核因子κB在原代神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注的表達

1、核因子B在原代神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注的表達 作者：田曄，萬琪，劉勇紅，李力 【關(guān)鍵詞】 再灌注損傷 【Abstract】 AIM: To explore the expression of nuclear factor NFB in primary cultured mouse fetus neurons. METHODS: The neurons primarily cultured in vitro after ischemialike reperfusion, and the expression of NFB was assayed by immunofluorescence and fl

2、ow cytometry. RESULTS: Immunofluorescence results showed that the expression of NFB increased and moved from cytoplasm to nuclear. Flow cytometry results showed that the expression of NFB was 1.28% (before ischemiareperfusion) and 38.72% (after ischemiareperfusion). CONCLUSION: NFB exits in neural c

3、ells and after ischemiareperfusion injury it will be activated, move from cytoplasma to nuclei and play a regulatory role of gene transcription. 【Keywords】 NFB; neuron; reperfusion injury 【摘要】目的： 觀察核因子B（nuclearfactorB，NFB）在胎鼠原代神經(jīng)細(xì)胞中的表達及轉(zhuǎn)移情況并討論其意義. 方法： 體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)類缺血處理后再復(fù)氧,用免疫熒光抗體染色、流式細(xì)胞儀檢測NFB的表達. 結(jié)

4、果： 免疫熒光抗體染色顯示，缺血再灌注后NFB表達增高并由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，流式細(xì)胞儀檢測示缺血再灌注前后NFB的表達分別為1.3%和38.7%，有顯著性差異（P<0.01）. 結(jié)論： NFB存在于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，缺血再灌注后NFB被激活并由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，發(fā)揮其基因調(diào)控作用. 【關(guān)鍵詞】 核因子B；神經(jīng)元；再灌注損傷 0引言 核因子B（nuclearfactorB, NFB）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，存在于真核細(xì)胞中，參與許多基因的表達調(diào)控. 靜息狀態(tài)下，NFB與抑制蛋白（inhibitorB, I B）形成復(fù)合體，以無活性形式存在于胞質(zhì)中. 當(dāng)細(xì)胞受刺激后，NFB活化，進入細(xì)胞核與相應(yīng)靶基

5、因結(jié)合，可表達各種粘附分子、組織因子、一氧化氮合酶等1-3. Howard等4用體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC）缺血再灌注后，發(fā)現(xiàn)NFB表達均上調(diào). 我們采用體外培養(yǎng)的胎鼠原代神經(jīng)細(xì)胞,參照Mitani等5建立的神經(jīng)元類缺血方法,對其類缺血后再復(fù)氧并進行免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測. 觀察NFB在神經(jīng)元中的表達及其分布情況，證實其被激活后胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核的過程. 1材料和方法 1.1材料孕15 d昆明種二級孕鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供. 胎牛血清由杭州四季青公司提供，DMEM由Gibco公司提供，胰酶由華美公司提供. 兔抗鼠NFB p65多克隆抗體（識別1286氨基酸序列）由美國S

6、anta公司提供,異硫氰酸熒光素(flourescern isothiocyanate,FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG由華美公司提供,CO2培養(yǎng)箱由SANYO公司提供. 1.2方法 1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取孕15 d昆明種二級孕鼠，引臼脫頸處死,消毒后，無菌操作，取出胎鼠,暴露胎鼠腦部,顯微鏡下分離胎鼠大腦皮質(zhì),剪碎腦組織,經(jīng)125 mg・L-1胰酶消化(37, 15 min),離心1000 r・min-1, 10 min, 棄上清,200 mL・L-1胎牛血清的DMEM終止消化,以完全培養(yǎng)基(10 mL・L-1胎

7、牛血清,青、鏈霉素1×105 U・L-1)稀釋至7×108・L-1密度并接種于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的專用培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶,送 入50 mL・L-1 CO2 的培養(yǎng)箱, 37,培養(yǎng)48 h后,加入阿糖胞苷(5 mg・L-1)以抑制非神經(jīng)元的繼續(xù)生長,每隔48 h半量換液,培養(yǎng)10 d后,可見典型的神經(jīng)元，經(jīng)tubulin免疫熒光染色顯示80%以上細(xì)胞為陽性，可認(rèn)為是純神經(jīng)元培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗. 1.2.2類缺血模型建立細(xì)胞培養(yǎng)基換為不含糖的人工腦脊液，其組成為(mmol・

8、L-1)：NaCl 123; KCl 3.75; KH2PO4 1.25; NaHCO3 26; MgCl2 1; CaCl2 2；葡萄糖10； pH 7.4:溫度保持在(30±2)，混合氣體換為含80 mL・L-1 CO2 的氮氣6. 類缺血處理10 min,將人工腦脊液更換為培養(yǎng)基放回孵箱行再復(fù)氧. 1.2.3免疫熒光抗體染色將類缺血處理后再復(fù)氧30 min的神經(jīng)細(xì)胞分為一組即缺血再灌注組,另設(shè)一組為未缺血組. 再設(shè)一組單加抗，作為非特異性結(jié)合對照. 各組分別加1200稀釋后的兔抗鼠 NFB p65， 4， 24 h. 10 mmol・

9、L-1 PBS洗滌，加150稀釋后的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫1 h；500 g・L-1緩沖甘油封片，置熒光顯微鏡下觀察. 1.2.4流式細(xì)胞儀計數(shù)檢測將接種于培養(yǎng)瓶中的原代神經(jīng)細(xì)胞（1×106/瓶）分為2組,一組未經(jīng)類缺血處理,另一組經(jīng)類缺血處理后再復(fù)氧30 min. 用2.5 g・L-1胰蛋白酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液,經(jīng)離心洗滌后加入1200 NFB p65多克隆抗體200 L，置37 45 min，用10 mmol・L-1 PBS洗滌離心棄上清，加入150 FITC標(biāo)記的抗兔IgG 200 L，置4 45

10、min. 另設(shè)兩組陰性對照，一組不加抗和抗，用于熒光強度的基線校正；另一組單加抗，作為非特異性結(jié)合對照，所有樣品分別加入400 L 10 mmol・L-1 PBS液上機檢測，并將試驗重復(fù)兩次，結(jié)果取均值. 統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果以x±s表示，兩組間比較用方差分析. 2結(jié)果 2.1NFB p65的表達部位免疫熒光抗體染色見未缺血組NFB p65僅表達于神經(jīng)元胞質(zhì),熒光強度(+)（Fig 1）；缺血再灌組NFB p65主要表達于胞核,熒光強度()(Fig 2). 2.2NFB p65的表達率在神經(jīng)元中基礎(chǔ)表達為1.3%,經(jīng)缺血再灌注后30 min表達升高,達38.7%（P

11、<0.01）. 非特異性結(jié)合組表達為0.1%. 3討論 在體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，缺氧復(fù)氧模型能較好地模擬缺血再灌注對細(xì)胞內(nèi)造成的損害. 本試驗免疫熒光抗體染色表明：NFB p65存在于胎鼠原代神經(jīng)細(xì)胞中，未被激活時僅存在于胞質(zhì)中，基礎(chǔ)表達率很低，似以軸丘部表達稍高. 經(jīng)缺血再灌注后，NFB p65轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，在胞核內(nèi)表達明顯增高，胞質(zhì)仍有少量表達. 流式細(xì)胞儀計數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的原代神經(jīng)細(xì)胞未缺氧時NFB表達很低，經(jīng)缺血再灌注后，其表達明顯增高達30倍，這均說明在此過程中NFB被激活，并轉(zhuǎn)入核內(nèi)發(fā)揮其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用. 圖1未缺血組NFB 的表達（略） Fig 1Expres

12、sion of NFB in noischemia×400（略） 圖2缺血再灌組NFB 的表達（略） Fig 2Expression of NFB in ischemia /reperfusion×400（略） NFB存在于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞中，主要定位于突觸部位即可存在于突觸前末端、突觸后區(qū)域及核周胞質(zhì)內(nèi)，能快速接受外界信息，由局部突觸信號誘導(dǎo)其活化. 活化的NFB可由軸突逆行運輸進入胞核，將突觸信號傳至核內(nèi)，并與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其生物學(xué)作用7，8，是炎癥、免疫、腫瘤和急性期反應(yīng)的核心調(diào)控因素. 近年來有資料表明，腦缺血再灌注損傷后，NFB活

13、化，致多種粘附分子表達增加4，9,中性白細(xì)胞在粘附分子的介導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細(xì)胞滾動、粘附并外滲,引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng). 造成白細(xì)胞向缺血區(qū)聚集，這種炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注神經(jīng)元損傷中起重要作用. 本研究探討了NFB在胎鼠原代神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注后的表達情況及由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核的過程，為進一步明確其在腦缺血再灌注損傷炎癥機制中的意義奠定基礎(chǔ). 【參考文獻】 1 Karin M, BenNerih Y. Phosphorlation meets ubiquition: The control of NFKb activity J. Annu Rev Immunol, 2000; 18: 621-663. 2

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