葉綠素的測(cè)定分光光度法

1、XX行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)xx的測(cè)定(分光光度法)S L 881994Determination of chlorophyll(Spectrophotometric method)水利部1995/ 05/01批準(zhǔn)1995/05/01實(shí)施1總則1.1 主題內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用分光光度法測(cè)定水體中的葉綠素。1.2 適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于河流、湖泊、水庫(kù)或池塘等水體中葉綠素的測(cè)定。1.3 干擾及消除1.3.1 脫鎂葉綠素a能夠干擾葉綠素a的測(cè)定，當(dāng)含有脫鎂葉綠素時(shí)葉綠素a的測(cè)定值偏高。因此，在測(cè)定葉綠素a的時(shí)候，還要測(cè)定脫鎂葉綠素a1.3.2 脫鎂葉綠素a對(duì)葉綠素a的干擾，可通過(guò)測(cè)定葉綠素a酸化前后產(chǎn)生 的吸收峰之比

2、，對(duì)表觀葉綠素a的濃度作脫鎂葉綠素a的校正。2原理將一定量的試樣用微孔濾膜過(guò)濾，收集植物性浮游生物，用90%勺丙酮溶液提取。將提取液離心分離后，測(cè)定750、 663、645、630nm的吸光度，計(jì)算葉綠素的濃度。3儀器3.1 分光光度計(jì)。3.2 比色 xx: 10mm和 50mm。3.3 醫(yī)用離心機(jī)。3.4 離心管：1015mL帶塞刻度管。3.5 研缽：直徑約80mm。3.6 過(guò)濾裝置：過(guò)濾器，微孔濾膜（孔徑 0.45因1,直徑60mm）,真空泵（吸氣泵或蠕 動(dòng)泵）。3.7 常用實(shí)驗(yàn)設(shè)備。4試齊I4.1 碳酸鎂懸浮液：1% （m/V）。稱取1.0g細(xì)粉末碳酸鎂（Mg CO3）懸浮于100mL蒸

3、儲(chǔ)水中。每次使用時(shí)，要充分搖勻。4.2 丙酮溶液：90%（v/V）。在900mL丙酮中加100mL蒸儲(chǔ)水。4.3 鹽酸溶液：1mo 1/L。量取83mL鹽酸（p= 1.19g/mL）溶于水 中，冷卻并稀釋至1000mL。4.4 的采集與保存5.1 樣品應(yīng)按浮游植物定量采樣方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、 湖泊、水庫(kù)取500mL,池塘取300mL。5.2 采樣后，樣品應(yīng)放在蔭涼處，避免日光直射，最好立即對(duì)水樣進(jìn)行分析 處理。如需放置水樣，則應(yīng)避光冷藏保存（25C）,而且每升水樣需加1mL 1%碳酸鎂懸浮液，以防止酸化引起色素溶解。6步驟6.1 濃縮：在一定量的試樣中添加0.2mL碳酸鎂懸浮

4、液，充分?jǐn)噭蚝螅弥睆?60mm 的微孔濾膜吸濾。過(guò)濾器內(nèi)無(wú)水分后，還要繼續(xù)抽吸幾分鐘。如果要延時(shí)提取，可把載有濃縮樣品的濾膜放在干燥器里冷凍避光貯存。6.2 提?。簩⑤d有濃縮樣品的濾膜放入研缽中，加入 3mL丙酮溶液（4.2）至濾紙浸 濕的程度，把濾膜研碎，再少量地加 90%的丙酮溶液，把濾膜完全研碎，然后 用90%丙酮溶液將已磨碎的濾膜和丙酮溶液洗入帶刻度的帶塞離心管中，使離 心管內(nèi)提取液的總體積不超過(guò) 6mL,蓋上管塞，置于4c的暗處浸泡24 h。6.3 離心：將離心管放入離心機(jī)中，以 4000 r /m i n速度離心分離 20m i n。將上 清液移入標(biāo)定過(guò)的10mL具塞刻度管中，加

5、少量90%丙酮溶液于原提取液的離 心管中，再次懸浮沉淀物并離心，合并上清液。此操作重復(fù)23次，直至沉淀不含色素為止，最后將上清液定容至 10mL。6.4 測(cè)定：取上清液于10mm或50mm的比色池中，以90%丙酮溶液為對(duì)照溶液，讀 取波長(zhǎng)750, 663, 645和630nm的吸光度。選擇比色池的光程長(zhǎng)度或稀釋 度，使其光密度OD663大于0.2,小于1.0。7結(jié)果表示從各波長(zhǎng)的吸光度中減去波長(zhǎng) 750 nm的吸光度，作為已校正過(guò)的吸光度 D,按下式計(jì)算葉綠素的濃度：8注意事項(xiàng)8.1 使用的玻璃器皿和比色皿均應(yīng)清潔、干燥、無(wú)酸，不要用酸浸泡或洗8.2750 n m處的吸光度讀數(shù)用來(lái)校正混濁度。由于在 750nm的提取液的吸 光度對(duì)丙酮與水之比的變化非常敏感，因此對(duì)于丙酮提取液的配制要嚴(yán)格遵守 90份丙酮比10份水（體積比）的配比。8.3 使用斜頭離心機(jī)時(shí)，容易產(chǎn)生二次懸浮沉淀物。為了減少這一困難，使 用外旋式離心機(jī)頭，在離心之前瞬間加入過(guò)量的碳酸鎂。8.4 在研缽中用90%丙酮溶液提取葉綠素時(shí)，如果研磨操作進(jìn)行不充分，就 不能完全提取出來(lái)。也可以用外筒玻璃代替研缽，研棒用特氟隆制的勻化器。8.5 因?yàn)槿~綠素提取液對(duì)光敏感，故提取操作等要盡量在微弱的光照下進(jìn) 行。8.6 吸收池事先要用90%丙酮溶