丁苯酞通過抑制PGAM5介導(dǎo)的壞死性凋亡對試驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)揮保護(hù)作用

1、丁苯配通過抑制PGAM介導(dǎo)的壞死性凋亡對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠發(fā)揮保護(hù)作用多發(fā)性硬化MS是中樞神經(jīng)系統(tǒng)持久性的自身免疫性炎性、脫髓鞘疾病.多 發(fā)性硬化的病理特點(diǎn)是白質(zhì)脫髓鞘、炎癥、軸索損傷及血腦屏障的破壞.多發(fā)性硬化的病因至今未明,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可能和病毒感染、遺傳背景、環(huán)境 因素有關(guān).因此,多發(fā)性硬化可能不僅單純是一種疾病,而是綜合征,表現(xiàn)為炎性脫髓 鞘及多種發(fā)病機(jī)制.由于多發(fā)性硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,近年來,有研究認(rèn)為,壞死性凋亡參與了多發(fā)性硬 化的發(fā)病機(jī)制.調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡在機(jī)體的生長發(fā)育及維持組織動(dòng)態(tài)平衡方面 起到重要作 用.壞死性凋亡是一種新型的調(diào)節(jié)壞死的通路,它是一種程序性的細(xì)胞死亡

2、.一直以 來,人們認(rèn)為,凋亡是唯一的調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的方式,而壞死是不可調(diào)控的,是偶然的死亡 方式.近年來大量的證據(jù)說明,壞死性凋亡是調(diào)節(jié)壞死最好的方式之一.我們許多對壞死性凋亡通路的了解源于 TNF-a通路,TNF- a和TNFR1結(jié)合,然后激活下游 的壞 死小體RIPK1-RIPK3-MLKL最后由與線粒體相關(guān)的 PGAM5-DRP軸完成壞死性凋亡.丁苯酰是一種人工合成的復(fù)合物,源于芹菜籽的提取物.丁苯?？梢员Ｗo(hù)缺血引起的的腦組織損傷,對神經(jīng)細(xì)胞的死亡起到保護(hù)作用,提升腦血流量,保護(hù)血 腦屏障, 除此之外,丁苯酰還有抗炎,抗血栓,抗凋亡,保護(hù)線粒體的作用,基于它 對線粒體 的保護(hù)作用,我們認(rèn)為

3、丁苯儆可能對EAE對治療有益.多發(fā)性硬化的模型不止一種,針對該疾病的研究方向不同,選擇不同的疾病 模型. 實(shí)驗(yàn)性自身性免疫性腦脊髓炎 EAE 是多發(fā)性硬化最常應(yīng)用的模型.我們的實(shí)驗(yàn)采用MOG35-5免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型,觀察丁苯醐干預(yù) 后, 是否對EAE小鼠起到了神經(jīng)保護(hù)作用,沉默壞死性凋亡通路中的 PGAM基因,觀察是 否保護(hù)了 EAE小鼠的神經(jīng)功能.體外實(shí)驗(yàn),培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,探討丁苯 配對EAE 小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制,找到該藥的潛在治療靶點(diǎn).第一局部丁苯醐對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎保護(hù)作用及對壞死性凋亡的影響目的：建立最經(jīng)典的多發(fā)性硬化的小鼠模型,利用丁苯儆干預(yù)

4、,觀察實(shí)驗(yàn)小鼠 發(fā)病后,對藥物的反響,應(yīng)用HE染色、電鏡、Western Blot的方法,檢測丁苯醐 是否對EAE小鼠 有神經(jīng)保護(hù)作用及對壞死性凋亡通路中蛋白的影響.方法：1.實(shí)驗(yàn)小鼠的選用,建立動(dòng)物模型.應(yīng)用C57BL/6雌性小鼠,為8-10周齡,約為18-20g的體重,應(yīng)用MOG35-55作為免 疫原,然后參加等體積的完全弗氏佐劑 CFA及一定含量的結(jié)核菌素相互 混,使結(jié)核 桿菌H37Ra的終濃度為4mg/ml,給予小鼠背部皮下注射,并分別于免疫 的當(dāng)天及第2天, 分別分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素PTX,建立EAE小鼠模 型.2.將實(shí)驗(yàn)小鼠隨 機(jī)分為正常對照組、EAE組及丁苯醐治療組

5、.自發(fā)病后的第一天起,丁苯醐組小鼠每日腹腔注射丁苯醐 80mg/kg,正常對 照組小 鼠及EAE模型組小鼠自發(fā)病后的第1天起,每日給予等量的DMS及生理鹽 水溶液腹 腔注射.3.自免疫后的第1天起,分別由兩名實(shí)驗(yàn)員分兩個(gè)時(shí)間段采用 雙盲法于每天 早晚8： 00和16： 00兩次對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分并稱重.神經(jīng)功能評分使用的是評分更為詳細(xì)的Weave' s 15分法.4.組織病理學(xué) 觀察用HE染色觀察實(shí)驗(yàn)小鼠脊髓腰膨大處炎性細(xì)胞浸潤情況.5.用透射電鏡觀察,實(shí)驗(yàn)小鼠線粒體的變化及髓鞘的變化.6.用WesternBlot的方法,檢測各組實(shí)驗(yàn)小鼠壞死性凋亡通路上蛋白及炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)變化

6、.7.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)量資料以“均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差x±s 表示.對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn).多組計(jì)量資料均數(shù)的比擬應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn),組間兩兩比擬用LSD檢驗(yàn).以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果:1. 丁苯醐干預(yù)EAE小鼠,可以緩解EAE/ 小鼠的臨床病癥,降低EAE/小鼠神經(jīng)功能學(xué)評分；2. 丁苯醐藥物干預(yù)EAE小鼠,可以減 少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性細(xì)胞的浸潤；3. 丁苯醐藥物干預(yù)EAE/小鼠,通過透射電鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)丁苯酰可以保護(hù)線粒體,減輕脫髓鞘的程度.4. 丁苯醐下調(diào)了壞死性凋亡通路上蛋白及炎性蛋白的表達(dá)：TNF

7、a和TNFR1表達(dá)較模型組下調(diào)RIPK1、RIPK3 MLKL表達(dá)較模型組下調(diào)PGAM5 DRP俵達(dá)較 模型 組下調(diào),IL-1 B的表達(dá)較模型組下調(diào).第二局部沉默 PGAM基因表達(dá)對實(shí)驗(yàn) 性自身免疫 性腦脊髓炎小鼠的影響目的：建立EAE的小鼠動(dòng)物模型,沉默PGAM5基因,觀察PGAM 基因沉默組和EAE小鼠模型組,脊髓炎性細(xì)胞浸潤情況的變化,脊髓中 PGAM5,DRP1,p-DRP 蛋白表達(dá)的變化,PGAM5,TN a ,IL-1 B轉(zhuǎn)錄水平的變 化,并觀察 線粒體及髓鞘在這個(gè)過程的變化.為沉默PGAM基因是否能保護(hù)EAE小鼠的神經(jīng)功能提供理論依據(jù).方法：1.實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物的選用,動(dòng)物模型的建立.

8、選用清潔級的雌性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,周齡大約為8-10周,體重大 約為 18-20g,應(yīng)用MOG35-5作為免疫原,然后參加等體積的完全弗氏佐劑CFA及一定含量的結(jié)核菌素相互混,使結(jié)核桿菌H37Ra的終濃度為4mg/ml,給予小鼠 背部皮下注射, 并分別于免疫的當(dāng)天及第 2天,分別分兩次腹腔注射0.5ml百日咳 毒素PTX,建立EAE 小鼠模型.2.病理組織學(xué)的觀察沉默的PGAM基因,干預(yù)EAE小鼠,在疾病的頂峰期,取 實(shí)驗(yàn)小鼠的脊髓腰膨大,用HE染色的方法,觀察實(shí)驗(yàn)小 鼠脊髓腰膨大炎細(xì)胞浸潤的情 況.3. Western Blot檢測沉默的PGAM基因,干預(yù)EAE小鼠,取疾病頂峰

9、期實(shí)驗(yàn) 小鼠 的脊髓檢測PGAM、DRP1 p-DRP1蛋白的表達(dá)水平的變化.4.qRT-PCR 方法檢測 沉默的PGAM基因,干預(yù)EAE小鼠,取疾病頂峰期實(shí)驗(yàn)小鼠的脊髓,檢測各 組PGAM、 TNFa、IL-1 B mRNA勺轉(zhuǎn)錄水平的變化.5.透射電鏡觀察沉默PGAM基因,在疾病的頂峰期取各組實(shí)驗(yàn)小數(shù)的脊髓,用透射電 鏡觀察實(shí)驗(yàn)小鼠線粒體及髓鞘的變化.6.采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行 統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)量資料以“均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差 x«表示.對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊 性檢驗(yàn).多組計(jì)量資料均數(shù)的比擬應(yīng)用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn),組問兩兩比擬用LSD檢驗(yàn).以 P<

10、0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果:1.EAE模型組實(shí)驗(yàn)小鼠病理組織切片呈現(xiàn)出彌漫性的炎性細(xì)胞,EAE+PGAMShRNA fi炎性細(xì)胞明顯減少.2.沉默PGAM基因,用Western blot在脊 髓組織中檢測到,PGAM5勺表達(dá),EAE組較正常對照組表達(dá)升高,在沉默組,表達(dá)明顯低 于EAE組,在EAE組小鼠較正常對照組小鼠 DRP俵達(dá)上調(diào),在沉默組,表達(dá)下調(diào).P-DRP的表達(dá),在EAE組較正常對照組降低,在PGAM沉默組較EAE組升高.3. 用qPCF檢測PGAM5TNF a、IL-1 B在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化,在EAE組中,PGAM5表 達(dá)較正常組升高,在PGAM沉默組,PGAM5勺表達(dá)水

11、平較EAE組降低TNFa的表達(dá)水平在EAE組較正常組上調(diào),在PGAM沉默組較EAE組表達(dá)下調(diào).IL-1 B mRN的轉(zhuǎn)錄水平在EAE組較正常組表達(dá)升高,在基因沉默組較EAE組表達(dá) 下調(diào).4.沉默PGAM基因,EAE小鼠的脫髓鞘程度減輕,線粒體的結(jié)構(gòu)相對完整.第 三 局部丁苯醐通過調(diào)制PGAM抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的壞死性凋亡目的：利用BV2小膠質(zhì)細(xì)胞, 制造壞死性凋亡的模型,研究丁苯醐對壞死性凋亡通路中 PGAM5-DRFP由的作用,進(jìn)一 步探討丁苯醐治療EAE小鼠的作用機(jī)制.方法:1.選取BV2小膠質(zhì)細(xì)胞,將細(xì)胞培養(yǎng)于高糖DME培養(yǎng)基中,其中含有10%勺 胎牛血清、100 P g/ml的鏈霉素、10

12、0U/ml的青霉素.在恒定濕度的培養(yǎng)箱(溫度37C , 含5%CO2中培養(yǎng).2,壞死性凋亡的模型建立以及藥物、病毒干預(yù).把 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分為7組,待細(xì)胞長到50%-60%寸,在第4組中參加腺病毒攜帶的沉默的 PGAM基因,第5組 中參加第4組的空病毒對照,第6組中參加腺病毒攜帶的過表達(dá) PGAM基因,第7組 中參加過表達(dá)空病毒對照,21h,分別于第3、6、7組參加丁苯醐(10uM),24h,同時(shí)參加 造模藥物TNF-a(50ng/ml)及Z-VAD-FMK(50umol/L),建立壞死性凋亡 模型,48h,收集7 組細(xì)胞,進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測.3,用qRT-PCR勺方法,檢測不同組BV2細(xì)胞

13、中,IL-1 a和IL-1 B mRN的表達(dá).4. Western Blot檢測不同組 BV2細(xì)胞中)PGAM5 DRP1 p-DRP1 的蛋白表達(dá)5.采用 SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.計(jì)量資料以“均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差 (x太)表示.對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn).多組計(jì)量資料均數(shù)的比擬應(yīng)用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn),組問兩兩比擬用LSD檢驗(yàn).以 P&lt；0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.結(jié)果：1.在模型組中,IL-1 a mRN的轉(zhuǎn)錄水平較正常對照組表達(dá)上調(diào).模型 +shPGAM組IL-1 a mRN的轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)下調(diào).模型+shPGAM空病毒對照組IL-1 a

14、mRN的轉(zhuǎn)錄水平較模型組未見明顯差異.模型+ 丁苯醐組IL-1 amRNA勺轉(zhuǎn)錄水平較模型組明顯下調(diào).模型+NBP過表達(dá)PGAM腺病毒組IL-1 amRN的轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)無明 顯差 異.模型+NBP過表達(dá)空病毒對照組IL-1 amRNA勺轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)下 調(diào).2.應(yīng)用PCR方法,檢測IL-1 B在mRNA勺轉(zhuǎn)錄水平的變化.在模型組中,IL-1 B mRN 轉(zhuǎn)錄水平較正常對照組表達(dá)上調(diào).模型+shPGAM組IL-1 B mRN的轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)下調(diào). 模型+shPGAM5空 病毒對照組IL-1 B mRNA勺轉(zhuǎn)錄水平較模型組未見明顯差異.模型+ 丁苯醐組的IL-1 B mRNA勺

15、轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)下調(diào).模型 +NBP過 表 達(dá)PGAM腺病毒組IL-1 B mRNA勺轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)無明顯差異.模型+NBP過表達(dá)空病毒對照組IL-1 B mRNA勺轉(zhuǎn)錄水平較模型組表達(dá)下調(diào).3.用Western Blot的方法檢測7組細(xì)胞PGAM蛋白表達(dá)情況：在模型組中,PGAM5勺 蛋白表達(dá)水平較正常對照組上調(diào).模型+shPGAM組PGAM的蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào).模型 +shPGAM空病毒 對照組較模型組PGAM的蛋白表達(dá)水平較模型組未見明顯差異.模型+ 丁苯醐組PGAM的蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào).模型 +NBP過表達(dá)PGAM腺病毒組PGAM的蛋白表達(dá)水平較模型組表達(dá)無明顯差

16、異.模型+NBP過表達(dá)空病毒對照組PGA M的蛋白表達(dá)水平較模型組表達(dá)下調(diào)4,用Western Blot的方法檢測7組細(xì)胞DRP1蛋白表達(dá)情況：在模型組中DRP1的 蛋白表達(dá)水平較正常對照組明顯上調(diào).模型+shPGAM組DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào).模型 +shPGAM空病毒 對 照組較模型組DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組未見明顯差異.模型+ 丁苯醐組DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組下調(diào).模型+NBP過表達(dá)PGAM5腺 病毒組DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組表達(dá)無明顯差異.模型+NBP過表達(dá)空病毒對照組DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組表達(dá)下調(diào).5.用Western Blot的方法檢測7組細(xì)胞p-DRP1蛋白表達(dá)情況：在模型組中,p-DRP1的蛋 白表達(dá)水平較正常對照組下調(diào).模型+shPGAM組p-DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組上調(diào).模型 +shPGAM空病 毒 對照組較模型組p-DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組未見明顯差異.模型+ 丁苯醐組P-DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組上調(diào). 模型+NBP過表達(dá)PGAM 腺病毒組p-DRP1的蛋白表達(dá)水平較模型組表達(dá)無明顯差異.模型+NBP過表達(dá)空病毒對照組D