告。vInv(Investigational)組：目前正在進(jìn)行抗菌活性評(píng)估，

5、還未被FDA批準(zhǔn)。2022-1-59 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)試藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)。2022-1-510紙片擴(kuò)散法2022-1-511紙片擴(kuò)散法試劑試劑Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基抗生素藥片抗生素藥片接種物（細(xì)菌懸液）接種物（細(xì)菌懸液）2022-1-512紙片擴(kuò)散法vMH平皿的標(biāo)化v（1）厚度4mmv（2）pH7.27.4（pH過低，氨基

6、糖苷類與大環(huán)內(nèi)脂類失活，青霉素類 活性增強(qiáng)）v（3）濕度v（4）胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶（TMP/SMZ-ATCC29212,抑菌圈 20mm）v（5）二價(jià)陽離子含量：影響氨基糖苷類對(duì)綠膿桿菌、四環(huán)素對(duì)所有細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。過低，活性增強(qiáng)；過高，活性減弱）v（6）某些苛養(yǎng)菌，需要在MH瓊脂中添加其他物質(zhì)或使用其他培養(yǎng)基v（7）若當(dāng)天不使用，儲(chǔ)存于2-8C，七天內(nèi)使用。2022-1-513紙片擴(kuò)散法v抗生素藥片v（1）14C以下冷凍至使用前。B內(nèi)酰胺類應(yīng)密封包裝并冷凍，某些不穩(wěn)定的藥物（如亞胺培南、頭孢克羅、克拉維酸復(fù)合藥）應(yīng)冷凍保存直至使用。v（2）裝有紙片的容器應(yīng)于使用前1-2小時(shí)移出冰箱，平衡

7、至室溫才能打開。以防止紙片上冷凝水產(chǎn)生。v（3）當(dāng)指示劑變色時(shí)，應(yīng)更換干燥劑以防止過于潮濕。2022-1-514紙片擴(kuò)散法v接種物的標(biāo)化 （1）接種物制備：生長法（肉湯增菌） 直接菌落懸滴法（檢測(cè)苛養(yǎng)菌的推薦方法） （2）0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫龋▽?duì)于大多數(shù)細(xì)菌：1-2108CFU/ml) 0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁苤苽洌?0.5ml 0.048mol/L的BaCl299.5ml 0.18mol/L的H2SO42022-1-515紙片擴(kuò)散法v操作步驟 制備接種物（0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?接種（15分鐘內(nèi)接種，涂抹均勻）在接種好的瓊脂平板上貼加紙片 孵育（15分鐘內(nèi)反轉(zhuǎn)平板，35C空氣孵育） 苛養(yǎng)菌5CO2孵育判

8、度結(jié)果和解釋結(jié)果2022-1-516紙片擴(kuò)散法v判讀結(jié)果 將游標(biāo)卡尺置于反轉(zhuǎn)的平板的背面，測(cè)量到最接近的整數(shù)毫米數(shù)。平板應(yīng)距離一個(gè)黑色不反光的背景數(shù)英寸，并用反射光照明。 如果是加血的瓊脂培養(yǎng)基，則應(yīng)在透射光照射下，打開培養(yǎng)皿蓋，從上表面測(cè)量抑菌圈。 如果被測(cè)菌是葡萄球菌或腸球菌，則應(yīng)孵育24小時(shí)，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內(nèi)有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。2022-1-517紙片擴(kuò)散法v判讀結(jié)果 如果在透明的抑菌圈內(nèi)有任何的單個(gè)菌落，則應(yīng)進(jìn)行二次培養(yǎng)，重新鑒定和重新試驗(yàn)。 對(duì)于變形桿菌屬，在本該十分明顯的抑菌圈內(nèi)的薄紗樣蔓延生長應(yīng)該忽略。 對(duì)于TMP/SMZ

9、，培養(yǎng)基內(nèi)的藥物拮抗劑可能使細(xì)菌能微弱地生長，應(yīng)忽略微弱生長（生長菌膜的20或更少），并且應(yīng)測(cè)量更為明顯的邊緣來決定抑菌圈的直徑。 用加血培養(yǎng)基測(cè)試鏈球菌時(shí)，應(yīng)測(cè)量生長受抑制的區(qū)域，而不是溶血受抑制的區(qū)域。2022-1-518紙片擴(kuò)散法v解釋結(jié)果v抑菌圈大小的解釋參閱CLSI/NCCLS文件M100-S15，結(jié)果應(yīng)報(bào)告細(xì)菌對(duì)被測(cè)藥物敏感、中介或耐藥。v敏感該菌株所致感染可以用推薦用于此型感染及病原菌的抗生素劑 量、進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委?，除非存在禁忌癥。 中介藥物在生理濃集的部位具有臨床效力（如尿液中的喹諾酮類和 B內(nèi)酰胺類）或者可用高于正常劑量的藥物進(jìn)行治療（如B 內(nèi)酰胺類）。 耐藥測(cè)試菌不能被在體

10、內(nèi)感染部位可能達(dá)到的抗生素濃度所抑制， 臨床治療無效。2022-1-519北京協(xié)和醫(yī)院2004年1221株eco對(duì)TZP的抑菌圈直徑分布2022-1-520北京協(xié)和醫(yī)院2004年518株aba對(duì)IMP的抑菌圈直徑分布2022-1-521紙片擴(kuò)散法v質(zhì)控v目的：監(jiān)測(cè)藥敏精密度和準(zhǔn)確度；監(jiān)測(cè)試劑質(zhì)量；監(jiān)測(cè)操作者水平。v質(zhì)控菌：ATCC25922、ATCC27853、ATCC25923等v只要平均抑菌圈直徑?jīng)]有發(fā)生由于方法錯(cuò)誤造成的有意義的改變，質(zhì)控培養(yǎng)物就可以一直用于監(jiān)測(cè)試驗(yàn)的精密度和準(zhǔn)確度。如果某意外結(jié)果提示該菌株的內(nèi)在敏感性發(fā)生改變，就應(yīng)該換用此質(zhì)控株的新培養(yǎng)物。2022-1-522瓊脂稀釋法

11、v 紙片法紙片法 稀釋法稀釋法 v經(jīng)濟(jì)、常規(guī)應(yīng)用有經(jīng)濟(jì)、常規(guī)應(yīng)用有 定量、較準(zhǔn)確報(bào)告定量、較準(zhǔn)確報(bào)告 v統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn) 最低抑菌濃度（最低抑菌濃度（MIC） v只能檢測(cè)需氧菌只能檢測(cè)需氧菌 操作復(fù)雜操作復(fù)雜 v及兼性厭氧菌。及兼性厭氧菌。 不是連續(xù)濃度梯度不是連續(xù)濃度梯度v極易受實(shí)驗(yàn)室條極易受實(shí)驗(yàn)室條 任何細(xì)菌污染都會(huì)任何細(xì)菌污染都會(huì)v 件影響。件影響。 影響結(jié)果影響結(jié)果 2022-1-523瓊脂稀釋法 請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)瓊脂稀釋法試驗(yàn)，獲得美羅培 南對(duì)80株測(cè)試大腸桿菌的MIC值。 Q:2022-1-524瓊脂稀釋法v主要材料：MH瓊脂 美羅培南藥粉（純度91） 點(diǎn)種器2022-1-5

12、25瓊脂稀釋法 準(zhǔn)備對(duì)倍稀釋的藥液 準(zhǔn)備菌液 制備含抗生素的瓊脂平皿 點(diǎn)種菌液 孵育 讀MIC值 2022-1-526瓊脂稀釋法v抗生素用量計(jì)算W=母液濃度母液體積/藥物純度 =(256ug/ml25倍)4ml/0.91母液濃度依各個(gè)試驗(yàn)具體情況而定2022-1-527瓊脂稀釋法v對(duì)倍稀釋藥液藥物的溶解液和稀釋液參照CLSI/NCCLS M100-S15文件用滅菌蒸餾水稀釋至最低濃度為0.00425ug/ml(一般比質(zhì)控范 圍低限低一個(gè)稀釋度） 質(zhì)控范圍：ATCC25922 0.008-0.06 ATCC27853 0.25-12022-1-528瓊脂稀釋法2022-1-529瓊脂稀釋法制備含

13、抗生素平皿將1ml抗生素液與24ml MH瓊脂混勻，待其凝固。注意：瓊脂不可過熱 藥液和瓊脂要充分混勻 若檢測(cè)鏈球菌的敏感性，則推薦MH瓊脂在被高壓滅菌并冷卻后，以無菌手續(xù)加入5(v/v)脫纖維羊血或馬血并檢測(cè)pH。2022-1-530瓊脂稀釋法v菌液的準(zhǔn)備 新鮮菌落 0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?08CFU/ml） 1：10稀釋（107CFU/ml） 15分鐘內(nèi)接種2022-1-531瓊脂稀釋法點(diǎn)種器點(diǎn)種（每塊平皿可點(diǎn)52個(gè)點(diǎn)） 每個(gè)點(diǎn)為1-2ul,即104CFU注意：接種最初和最后要分別點(diǎn)種兩塊不含抗生素的MH平皿 “質(zhì)控前“（檢查生長菌的生長性和純度） “質(zhì)控后“（檢驗(yàn)在接種過程中有無污染）2022-1-532瓊脂稀釋法 吹干將平皿倒置，35C,普通空氣孵育16-20h 讀MIC值2022-1-533瓊脂稀釋法 0.008 0.016 0.032 0.064 0.125(ug