酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用

1、酵母雙雜交系統(tǒng)及其應(yīng)用Yeast Two-hybrid System and Its Application1.釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的生物學(xué)特性（1）單細(xì)胞真核生物 盡管酵母細(xì)胞比較簡(jiǎn)單，但它們具有所有真核生物細(xì)胞的主要特征，如含有一個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞核、多條線性染色質(zhì)包裝成染色體、細(xì)胞質(zhì)包含了全部的細(xì)胞器和細(xì)胞骨架結(jié)果（如肌動(dòng)蛋白纖維）。（2）與其它真核生物相比，它們的基因組較小，基因數(shù)目也較少； 1996年已完成酵母全基因組測(cè)序（ 1.5 x 107 bp ），是第一個(gè)被測(cè)序的真核生物。大約有6000個(gè)基因。目前已經(jīng)建立了一個(gè)6000個(gè)菌株的文庫(kù)，每一個(gè)菌

2、株中只刪除了一個(gè)基因。其中5000多株在單倍體狀態(tài)時(shí)能夠存活，表明大多數(shù)酵母基因時(shí)非必需的。（3）易于培養(yǎng)和操作,可以在實(shí)驗(yàn)室快速繁殖在指數(shù)生長(zhǎng)期每90分鐘繁殖一代，從單個(gè)細(xì)胞可以繁殖稱(chēng)克隆群體。（4）單倍體和雙倍體的存在使釀酒酵母便于進(jìn)行遺傳分析釀酒酵母可以以單倍體狀態(tài)和雙倍體狀態(tài)生長(zhǎng)。單倍體和雙倍體之間的轉(zhuǎn)換是通過(guò)交配和孢子形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。有兩種單倍體細(xì)胞類(lèi)型，分別為a型和型。在一起生長(zhǎng)時(shí)，這些細(xì)胞因交配而形成a/雙倍體細(xì)胞。在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，a/雙倍體發(fā)生減數(shù)分裂，產(chǎn)生一個(gè)子囊的結(jié)構(gòu)，每個(gè)子囊含有4個(gè)單倍體孢子（兩個(gè)a孢子和兩個(gè)孢子）。但當(dāng)生長(zhǎng)條件改善時(shí)，這些孢子可以出芽并以單倍體細(xì)胞的形式生

3、長(zhǎng)或交配而重新形成雙倍體。(5)一個(gè)酵母細(xì)胞可同時(shí)兼容幾種不同質(zhì)粒vegetative，營(yíng)養(yǎng)體生殖的，無(wú)性生殖的：屬于或關(guān)于無(wú)性生殖，如裂殖或芽殖的bud，芽, 蓓蕾 starvation，饑餓, 餓死ascus，n.微生物子囊 meiosis，n.減數(shù)分裂, 成熟分裂haploid，n.生物單倍體, 僅有一組染色體的細(xì)胞adj.單一的diploid，adj.雙重的, 倍數(shù)的, 雙倍的n.倍數(shù)染色體ascospore，n.植囊孢子rupture，v.破裂, 裂開(kāi), 斷絕(關(guān)系等), 割裂。n.破裂, 決裂, 敵對(duì), 割裂spore，n.孢子vi.長(zhǎng)孢子 germinate，v.發(fā)芽, 發(fā)育,

4、使生長(zhǎng)釀酒酵母生活周期2 酵母雙雜交系統(tǒng)的原理蛋白質(zhì)的相互作用是生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，一切生命活動(dòng)幾乎都是通過(guò)蛋白質(zhì)之間的相互作用而實(shí)現(xiàn)的。在生物體發(fā)育的不同階段，細(xì)胞分裂、分化的不同時(shí)期，都離不開(kāi)蛋白質(zhì)間的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種采用分子遺傳學(xué)手段、通過(guò)鑒定報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的方法。Y2H是由紐約州立大學(xué)的Stanley Fields于1989年首先創(chuàng)立的。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。l DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DB)l 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation d

5、omain, AD)例如，酵母轉(zhuǎn)錄子Gal4分子由一條多肽鏈組成，含有881個(gè)氨基酸。它有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：l DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain, DB ）由位于 N-末端1147個(gè)氨基酸構(gòu)成，能識(shí)別效應(yīng)基因的上游激活序列（UAS, upstream activating sequence）,此外， 在其N(xiāo)-端還具有一段核定位序列；l 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain, AD）由位于C-末端的768881位氨基酸構(gòu)成。當(dāng)Gal4的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們?cè)诳臻g上充分接近，則能夠恢復(fù)Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。Fields等將Snf1與DB融合，Snf

6、4與AD融合，構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上。其中，Snf1是一種依賴(lài)于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白激酶，Snf4是它的一個(gè)結(jié)合蛋白。研究者將兩種穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GGY: 171菌株，該菌株含有LacZ報(bào)告基因，并已去除相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空間上接近，激活了報(bào)告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。一般地，將DB-x的融合蛋白稱(chēng)作誘餌(bait) , X往往是已知蛋白; AD-Y稱(chēng)作獵物(prey) ,Y稱(chēng)作獵物;整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程稱(chēng)作“狩獵”( hunt或fish)。3 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用目前,在許多具有國(guó)際水準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室中,酵母雙雜交系統(tǒng)及其衍生方法已成為研究蛋白質(zhì)相互作用的首

7、選方法,而且利用它已揭示了大量未知蛋白質(zhì)的相互作用。據(jù)對(duì)文獻(xiàn)的統(tǒng)計(jì),目前已知的蛋白質(zhì)相互作用至少有一半是通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的。年份899091929394959697文獻(xiàn)數(shù)量10151558124223226年份989900010203040598文獻(xiàn)數(shù)量274340612736766744745671274l 鑒定兩種已知蛋白之間有無(wú)相互作用l 鑒定已明確有相互作用蛋白質(zhì)發(fā)生作用所必需的的結(jié)構(gòu)域及特定氨基酸的改變對(duì)相互作用的影響l 尋找與某一特定蛋白質(zhì)有相互作用的蛋白質(zhì)l 蛋白質(zhì)相互作用圖譜的繪制隨著基因組研究計(jì)劃的發(fā)展，以及mRNA在不同組織器官及不同發(fā)育階段的表達(dá)圖譜的構(gòu)建(body

8、 map)，蛋白質(zhì)在不同時(shí)空狀態(tài)下相互作用圖譜（即基因組蛋白連鎖圖譜Genome Protein Linkage Map）。的構(gòu)建也逐漸展開(kāi)。在雙雜交系統(tǒng)的BD及AD均接上cDNA庫(kù)，讓它們隨機(jī)表達(dá)蛋白，這樣檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的可能是A-B，B-C等一系列嶄新的蛋白一蛋白相互作用，據(jù)此可以繪出ABC的蛋白聯(lián)系圖譜。Fromont-Racine等采用了相互作用結(jié)合技術(shù)(interaction mating strategy)，將BD-誘餌蛋白質(zhì)(X)與AD基因組文庫(kù)(Y)分別轉(zhuǎn)化兩種不同交配型單倍體酵母菌株，使兩者在濾膜上結(jié)合，然后涂布于選擇培養(yǎng)基上，挑選出陽(yáng)性克隆作為誘餌蛋白質(zhì)進(jìn)行第二輪篩選。該

9、方法省去了利用二倍體菌株表達(dá)時(shí)篩選過(guò)程中繁瑣的交叉影印以及大量培養(yǎng)皿的使用，并可以顯著地提高效率。研究蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的方法有Western blotting、免疫沉淀法、噬菌體展示技術(shù)。4 Y2H的優(yōu)點(diǎn)1.酵母雙雜交體系研究蛋白一蛋白相互作用的整個(gè)過(guò)程只對(duì)核酸進(jìn)行操作，充分利用了成熟的核酸技術(shù)和酵母這一快速方便的操作體系，使得實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行?，F(xiàn)已發(fā)展出酵母雙雜交體系的商品試劑盒和相應(yīng)的cDNA庫(kù)。2.可以直接從基因文庫(kù)中尋找編碼相互作用蛋白的DNA序列，而不需要分離純化蛋白。3.可以研究蛋白之間的弱相互作用。在細(xì)胞內(nèi)，弱相互作用與強(qiáng)相互作用一樣起著極其重要的生物學(xué)作用。免疫沉淀法以及近來(lái)發(fā)

10、展起來(lái)噬菌體展示技術(shù)要求蛋白一蛋白相互作用強(qiáng)度足夠大，而不能檢測(cè)蛋白之間的弱相互作用。酵母雙雜交體系中蛋白一蛋白相互作用發(fā)生在酵母細(xì)胞這一自然的狀態(tài)下，使得該方法的靈敏度很高。4. 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。5 Y2H的局限性。l 報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)首先，報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，這要求兩種雜交體蛋白都必需能進(jìn)入核中，因此一些不容易進(jìn)入核的蛋白就不適合用該體系進(jìn)行研究。為了拓展其應(yīng)用范圍，近來(lái)發(fā)展的一些載體在融合蛋白中加入了蛋白質(zhì)核定位序(nuclear localization sequaence,NLS)，部分解決了這個(gè)題。已成功地在該體系中研

11、究過(guò)的蛋白除了許多核蛋白(如轉(zhuǎn)錄因子)外，還包括許多細(xì)胞漿、細(xì)胞膜以及線粒體蛋白。但對(duì)于發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中或者細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)相互作用是檢測(cè)不到的。l 有一些蛋白不適于用該體系但是，還有一些蛋白不適于用該體系。如需要翻譯后修飾(磷酸化或糖基化)才能起相互作用的蛋白不能直接用該體系進(jìn)行研究。因?yàn)樵诮湍钢胁灰欢〞?huì)產(chǎn)生與高等動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)一樣的翻譯后修飾。要研究這樣的相互作用，必需對(duì)該體系加以改造。另外有一些蛋白與DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合后，在沒(méi)有轉(zhuǎn)錄激活雜交體蛋白存在的情況下也能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。這些蛋白往往本身含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域或類(lèi)似的結(jié)構(gòu)域。這樣的蛋白需要經(jīng)過(guò)改造，去掉它們的轉(zhuǎn)錄激活能力后才能用該體系

12、研究。有些蛋白雜交體對(duì)酵母細(xì)胞的正常功能有影晌，有的甚至是致死性的，這樣的蛋白也無(wú)法在該體系中研究。l 假陽(yáng)性一個(gè)值得注意的問(wèn)題是篩庫(kù)過(guò)程中出現(xiàn)的假陽(yáng)性問(wèn)題。雖然現(xiàn)有的體系都用兩個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行雙重篩選，但假陽(yáng)性問(wèn)題仍然存在。一種假陽(yáng)性是由于轉(zhuǎn)錄激活雜交體中的庫(kù)蛋白本身是參與轉(zhuǎn)錄的蛋白，即使在DNA結(jié)合域雜交體不存在的情況下，轉(zhuǎn)錄激活雜交體自身就能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為陽(yáng)性。因此在篩選出陽(yáng)性克隆后，需要用回收的轉(zhuǎn)錄激活域雜交體質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化酵母，以判定克隆是否為假陽(yáng)性克隆。另一類(lèi)假陽(yáng)性是在DNA結(jié)合域雜交體存在下表現(xiàn)為陽(yáng)性，但對(duì)DNA結(jié)合域雜交體沒(méi)有特異性，不相關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體與其共轉(zhuǎn)化

13、酵母時(shí)也表現(xiàn)為陽(yáng)性。在篩選出陽(yáng)性克隆后，應(yīng)將轉(zhuǎn)錄激活域雜交體同一些不相關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體一起轉(zhuǎn)化酵母，以排除這類(lèi)假陽(yáng)性克隆。Harper等利用酵母交配發(fā)展一種快速檢別這類(lèi)假陽(yáng)性的方法。其大致過(guò)程是:讓陽(yáng)性克隆在一定的選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)使其失去DNA結(jié)合域雜交體質(zhì)粒，只剩下轉(zhuǎn)錄結(jié)合域雜交體質(zhì)粒，然后與不同性別的含有與該蛋白無(wú)關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體的酵母交配，從形成的二倍體酵母是否表現(xiàn)為陽(yáng)性判定原來(lái)的克隆是否為假陽(yáng)性克隆。而不需要提取回收陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)錄激活雜交體質(zhì)粒，再與無(wú)關(guān)的DNA結(jié)合域雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞這樣一個(gè)繁瑣的過(guò)程。篩到的蛋白和另一類(lèi)假陽(yáng)性來(lái)自cDNA庫(kù)的構(gòu)建?？赡躢DNA編碼的某個(gè)

14、蛋白的一部分能和目標(biāo)蛋白起相互作用，而完整的蛋白則無(wú)法和目標(biāo)蛋白結(jié)合;cDNA庫(kù)一般由Oligo-dT或由隨機(jī)引物合成。隨機(jī)引物構(gòu)建的cDNA庫(kù)中DNA的長(zhǎng)度一般為幾百bp，已將蛋白分成了多段，這樣避免了一個(gè)蛋白內(nèi)不同結(jié)構(gòu)域間的相互影響，對(duì)用酵母雙雜交體系進(jìn)行篩庫(kù)有利。但這種庫(kù)又可能使得原來(lái)在整個(gè)蛋白中不暴露的區(qū)域暴露，篩庫(kù)時(shí)有可能將這樣的區(qū)域篩出。這樣的假陽(yáng)性需要用其它實(shí)驗(yàn)加以排除。篩到的蛋白和目標(biāo)蛋白的相互作用有可能是通過(guò)酵母的內(nèi)源蛋白為介導(dǎo)產(chǎn)生的。l 假陰性在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性, 即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)

15、。造成假陰性的原因主要有幾方面:一、是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二、是蛋白間的相互作用較弱, 應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。三、GAL4和LexA系統(tǒng)要求被測(cè)蛋白定位于細(xì)胞核，然而有些蛋白卻有強(qiáng)疏水結(jié)構(gòu)域，還有些蛋白攜帶定位于細(xì)胞其他細(xì)胞器的強(qiáng)信號(hào)，這樣，涉及后2類(lèi)蛋白的相互作用在GAL4和LexA系統(tǒng)中就檢測(cè)不到;四、GAL4和LexA系統(tǒng)依賴(lài)轉(zhuǎn)錄激活報(bào)告基因而檢測(cè)蛋白相互作用，如果蛋白是抑制基因表達(dá)的，報(bào)告基因就不能被激活轉(zhuǎn)錄，雙雜交系統(tǒng)就檢測(cè)不到該蛋白相互作用了。另外應(yīng)該值得注意的是，從庫(kù)中篩到的蛋白在體內(nèi)是否真正同目的蛋白發(fā)生相互作用還需

16、要有進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。有可能兩種蛋白根本不在同一種器官、組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，或者不在同一發(fā)育階段表達(dá)，或者存在于同一種細(xì)胞的不同區(qū)域，根本不可能產(chǎn)生真正的相互作用。這也要求篩庫(kù)時(shí)謹(jǐn)慎選擇有生物學(xué)意義的基因庫(kù)(器官、組織、細(xì)胞、發(fā)育階段特異性)。最后,有必要指出的是,酵母雙雜交技術(shù)必須與其它技術(shù)結(jié)合才能有利于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果作出更為完整和準(zhǔn)確的判斷。6 酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)化6.1 BD結(jié)構(gòu)域：GAL4, LexA,6.2 AD結(jié)構(gòu)域：GAL4，VP16，B42酵母雙雜交系統(tǒng)常用的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有GAL4和來(lái)自E.coli的LexA（LexA不具有核定位序列）。常用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域有 GAL4、VP1

17、6或B42。由于轉(zhuǎn)錄因子具組件式特點(diǎn)，這些DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活結(jié)構(gòu)域可以相互組合，但每一種組合均有其優(yōu)缺點(diǎn)。比如VP16激活結(jié)構(gòu)域有強(qiáng)激活性，可以用于檢測(cè)親和力較低的蛋白之間的相互作用，但與此同時(shí)勢(shì)必伴隨假陽(yáng)性比率過(guò)高的問(wèn)題。按轉(zhuǎn)錄激活活性的大小排列，VP16較Ga14 region大，Ga14 region又較B42強(qiáng)。由于存在毒性問(wèn)題，并非轉(zhuǎn)錄活性越大越好。其中B42能消除強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活化子對(duì)酵母細(xì)胞的毒性，從而提高對(duì)靶蛋白的篩選范圍。VP16來(lái)自于單純皰疹病毒，它的轉(zhuǎn)錄激活活性高于其他兩個(gè)； B42是一個(gè)異源的含有88個(gè)殘基的酸性肽，來(lái)自E. coli，轉(zhuǎn)錄激活活性弱，可以緩和有毒性的基因表

18、達(dá)對(duì)細(xì)胞的影響，并且在B42后有流感病毒HA抗原，易于將蛋白分離純化?；贐42:LexA的酵母雙雜交系統(tǒng)（GAL1啟動(dòng)子）的融合蛋白可以被誘導(dǎo)性表達(dá)，以防蛋白相互作用產(chǎn)生了細(xì)胞毒作用而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)還可以為假陽(yáng)性提供對(duì)照。LexA系統(tǒng)可用以檢測(cè)微弱、短暫結(jié)合的蛋白，以及可能對(duì)酵母菌具有一定毒性的蛋白，而GAL4系統(tǒng)則可有效地消除假陽(yáng)性。6.3 報(bào)告基因：lacZ, HIS3，酵母雙雜交系統(tǒng)的報(bào)告基因通常由一些營(yíng)養(yǎng)選擇標(biāo)記HIS3(HIS3基因的轉(zhuǎn)錄激活能使酵母在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng))和（或）編碼酶的基因lacZ基因的轉(zhuǎn)錄激活能使酵母產(chǎn)生 -半乳糖苷酶）組成。最初的雙雜交系統(tǒng)只采用 一

19、種報(bào)告基因來(lái)反映蛋白相互作用，假陽(yáng)性通?？蛇_(dá)10 %90%不等，采用多個(gè)報(bào)告基因可以減少假陽(yáng)性，近來(lái)的雙雜交系統(tǒng)則使用3個(gè)甚至4個(gè)分別有獨(dú)立啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的選擇標(biāo)記來(lái)降低假陽(yáng)性率。同時(shí)使用多個(gè)營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記可使分析手段多樣化，但相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)時(shí)間卻并未增加。除此之外，因?yàn)椴煌膱?bào)告基因各有不同的上游激活序列，因此采用多個(gè)有獨(dú)立啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的選擇標(biāo)記能排除由于上游激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白和上游激活序列直接作用而引起的假陽(yáng)性結(jié)果。 雙雜交系統(tǒng)的改進(jìn)，使其不僅可以定性分析可以定量分析蛋白相互作用。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，實(shí)驗(yàn)者可以通過(guò)比較LacZ報(bào)告基因表達(dá)水平的相對(duì)高低，來(lái)比較一個(gè)目的蛋白和另一個(gè)己知與該目的蛋白有相互作用

20、的蛋白的若干突變體之間相互作用的相對(duì)強(qiáng)弱。 然而值得注意的是，在定量雙雜交分析中，只有使用相同的雙雜交系統(tǒng)，檢測(cè)大量轉(zhuǎn)化子，并且進(jìn)行大量平行試驗(yàn)，Lac Z報(bào)告基因表達(dá)水平的相對(duì)高低才被看作是有定量意義的。所有酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)都必須檢測(cè)大量轉(zhuǎn)化子，方可避免只檢測(cè)單個(gè)酵母菌落所引起的偏差和錯(cuò)誤。此外，要極力避免將不同實(shí)驗(yàn)團(tuán)體的數(shù)據(jù)橫向比較，因?yàn)椴煌瑢?shí)驗(yàn)室使用的雙雜交系統(tǒng)、操作方法、分析比較方法都是不同的，不同蛋白在不同酵母中會(huì)有不同的表達(dá)水平，不同菌落中質(zhì)粒的拷貝數(shù)不同，等等，這些都會(huì)使得橫向比較沒(méi)有意義。 液體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)(liquid growth assays)也是一種比較不同蛋白之間相互作用強(qiáng)

21、弱的簡(jiǎn)便方法。其原理是：酵母在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基里生長(zhǎng)，必須依賴(lài)蛋白的相互作用來(lái)激活能夠編碼組氨酸的基因。蛋白作用強(qiáng)，該基因表達(dá)量高，酵母合成組氨酸的能力強(qiáng)，酵母培養(yǎng)物濃度升高快，則透光性就差。因此，2個(gè)蛋白之間相互作用的強(qiáng)弱可以通過(guò)培養(yǎng)物濃度的改變值(可用分光光度計(jì)等測(cè)得)的相對(duì)大小而估得。也就是說(shuō)，蛋白相互作用強(qiáng)，酵母長(zhǎng)得就快一些。6.4 轉(zhuǎn)化方式酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問(wèn)題一是轉(zhuǎn)化效率偏低。酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率比細(xì)菌要低約4個(gè)數(shù)量級(jí)。因此轉(zhuǎn)化步驟就成為雙雜交技術(shù)的瓶頸，是酵母雙雜交文庫(kù)篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一, 特別是對(duì)低豐度cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí), 必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依

22、次轉(zhuǎn)化。相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力，更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性時(shí), 共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中, 通過(guò)兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞。Bendixen等人通過(guò)酵母接合型的引用,避免了兩次轉(zhuǎn)化操作,同時(shí)又提高了雙雜交的效率。7 Y2H的衍化系統(tǒng)7.1核外雙雜交系統(tǒng)（extra-nuclear two-hybrid system） 傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)所研究的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用大都是在細(xì)胞核內(nèi)完成的,但是許多定位在細(xì)胞質(zhì)中或細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)需要一系

23、列復(fù)雜的加工修飾過(guò)程才能發(fā)揮其正常生理功能。用傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)研究這些蛋白質(zhì)與伙伴蛋白之間的關(guān)系是不合適的。最近建立的以非轉(zhuǎn)錄讀出為特點(diǎn)的Sos蛋白介導(dǎo)的雙雜交系統(tǒng)、PI3K介導(dǎo)的靶蛋白識(shí)別系統(tǒng)以及斷裂-泛素為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)另辟蹊徑,為需要復(fù)雜修飾后定位在胞質(zhì)或細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)間相互作用的研究提供了新思路。7.1.1 Sos蛋白恢復(fù)系統(tǒng)(Sos recruiment system，SRS)SRS是Aronheim等根據(jù)Sos蛋白的特點(diǎn)設(shè)計(jì)出的一種雙雜交系統(tǒng)。Sos蛋白是人類(lèi)的Ras通路中鳥(niǎo)苷酸交換因子(guanine exchange factors, GEF)定位于細(xì)胞質(zhì)中,在細(xì)胞信號(hào)

24、轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中能夠使Ras蛋白由非活化型Ras-GDP轉(zhuǎn)化成活化型Ras-GTP,從而激活Ras信號(hào)通路,細(xì)胞得以生長(zhǎng)。酵母中的GEF是Cdc25蛋白,定位在細(xì)胞膜上,其功能與人類(lèi)的Sos蛋白相同。它的突變型cdc25-2為溫度敏感型,在37細(xì)胞不能生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn),在突變型cdc25酵母細(xì)胞中,當(dāng)Sos蛋白通過(guò)某種方式定位于細(xì)胞膜上時(shí),可替代Cdc25蛋白的功能, 激活Ras蛋白使細(xì)胞在37恢復(fù)生長(zhǎng)。根據(jù)這個(gè)原理構(gòu)建兩個(gè)融合蛋白,其中蛋白X與Sos蛋白構(gòu)成融合蛋白1, 蛋白Y與豆蔻?；蚍ㄎ髂峄ざㄎ恍盘?hào)構(gòu)成融合蛋白2, 兩個(gè)融合蛋白在cdc25突變型的酵母細(xì)胞中共表達(dá),如果X與Y相互作用,則能使

25、Sos蛋白定位于細(xì)胞膜上,激活Ras信號(hào)通路,使細(xì)胞在37下生長(zhǎng)。與傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)相比,Sos恢復(fù)系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)在于被研究的蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核中, 因此在轉(zhuǎn)錄因子及胞質(zhì)中行使生理功能的蛋白質(zhì)的研究中可以得到廣泛的應(yīng)用。7.1.2 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)介導(dǎo)的靶蛋白識(shí)別系統(tǒng)(targets of PI3K identification system,TOPIS)TOPIS是Isakoff等將SRS進(jìn)一步拓展建立而成的。該系統(tǒng)用來(lái)識(shí)別和篩選與PI3K催化產(chǎn)物磷脂酰肌醇3,4-二磷酸即PtdIns(3,4)P2及磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸即PtdIns(3,4,5

26、)P3具有高度親和力的蛋白。PI3K是一種膜結(jié)合脂類(lèi)激酶,其功能是使磷脂酰肌醇的肌醇環(huán)D-3位置磷酸化而催化PtdIns(3,4)P2以及PtdIns(3,4,5)P3的形成。PtdIns(3,4)P2和PtdIns(3,4,5)P3在胞內(nèi)可直接作為第二信使激活下游一系列信號(hào)分子。下游信號(hào)蛋白通常是通過(guò)其pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域(pleckstrin homology domain, PH domain)與PI3K催化產(chǎn)物結(jié)合。另一方面,研究發(fā)現(xiàn),在cdc25溫度敏感型酵母細(xì)胞中,與Sos蛋白特點(diǎn)類(lèi)似,當(dāng)活化型的Ras蛋白(Ras2GTP)以某種方式定位于細(xì)胞膜上時(shí),可補(bǔ)償酵母細(xì)胞cdc

27、25突變表型,使其在37恢復(fù)生長(zhǎng)。根據(jù)以上特點(diǎn),將活化型的Ras蛋白與靶蛋白PH結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建融合蛋白,讓它與PI3K在酵母cdc25溫度突變型細(xì)胞中共表達(dá)。在PI3K的介導(dǎo)下,如果靶蛋白的PH結(jié)構(gòu)域與PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3之一相結(jié)合,則將活化型的Ras蛋白定位于細(xì)胞膜上,允許酵母細(xì)胞在非允許溫度下(37)生長(zhǎng)。利用該系統(tǒng),Isakoff從與PtdIns(3,4)P2或PtdIns(3,4,5)P3具有高度親和力的一系列PH結(jié)構(gòu)域中發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)保守的氨基酸位點(diǎn),并且從這些保守的氨基酸位點(diǎn)出發(fā),從Genebank中找到幾個(gè)與PI3K產(chǎn)物相互作用的新蛋白。PI3K

28、所介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞中具有廣泛的生理效應(yīng)"所以,TOPIS對(duì)于闡明PI3K下游信號(hào)通路提供了有力的工具。7.1.3 斷裂-泛素為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)(yeast two-hybrid system based on split-ubiquitin)上面介紹的兩個(gè)系統(tǒng)是針對(duì)膜有關(guān)的Ras信號(hào)通路的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。近來(lái)Staglar等根據(jù)存在于胞質(zhì)中的一種蛋白泛素的特點(diǎn)建立了一種以斷裂-泛素(split-ubiquitin)為基礎(chǔ)的雙雜交系統(tǒng)也用于研究膜蛋白之間的相互作用。泛素是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的由76個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì),結(jié)構(gòu)保守。其生理功能是結(jié)合在蛋白的N-端作為泛素特異蛋白酶(u

29、biquitin-specific protease,UBP)剪切蛋白質(zhì)的標(biāo)記。研究發(fā)現(xiàn),如果將泛素C-端(Cub,第3576位氨基酸)與一個(gè)報(bào)告蛋白(通常是轉(zhuǎn)錄激活因子)構(gòu)成融合蛋白,讓它與N-端部分(Nub,第134位氨基酸)一起在酵母細(xì)胞中共表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nub與Cub能夠重新形成有功能的泛素(斷裂-泛素),并由UBP識(shí)別并切斷Cub-報(bào)告蛋白之間的共價(jià)鍵,結(jié)果報(bào)告蛋白從泛素中釋放出來(lái)。根據(jù)以上原理,Staglar等將Nub與蛋白X形成融合蛋白1,Cub-報(bào)告蛋白與蛋白Y形成融合蛋白2,二者在酵母細(xì)胞中共表達(dá),如果X與Y相互作用,則迫使Nub與Cub空間上相接近,重建一個(gè)有功能的泛素,報(bào)

30、告蛋白被UBP切割下來(lái)進(jìn)入細(xì)胞核中,激活特定報(bào)告基因的表達(dá)。通常用于構(gòu)建融合蛋白1的Nub使用一個(gè)點(diǎn)突變形式NubG，這樣就避免了Nub與酵母自身的Cub結(jié)合而出現(xiàn)假陽(yáng)性。該系統(tǒng)巧妙地解決了膜蛋白之間的相互作用與核報(bào)告基因的激活二者在空間上的矛盾。此系統(tǒng)的另一大優(yōu)點(diǎn)在于構(gòu)建融合蛋白的Nub及Cub均為40個(gè)氨基酸左右的小分子鏈,所以對(duì)靶蛋白之間相互作用可能造成的空間障礙的可能性就很小。利用該系統(tǒng),以proteinA-LexA-VP16（PLV）為報(bào)告蛋白, Johnnson證明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的亞基Wbplp與蛋白Ostlp之間存在相互作用,而與蛋白Alg5p之間不存在相互作用。雙誘餌

31、系統(tǒng)（two-bait system） 雙誘餌系統(tǒng)用2種誘餌結(jié)構(gòu)（一種編碼蛋白X1與LexA BD融合蛋白，另一種編碼X2與cl融合蛋白）分別與不同的DNA結(jié)合區(qū)域結(jié)合，激活2套不同的報(bào)告基因（一套報(bào)告基因?yàn)閘acZ或LEU2，另一套報(bào)告基因?yàn)長(zhǎng)YS2或gusA）來(lái)檢測(cè)蛋白相互作用。雙誘餌系統(tǒng)可以同時(shí)檢測(cè)、區(qū)分2個(gè)蛋白，該性質(zhì)已被用于檢測(cè)能與較大蛋白上特定基序相互作用的小分子及肽段。雙誘餌系統(tǒng)還可以在1次試驗(yàn)中同時(shí)用2種誘餌蛋白快速篩選文庫(kù)；同時(shí)還能用于篩選那些破壞蛋白之間相互作用的蛋白或其他小分子。這些性質(zhì)使得雙誘餌系統(tǒng)可以用于評(píng)價(jià)藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的破壞能力。三雜交系統(tǒng)兩個(gè)蛋白之間通過(guò)第

32、三者發(fā)生相互作用。第三物可以是蛋白質(zhì)、小分子或RNA。依賴(lài)于蛋白質(zhì)的三雜交系統(tǒng)有3種情況:兩個(gè)蛋白A和B之間的接觸由于第三蛋白Z而穩(wěn)定和加強(qiáng)。Elion等發(fā)現(xiàn)酵母的兩個(gè)信號(hào)傳遞蛋白Ste7和Ste 11，均與Ste5發(fā)生相互作用。缺失實(shí)驗(yàn)表明，它們與SteS的不同區(qū)域結(jié)合。使用Ste5菌株，含有LexAop-LacZ基因。在Ste5菌株中，B42-Ste11和LexA-Ste7的相互作用是很弱的。然而，Ste5的超表達(dá)使Ste11和Ste7的相互作用增強(qiáng)了6倍。這個(gè)實(shí)驗(yàn)也表明在沒(méi)有Ste5存在的條件下，Ste11和Ste7也可以接觸。蛋白A和B不直接接觸，而是通過(guò)另一蛋白Z相互作用，Z稱(chēng)作橋蛋

33、白。Wigler等發(fā)現(xiàn)信號(hào)傳遞蛋白R(shí)AS可以與RAF (RAS基因的一個(gè)下游影響因子)的N端相互作用，MEK(MAP激酶)與RAF的C端相互作用，并且二者通過(guò)RAF形成復(fù)合物。第三種蛋白Z的表達(dá)使蛋白A, B之間的相互作用更易于發(fā)生，而不是形成持續(xù)的穩(wěn)定的三蛋白復(fù)合物。目前，這方面唯一的例子是基于酪氨酸的磷酸化。Kochan等利用酵母三雜交系統(tǒng)，研究了酪氨酸磷酸化的作用。在這個(gè)系統(tǒng)中，除了誘餌和獵物外，還轉(zhuǎn)化了表達(dá)酪氨酸蛋白激酶Lck的質(zhì)粒，SHIP被磷酸化后，可以與Shc和Grb2發(fā)生作用。通過(guò)小分子(配體)相互作用的三雜交系統(tǒng)，小分子與其受體的相互作用不僅是許多生物學(xué)過(guò)程的基礎(chǔ)，而且在醫(yī)學(xué)

34、領(lǐng)域有重要的價(jià)值。Licitra等利用FK506與地塞米松雜合分子，將與LexA-BD融合的糖皮質(zhì)激素受體及雜合分子作為誘餌，用于篩選與AD融合的Jurkat cDNA文庫(kù)，分離了與FK506結(jié)合的蛋白FKBP12。通過(guò)RNA的三雜交系統(tǒng)，RNA與蛋白質(zhì)的相互作用是某些生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，如轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪切及RNA病毒與宿主之間的作用等。Wichens等提出了分析RNA與蛋白相互作用的方法。在這個(gè)系統(tǒng)中，與AD融合的蛋白是一個(gè)具有RNA結(jié)合域的蛋白(如細(xì)菌MS2)，能夠與RNA分子的臂-環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合；RNA除具有臂-環(huán)結(jié)構(gòu)外，還有誘餌序列(test)。這樣RNA分子與DB-蛋白復(fù)合物構(gòu)成了雙雜交

35、系統(tǒng)中的誘餌，它結(jié)合于報(bào)告基因的上游；第3個(gè)分子是AD-蛋白，如果該蛋白識(shí)別誘餌序列test并結(jié)合，則報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)用于確定識(shí)別目的RNA的蛋白質(zhì)的RNA結(jié)合域，也可以研究被已知蛋白質(zhì)識(shí)別的RNA序列。利用這個(gè)系統(tǒng)成功地發(fā)現(xiàn)了許多RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。包括鐵離子調(diào)節(jié)蛋白與鐵反應(yīng)元件的結(jié)合.HIV翻譯激活因子Tat與Tar反應(yīng)元件RNA序列的結(jié)合等。反向酵母雙雜交系統(tǒng) (reverse two-hybrid system)國(guó)外學(xué)者試圖利用在同一個(gè)配偶體(如作用缺陷等位基因)中的順式突變體，或是一些反式作用分子如解離蛋白、多肽及其它小分子等，使己存在的相互作用解離或減弱，從而對(duì)其功能

36、進(jìn)行研究。對(duì)于大規(guī)模文庫(kù)的選擇、等位基因的功能及一些小分子的作用等問(wèn)題，可以通過(guò)一種遺傳性篩選，這種篩選是基于解離蛋白質(zhì)間的相互作用而產(chǎn)生選擇優(yōu)勢(shì)。在這種情況下就產(chǎn)生了逆向雙雜交系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報(bào)告基因，在這一倒轉(zhuǎn)的雙雜交系統(tǒng)中，野生型BD-X/ AD-Y間的相互作用激活一種毒性標(biāo)志作為報(bào)告基因，對(duì)酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的陰性篩選，在此情況下BD-X/ AD-Y作用的解離賦予酵母一種選擇生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。利用這種方法能夠方便地鑒定作用缺陷等位基因、解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì)。不同的毒性報(bào)告基因均可提供陰性篩選，它們包括URA3和CYH2等。酵母URA3基因產(chǎn)物一方面為合

37、成尿嘧啶所必須，同時(shí)又能催化5-FOA（5-氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)，由于URA3即可作為陰性篩選標(biāo)志(在含有5-FOA的培養(yǎng)基中)，又可作為陽(yáng)性篩選標(biāo)志(在不含，F(xiàn)OA的培養(yǎng)基中)，所以應(yīng)用得更廣泛?？烧T導(dǎo)的逆向雙雜交報(bào)告基因SPAL；UAR3由以下成分組成，很低水平表達(dá)的順式抑制序列、一個(gè)Gal4p結(jié)合位點(diǎn)，它們被融合到同一個(gè)啟動(dòng)子下。另外，在同一個(gè)啟動(dòng)子下，含有Lex A結(jié)合位點(diǎn)的其它報(bào)告基因也是可以的。在含有這類(lèi)報(bào)告基因的酵母中野生型相互作用賦予細(xì)胞5-FOA敏感表型。在另一體系中，GAL1啟動(dòng)子下游使用了CYH2選擇標(biāo)志。此時(shí)野生型相互作用賦予酵母細(xì)胞放線菌酮(環(huán)己酰亞胺)敏感表型。在其他逆向雙雜交策略中，雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活Tet阻遏蛋白，從而抑制陽(yáng)性篩選標(biāo)志His 3的表達(dá)，此時(shí)野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷