PCR過程問題全解分解

1、如何防止PCF成引物二聚體?在PC所的電泳帶形成很寬很亮的帶，對照marker時(shí)都不容易看出其大小，具體是什么原因呢？ PCR時(shí)模板DNA濃度一般是多少最合適？答：1這條亮帶如果在100bp一下就可以考慮是引物二聚體了，形成引物二聚體的原因很多，如引物設(shè)計(jì)的不好，在兩端容易形成回文結(jié)構(gòu)或是兩條引物之間也可能會互補(bǔ)配對；退火溫度沒有達(dá)到最佳，實(shí)在不行就做個(gè)溫度梯度吧；再就是試著改變一下循環(huán)數(shù)，也許會有幫助。PCR模板大約在104-106個(gè)拷貝。答2:我覺得是目的條帶含量太多了，如果點(diǎn)樣太多，負(fù)載量太大，就會造成跑膠時(shí)條帶太寬?？梢栽囍鴾p少模板量，稀釋10倍或是減少循環(huán)數(shù)。答3: 1,從引物自身著

2、手，重新設(shè)計(jì)引物，這是最根本解決這一問題的辦法；2 .可能模板有問題；PC所的電泳帶形成很寬很亮的帶，可能是模板濃度過高或者循環(huán)次數(shù)過多所導(dǎo)致；3 . Taq酶，引物，Mg2蟀度可能過高，可降低它們的濃度；4,取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的yU水中煮 5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會消失的；5,所配MIX中加5%勺甘油或者5%勺DMSQ可以增強(qiáng)特異性；6. PC或應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加 TAq酶，PCR吉束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時(shí)間，有人認(rèn)為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。7,增加循環(huán)數(shù)可以適當(dāng)降低引物

3、二聚體；8,降低退火溫度后有條帶，則應(yīng)逐漸提高溫度，若提高溫度的同時(shí)產(chǎn)物量減少，則考慮增加鎂離子濃度（根據(jù)擴(kuò)增片斷長度而定，片段長則相應(yīng)鎂離子濃度應(yīng)該高一些）；9,若降低退火溫度，發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，而且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有區(qū)別，則考慮 Buffer等試劑沒有完全融解、混勻，導(dǎo)致吸取的試劑濃度不對。10,以上次的pcr產(chǎn)物作模板二次pcr,可以提高引物與模板的特異性，減少引物二聚體，如果兩次時(shí)間間隔短的話，可以把原產(chǎn)物稀釋100 1000倍，如果間隔較長可以稀釋50- 100 倍。PCR陰性的原因分析PCR的假陽性問題是在 PC做生之初就被深刻認(rèn)識到了，同時(shí)由于造成假陽

4、性的因素相對單一，因此假陽性并不是困惑檢驗(yàn)工作的主要原因。如果一個(gè)項(xiàng)目只是陽性率高敏感性好的話，那么可以認(rèn)為其陰性結(jié)果具備很高的可排除性，仍然有相當(dāng)?shù)呐R床適用價(jià)值。但PCR的假陰性在檢驗(yàn)工作中仍很嚴(yán)重，并且用些因素經(jīng)常被人忽略，嚴(yán)重的影響了PCR的使用?？梢韵胂笠环N假陽性和假陰性都很高的項(xiàng)目，有什么樣的診斷價(jià)值。造成PCR（Bl陰性的原因是復(fù)雜的，也是多樣的。主要有：1 .PCR儀本身的質(zhì)量問題。 PCR儀設(shè)計(jì)原理上的差異和經(jīng)常出現(xiàn)的質(zhì)量問題（如：溫控不準(zhǔn)等）給臨床帶來了諸如非特異性擴(kuò)增（假陽性）、擴(kuò)增效率下降（假陰性）等問題.2 .離心機(jī)問題。離心機(jī)的質(zhì)量或使用不正確，造成離心標(biāo)本模板沒有分

5、離出來造成假陰性，竊以為這是最易被忽視的問題。其時(shí)離心機(jī)使用問題不僅在PCR在整個(gè)檢驗(yàn)工作中都是最易被忽視的問題，只是因?yàn)樵谄渌ぷ髦胁幌驪CRIB樣明顯影響檢測結(jié)果罷了。離心機(jī)是常用的固液分離設(shè)備， 其利用離心過程中的離心力而將密度不同的物質(zhì)分離出來。因此離心機(jī)的關(guān)鍵在于離心加速度而不是轉(zhuǎn)速，根據(jù)牛頓定律可知離心力加速度與轉(zhuǎn)速和有效半徑的有關(guān)的，因此對于不同有效半徑的離心機(jī)相同的轉(zhuǎn)速其離心加速度是不同的，轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)要因離心機(jī)而異，但很遺憾，日常工作中忽視了這個(gè)問題。有效半徑短的離心加速度就小，同樣的時(shí)間離心效果就差可能造成分離不出導(dǎo)致假陰性。同時(shí)由于高速離心機(jī)高速旋轉(zhuǎn)與空氣摩擦?xí)a(chǎn)生大量的熱

6、，因此對于稱能上幾萬轉(zhuǎn)/分而沒有抽真空的離心機(jī)實(shí)際轉(zhuǎn)速本人持懷疑態(tài)度。3 .試劑開殼劑和操作問題造成標(biāo)本DN破有暴露出來，致使擴(kuò)增無法進(jìn)行，這是造成假陰性的又一主要因素。問題1:無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無原因：1 .模板：含有抑制物，含量低2 .Buffer對樣品不合適3 .引物設(shè)計(jì)不當(dāng)或者發(fā)生降解4 .反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時(shí)間太短對策：1 .純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA加大模板的用量2 .更換Buffer或調(diào)整濃度3 .重新設(shè)計(jì)引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物4 .降低退火溫度、延長延伸時(shí)間問題2:非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者

7、非特異性擴(kuò)增帶原因:1 .引物特異性差2 .模板或引物濃度過高3 .酶量過多4 .Mg2+濃度偏高5 .退火溫度偏低6 .循環(huán)次數(shù)過多對策：1 .重新設(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR2 .適當(dāng)降低模板或引物濃度3 .適當(dāng)減少酶量4 .降低鎂離子濃度5 .適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法6 .減少循環(huán)次數(shù)問題3:拖尾現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)。原因：1 .模板不純2 .Buffer 不合適3 .退火溫度偏低4 .酶量過多5 .dNTP、Mg 2+濃度偏高6 .循環(huán)次數(shù)過多對策：1 .純化模板2 .更換 Buffer3 .適當(dāng)提高退火溫度4,適量用酶5 .適當(dāng)降低dNT可口鎂離子的濃度6 .減

8、少循環(huán)次數(shù)問題4:假陽性現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物原因：靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交*污染對策：1 .操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外；2 .除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3,各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存請問PCR引物存放時(shí)間是多少？這要看是什么狀態(tài)，要是粉末的話，在-20度可以存放好幾年；要是已經(jīng)把引物稀釋成液體狀態(tài)的話，存放時(shí)間就要短一點(diǎn)了，但也可以存放一年左右的時(shí)間，甚至更長。不過這也要看你們實(shí)驗(yàn)室的冰箱是不是經(jīng)常開啟，要是是的話，存放時(shí)間就很受影響， 實(shí)驗(yàn)室的冰箱就是經(jīng)常打開，而且有時(shí)候大家找東西

9、要找好長時(shí)間，所以引物總是用半個(gè)多月的時(shí)間，效力就下降了，PC所的條帶明顯就沒有以前亮了。建議你合成引物的時(shí)候，讓公司每個(gè)OD分裝成一管，每次你用的時(shí)候，取一管稀釋成使用濃度；或者先稀釋到儲存濃度，分裝后要用的時(shí)候再稀釋到使用濃度。另外一定要注意避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會使存放時(shí)間變短的。最簡單的就是分裝了 ，以儲存濃度保存，稀釋10或20微升，就可以用好些次，即可避免反 復(fù)凍融還可以避免整管引物都被污染.干粉-20度可以保存一年，稀釋后- 20度可以保存半年?？梢韵认♂尦?00uM,分裝成幾管。然后再稀釋成50uM和20uM的。每次用20uM的做PCR可。盡量避免反復(fù)凍融。稀釋用的水PH值要求

10、大于7 (TE比滅菌去離子水好)，并且無菌。真空干燥的DNAli干膜狀或粉末狀在離心管底部，開啟瓶蓋時(shí)小心不要丟失稀釋方法：1 OD260引物干粉約為33微克；堿基的平均分子量為 324.5 ;引物的分子量 成基數(shù)x堿基的平均分子量；引物的摩爾數(shù)= 質(zhì)量數(shù)/引物分子量舉例：一管標(biāo)明為 2 OD的20堿基的引物，分子量=20 x 324.5=6490 質(zhì)量數(shù)=2 x 33 =66 科 g摩爾數(shù)=66 / 6490 =0.010 科 mol= 10 nmol若您需要溶解為 10 dM(=10pmol/科l)的溶液，只需加 10/=10pmol/ul,=1mlddH2O 充分 溶解即可。如何提高PC

11、R反應(yīng)的特異性引物引物設(shè)計(jì)：引物長度適當(dāng)，18-24mers ,并保證序列獨(dú)特性，以降低序列在非目的片段中存在的可能性，但長度大于24核昔的引物并不意味著有更高的特異性，較長的序列可能會與錯(cuò)誤配對序列雜交，反而降低特異性，而且長序列比短序列雜交慢，影響產(chǎn)量；引物濃度：引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度一般在0.1到0.5科M較高的引物濃度會導(dǎo)致非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。-生物秀實(shí)驗(yàn)頻道Mg2+較高的Mg2蟀度可以增加產(chǎn)量，但也會降低特異性。為了確定最佳濃度，從1mMi 113mM 以0.5mM遞增，進(jìn)行最適Mg2瞇度測定退火溫度Tm對于設(shè)定PCR!火溫度是必需的。退火溫度一般設(shè)定為比引物的Tm低5

12、c的溫度。合理的退火溫度為 55-70 C。在理想狀態(tài)下，退火溫度應(yīng)足夠低，以保證引物同目的序列有 效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合巢式PCRPCR使用巢式引物進(jìn)行連續(xù)多輪擴(kuò)增，由于同兩套引物都互補(bǔ)的靶序列很少，巢式的使用降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性，從而提高PC即應(yīng)的特異性和靈敏度遞減PCR通過在PCR的前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5 C的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低 1 C到2 C ,直到退火溫度低于 Tm5 C。這樣， 特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴(kuò)增，并在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢熱啟動(dòng)PCR通過抑制一種基本成分延遲 DNA合成，直

13、到PCR儀達(dá)到變性溫度。最常用的是熱啟動(dòng) DNA聚合酶，常溫時(shí)該酶活性被抑制，94-95 C加熱數(shù)分鐘后回復(fù)正常活力開始反應(yīng)，這樣可以避免起始循環(huán)溫度下的非特異性擴(kuò)增，大大提高了 PC阪應(yīng)的靈敏度及特異性。 熱啟動(dòng)PC幅除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR寺異性最重要的方法之一PCR曾強(qiáng)齊IJ包括甲酰胺，DMSQ甘油，甜菜堿等，能構(gòu)降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助 DNAm合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。PCR擴(kuò)增過程中常見的問題及解決方法PCR技術(shù)具有高度的特異性、選擇性、靈敏性，而且快速、簡便、易于自動(dòng)化，因此在 臨床醫(yī)學(xué)工作中受到廣泛的重視及合理的應(yīng)用。目前在我國許多基層醫(yī)療單位均已相繼開展P

14、CRW究用應(yīng)用工作。PCR技術(shù)很簡單，原理也很清楚，因此有條件的單位都能較順利地上 馬，但畢竟PCR技術(shù)是一種新生事物，受到許多條件因素的影響，所以要做得好也不容易。在PC叱術(shù)應(yīng)用過程中會遇到這樣或那樣的問題，更甚至?xí)玫脚c事實(shí)完成相反的結(jié)果。為了使我們能夠順利地開展 PCRT作，更好地發(fā)揮 PCFa術(shù)的工具作用，我們根據(jù)多年來PCR工作總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)，對PCFT增過程中經(jīng)常出現(xiàn)的一些問題進(jìn)行簡要的總結(jié)，提供給廣大科研工作者作為參考，拋磚引玉，不足之處歡迎指正。一、假陽性擴(kuò)增在實(shí)驗(yàn)過程中有時(shí)會碰到所檢驗(yàn)的樣本全部陽性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶亮度均一，這是擴(kuò)增系統(tǒng)受到污染時(shí)最典型的一種表現(xiàn)，需仔細(xì)檢查

15、，排除污染源，一般應(yīng)從以下步驟著手:1 .試劑污染:廠方提供的試劑或其中的某種組分在出廠或運(yùn)輸、 貯存過程中受到污染。檢測方法，可 按試劑盒說明書將試劑分裝好，直接置于PCR儀中擴(kuò)增（不加陰性對照，可加適量蒸儲水）， 便可簡單而有效地判斷試劑是否已受到污染。2 .實(shí)驗(yàn)室污染：這是最常見的污染源，由于PCR技術(shù)可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)將模板中某些特異性序列擴(kuò)增到數(shù)百萬倍以上，擴(kuò)弗產(chǎn)物可能在電泳等過程中污染移液器、操作臺或隨著蒸發(fā)所形成氣溶膠而污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室。擴(kuò)增產(chǎn)物又是最有效的模板，一旦出現(xiàn)產(chǎn)物污染其污染程度都較嚴(yán)重。判斷方法：可以將實(shí)驗(yàn)中最關(guān)鍵步驟如試劑分裝、樣品處理等轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的環(huán)境中或轉(zhuǎn)移到超凈

16、工作臺中完成。當(dāng)然，所用的移液器、吸咀管（離心管）都應(yīng)徹底更換。解決方法：實(shí)驗(yàn)室污染是PCR擴(kuò)增過程中最易出現(xiàn)的現(xiàn)象， 而且一旦出現(xiàn)污染，消除污染源又極其困難， 往往需對整個(gè)實(shí)驗(yàn)室及實(shí)驗(yàn)器材徹底清洗處理，所以應(yīng)該以預(yù)防為主， 實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)基本要求，樣品處理與擴(kuò)增產(chǎn)物及電泳應(yīng)盡量分開，最好能在兩個(gè)房間進(jìn)行。擴(kuò)增前處理所用的移液器及擴(kuò)增后點(diǎn)樣用的移液器應(yīng)嚴(yán)格地分開，不可互換。PCR室應(yīng)保持良好的通風(fēng)、清潔、最好能專用。3 .采樣污染：在實(shí)驗(yàn)過程中，有時(shí)會出現(xiàn)一批結(jié)果陽性率很高，一批結(jié)果陽性率又下降很多，如此反復(fù)，這種現(xiàn)象大都是由于采樣時(shí)污染所致，一般來講正規(guī)試劑生產(chǎn)廠家，其試劑出廠時(shí)都要

17、經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測、批間，特別是批內(nèi)差異都極小，不致出現(xiàn)如此明顯的反復(fù)，這種現(xiàn)象主要是由于收集樣本的試管或吸管受到污染所致。 使用的試管所進(jìn)行的洗滌方法往注不能去除痕量 陽性擴(kuò)增結(jié)果，由于采樣試管受污染程度不一， 一次試管及吸咀取樣。二、假陰性擴(kuò)增：PCRT增非常敏感，而一般實(shí)驗(yàn)室對重復(fù)DNA這些痕量DNA便成為PCR模板，出現(xiàn) 所以出現(xiàn)忽高忽低的現(xiàn)象解決方法建議使用如果連續(xù)幾次擴(kuò)增結(jié)果都是陰性，或已知陽性樣本出現(xiàn)陰性擴(kuò)增結(jié)果，一般認(rèn)為這是假陰性，出現(xiàn)這現(xiàn)象有以下幾種原因：4 .儀器故障：出現(xiàn)全陰結(jié)果，首先考慮到儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否正常。正確判斷儀器的工作狀況，是排除假陰性其它原因的基礎(chǔ)，儀器運(yùn)轉(zhuǎn)是否

18、正常是PCRT增最關(guān)鍵的步聚之一。判斷儀器是否正常， 首先要測定加熱體的溫度是否準(zhǔn)確，波動(dòng)范圍是否答合要求，各孔之間差異是否符合要求， PCFT增往往對儀器加熱溫度及各管間的差異要求有很高的精度，如果誤差太大，勢必出現(xiàn) 假陰性。必須注意的是不能過信名牌，我們經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些名牌機(jī)器溫度差異高達(dá)二度以上。5 .試劑失效或無效：了解機(jī)器是否正常， 便可對試劑進(jìn)行檢測。 首先要了解試劑是否超過有效期，試存放方法是否達(dá)到要求，如果試劑盒在有效期內(nèi)，貯存方法是正確，那么就應(yīng)該仔細(xì)、慎重地判斷試劑是否是無效試劑或稱不合格試劑?？梢杂靡阎栃詷颖?， 或試劑盒提供的陽性對照，嚴(yán)格按說明書操作擴(kuò)增一次，然后把擴(kuò)增產(chǎn)

19、物用雙蒸水稀釋1000倍，作為模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增，判斷結(jié)果，如果是陰性說明試劑無效或不合格，如果結(jié)果陽性那么可用以下方法判定試劑的靈敏度。6 .試劑的敏感度：有時(shí)試劑檢測的陽性率偏低，所謂陽性率偏率就是指出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這種現(xiàn)象往往與以下三種因素有關(guān)： 試劑質(zhì)量不過關(guān)； 操作方法不規(guī)范； 主觀判斷標(biāo)準(zhǔn)不科學(xué)。 對于 試劑質(zhì)量及操作是否正確這兩點(diǎn)是比較容易檢查并合理改進(jìn)。這里著重提一下：目前經(jīng)常碰到的一些不科學(xué)概念，我們習(xí)慣用某些樣本應(yīng)該陰性，某些樣本應(yīng)該陽性， 或簡單地以陽性率。主觀概念判斷試劑是否合格這是極不科學(xué)的主觀推論。如對乙肝血清的測定，就不能用抽象的陽性率應(yīng)該是 60%或20%這樣的

20、概念來判斷，同樣也不能用“二對半”的結(jié)果評判 “PCR結(jié)果”，這是因?yàn)椤岸Π搿迸c“ PCR是兩種完全不同的檢測方法，其檢測結(jié)果的 意義有質(zhì)的區(qū)別，它為醫(yī)務(wù)人員提供的信息是大不相同的，更加之所使用的“二對半”試劑是否能作為質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)仍待考定。目前世界上較公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)品只有雅培的“兩對半”試 劑，國內(nèi)的“二對半”試劑據(jù)衛(wèi)生部抽查資料表明，一度合格率在50%以下，怎么可能作為質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)呢！對試劑敏感度的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該使用下述方法科學(xué)地評價(jià)，首先選擇標(biāo)準(zhǔn)樣本如HB"序列質(zhì)粒，標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，結(jié)核菌菌體等用合適的介質(zhì)如血清、痰液等進(jìn)行有限稀釋按1: 10、1: 100、1: 1000、1 :

21、10000如此逐步提高稀釋度價(jià)其試劑的敏感度，一 般認(rèn)為如果標(biāo)準(zhǔn)陽性乙肝的血清用正常血清稀釋10000倍以上，結(jié)核菌每毫升中在100個(gè)左右仍能測出陽性結(jié)果時(shí)，試劑的敏感度是足夠的， 判斷試劑的靈敏度是足夠的，判斷試劑的靈敏度后仍需判斷試劑的檢測覆蓋，因?yàn)椴≡⑸镉胁煌男突蜃儺愔辏细竦脑噭┎粦?yīng)漏檢。最后還要判斷試劑盒的異性，一般的實(shí)驗(yàn)室可以用不同病原體的樣本按說明書操作來判斷其對其它病原體擴(kuò)增時(shí)是否也有陽性出現(xiàn)，其特異可達(dá)到怎樣的精度，經(jīng)過以上三個(gè)方面的研究便可以科學(xué)地判斷試劑的質(zhì)量。三、擴(kuò)增產(chǎn)物拖尾有時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后出現(xiàn)一個(gè)個(gè)螢光團(tuán)（Smear現(xiàn)象）或出現(xiàn)一連串的條帶，這些種現(xiàn)象主要與以

22、下幾種因素有關(guān)：1 .擴(kuò)增系統(tǒng)不完善：這種現(xiàn)象表明出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增與擴(kuò)增系統(tǒng)中鎂離子濃度、引物濃度、DNT限度有密切關(guān)系，需認(rèn)真調(diào)整以期避免這種現(xiàn)象出現(xiàn)。另外也可以適當(dāng)提高退 火溫度，從而提高擴(kuò)增特異性。2 .模板處理方法不完善：PCRT增技術(shù)的原理雖然非常簡單，但這一技術(shù)的合理應(yīng)用是極其復(fù)雜的，如對PC"要成分之一 DNA聚合酶的影響因素很多，這些因子是怎樣作用于聚合酶，其作用機(jī)制至今仍不清楚，因此對樣本處理不當(dāng)不妥可能抑制擴(kuò)增，也可能導(dǎo)致非特異擴(kuò)增。一般分泌物樣本，應(yīng)取脫落細(xì)胞為主，避免采集過多的膿性分泌物，痰液樣本一定要充分液化，等等。3 .引物設(shè)計(jì)不合理：

23、引物設(shè)計(jì)應(yīng)遵循以下幾個(gè)原則。首先，引物一般應(yīng)由15-30個(gè)BP組成；其次，引物中堿基應(yīng)是隨機(jī)分布，不能有一串相同堿基或出現(xiàn)其它不常見結(jié)構(gòu)；第三，GCg基含量應(yīng)在45-55 %左右；第四，兩個(gè)引物在 3'未端不能出現(xiàn)同源性。其中以引物與基因組之間的同 源性是產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的最主要原因，而我們一般在設(shè)計(jì)引物時(shí)往往只了解其基因組中的某一段序列，因此我們必須充分利用這些資料巧妙地設(shè)計(jì)出一組合理的引物，并通過反復(fù)比較、證實(shí)，最后才能確定其能否用于檢測。四、產(chǎn)物電泳單螢光帶及多螢光帶一般PCFT增后，對擴(kuò)增結(jié)果的判斷最簡單的方法是，瓊脂糖電泳，澳乙淀染色，在320nm的紫外激發(fā)觀察其螢光條帶，如

24、果有明顯和特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，就會在電泳平板預(yù)期的位置出現(xiàn)一條清晰的螢光亮帶，按標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增系統(tǒng)配制的反應(yīng)液，其引物濃度在 0.1-0.5mM , 一般經(jīng)30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，仍有相當(dāng)數(shù)量的游離引物存在， 因此在電泳平板就有一條 20BP左右（電泳速度較快）的淡淡的引物螢光帶，這樣每次電泳 結(jié)果就有兩條滎光帶，一條在前面的，每個(gè)點(diǎn)樣樣本都有的引物帶。引物設(shè)計(jì)相當(dāng)重要，由于基因組有龐大數(shù)量的 DN際列，除了特異性的擴(kuò)增外，往往很 容易產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物。如果引物與基因組存在較廣泛的同源性，那么就會出現(xiàn)嚴(yán)重的非特異性擴(kuò)弗，引物不僅與特異性的擴(kuò)增區(qū)域結(jié)合，而且也與其它區(qū)域發(fā)生一系列非特異性結(jié)合，而選擇引物時(shí)，常須

25、考慮敏感性問題， 特別是臨床檢驗(yàn)試劑盒，為了能把少至幾個(gè)病原體檢出，我們大都采用在病原體基因組中重復(fù)出現(xiàn)的DNA列設(shè)計(jì)引物，如果這些重復(fù)序列沒有 嚴(yán)格的同源性，就在可能出現(xiàn)不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物而出現(xiàn)多條帶擴(kuò)增。病原體變異，與前面所述一樣，我們?yōu)榈酶呙舾行越?jīng)常使用具有重復(fù)序列的基因作為引物設(shè)計(jì)的區(qū)段，在有些病原體，比如結(jié)核桿菌在治病過程中，會發(fā)生嚴(yán)重畸變，也包括其遺傳物質(zhì)的變化，出現(xiàn)染色體的缺失、不等位交換、其它序列的插入等。如果這些缺失與不等 位交換正好發(fā)生在我們所選擇的擴(kuò)增序列上，也會出現(xiàn)不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而產(chǎn)生多條擴(kuò)增產(chǎn)物帶。PCR基因擴(kuò)增技術(shù)簡單易行，應(yīng)用日趨廣泛，但其影響因素很多，在

26、實(shí)踐過程中時(shí)常現(xiàn)現(xiàn)這樣或那樣的問題，甚至得不到預(yù)期的結(jié)果，或出現(xiàn)無法解釋的現(xiàn)象。 誠然，近年來在大量科學(xué)工作者的共同努力下，取得了許多寶貴的經(jīng)驗(yàn)，使這一技術(shù)日趨完善，畢竟PCR是一項(xiàng)近幾年才出現(xiàn)的新技術(shù)，許多問題至今仍然不能得到很好地解釋或解決。想信隨著對PCR勺深入研究，在 PCR的應(yīng)用過程中不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，PC總一新技術(shù)將會為人類的發(fā)展作出更大的貢獻(xiàn)。PCR物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶PC阪應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性， 酶的質(zhì)量及，PCR1環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。模

27、板：模板中含有雜蛋白質(zhì)， 模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或澳乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、 兩條引物的濃度是否對稱，是 PC戲敗或擴(kuò)增條帶 不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低

28、，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：選定一個(gè)好的引物合成單位。引物的濃度不僅要看 OD直，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而 且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其 濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2瞇度：Mg2螭子濃度對PCRT增效率影響很大，濃度過高可降低PCRT增的特 異性，濃度過低則影響 PCRT增產(chǎn)量甚至使PCRT增失敗而不出擴(kuò)

29、增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行 PCRT增采用的體積為 20ul、30ul、50ul?；?00ul , 應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCRT增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCRT增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短， 極有可 能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響 引物與模板的結(jié)合而降低 PCRF增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測一下擴(kuò)增儀或 水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性

30、結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCRF增是不會成功的。假陽性出現(xiàn)的PCFT增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的 PCRT物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。 需重新設(shè)計(jì)引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。 所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用

31、。必要時(shí)，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCFT物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶PCRF增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、引物聚合形成二聚體。 二是Mg24m子濃度過高、退火溫度過低，及PCR1環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。 其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時(shí)也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增

32、。其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93 C變性，65c左右退火與延伸 ）。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶PCRT增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNT限度過高，Mg2蟀度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少 酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低 Mg2瞇度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。克隆PCR產(chǎn)物1）克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？最佳插入片段：載體比需實(shí)驗(yàn)確定。1: 1 （插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1:8或8: 1也

33、行。應(yīng)測定比值范圍。連接用 5ul 2X連接液，50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4 連接酶，插入片段共 10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4c過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端 的載體會自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4C過夜。2）PCR產(chǎn)物是否需要用凝膠純化？如凝膠分析擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條帶，不需要用凝膠純化。 如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數(shù)也很高，這會產(chǎn)生高比例的帶有引物二聚體的克隆，而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。3）如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實(shí)驗(yàn)？A）涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，

34、表明氨芳失效，或污染上帶有氨芳抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芳抗型的菌落。B）轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋，1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SO陰釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生 1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA勺總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,用1/10鋪板，共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000 克隆 X10 （3 次方）ng / 鋪板 1 ng DNA ug=10 （6 次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化p

35、GEM-T應(yīng)用10 （8次方）cfu/ ug 感受態(tài)細(xì)胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。C）如用pGEM-T正對照，或PCRT物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10 （8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去To可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA1接酶（M1801, M1804, M1794質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-TE對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)胞（10（8次方）cfu/ug ），按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60研為白斑，如產(chǎn)生20-40 藍(lán)斑，沒有菌落或少

36、有菌落，連接有問題。4）對照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？A）連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4c過夜。B）插入片段帶有污染，使 3'-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和 pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如 產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3'-T缺失。C）插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生喀咤二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。D）帶有修復(fù)功能的耐熱 DNA聚合酶的

37、擴(kuò)增產(chǎn)物末端無 A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy 載體克隆所需。加 Taq DNA聚合酶和核甘酸可在末端加 A。詳，f#查pGEM-T pGEM-T Easy載 體技術(shù)資料（TM042。E）高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE®胞PC阪應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：10X擴(kuò)增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物模板DNATaq DNA聚合酶Mg2+各 10100pmol0.1 2ug2.5u1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ulPC或應(yīng)五要素： 參加PC

38、R應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTR模板和Mg2+引物：引物是PCR寺異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DN際列， 就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNAS體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：引物長度：15-30bp ,常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長至10kb的片段。引物堿基：G+若量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異 條帶。ATGCt好隨機(jī)分布，避免 5個(gè)以上的喋吟或喀咤核甘酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免

39、兩條引物間互補(bǔ)，特別是 3'端的互補(bǔ)，否則會形 成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3'端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，以避免因末端 堿基不配對而導(dǎo)致 PC勝敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100Pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度 偏高會引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會。做配藥品，稀釋引物，PCR驗(yàn)中，對水的要求要很高么？配制一般化學(xué)試

40、劑使用二級水即可。配制生化試劑，包括引物稀釋、PCR所用水，以及轉(zhuǎn)膜、核酸抽提等，必須使用二次蒸儲水或一級水。1 PCR引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間 避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度( primer length ),產(chǎn)物 長度(product length ),序列Tm值(melting temperature) ,引物與模板形成雙鏈的內(nèi) 部穩(wěn)定性(internal stability,用∆G值反映)，

41、形成引物二聚體(primer dimer) 及發(fā)夾結(jié)構(gòu) (duplex formation and hairpin ) 的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)( false priming site ) 的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量(composition ),等等。必要時(shí)還需對引物進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì)應(yīng)注意如下要點(diǎn)：1 .引物的長度一般為 15-30 bp ,常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^長會導(dǎo) 致其延伸溫度大于 74 C,不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)2。2 .引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是 3

42、9;端相似性較高的序列，否則容 易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3'端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC也會使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加2。3 .引物3'端的末位堿基對 Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基 A34。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5'端序列對 PCR影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物2。4 .引物序列的GC含量一般為40-60%,過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的 GC含量不能相差太大25。5 .引物所對應(yīng)模

43、板位置序列的Tm值在72c左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式 Tm= 4(G+C)+2(A+T),在Oligo 軟件中使用的是最鄰近法 (the nearest neighbor method) 67。6 . ∆G 值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端∆G值較低（絕對值不超過 9）,而5'端和中間∆G值相對較高的引物。引物的3'端的∆G值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)6。7 .引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)

44、的能值過高（超過 4.5kcal/mol ）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體 帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行8。8 .對引物的修飾一般是在 5'端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條 件。2擴(kuò)增較大片段DNA的PCR方法一般PCRT法在擴(kuò)增大片段 DNA寸的局限性：通常所用的PCRT法都在兩個(gè)方面有局限，即目標(biāo)

45、產(chǎn)物精確程度和合成片段的大小。 Pfu（Pyrococcus furiosus）DNA聚合酶，具有完整的 3'外切酶校讀活性（3'-editing-exonuclease ）,可以將每個(gè)循環(huán)中堿基的錯(cuò)配率由10*-4降到10*-3 ,從而提高PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。但它在擴(kuò)增 1.5-2.0kb 片段時(shí)，效率比 Klentaq l（Taq DNA 聚酶 N-末端缺失突變體， 類似于E.coli DNA聚合酶I Klenow片段）或AmpliTaq （全長的Taq DNA 聚合酶）等聚合酶差；在擴(kuò)增5.0-7.0kb 片段時(shí)亦不比各種形式的Taq DNAM合酶（如AmpliTaq、K

46、lentaq 1 、Klentaq 5等N-末端缺失的變異株）有明顯優(yōu)越之處。因而以往的PCR反應(yīng)產(chǎn)物限制在 5.0kb以內(nèi)。超出這一范圍，PCRF增反應(yīng)效率將明顯下降，同時(shí)產(chǎn)物會降 解。即使將延伸時(shí)間定為30分鐘（10倍于通常所需）亦無改進(jìn)。利用兩種DNA聚合酶進(jìn)行較大片段 DNA勺擴(kuò)增美國華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Barnes WM®對前述問題進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，認(rèn)為： PCR反應(yīng)效率低最主要的原因是由于錯(cuò)配的堿基阻礙了延伸反應(yīng)的正常進(jìn)行，Pfu DNA聚合酶雖然可以通過“校讀”功能糾正錯(cuò)配的堿基，但亦可能降解引物，尤其是在較長反應(yīng)時(shí)間下； 酶濃度較高時(shí)，反應(yīng)效果更差。因此必需將Pfu

47、 DNA聚合酶的濃度控制在較低狀態(tài)，同時(shí)配合使用Klentaq l等DN咪合酶，這樣既可以有效地去除錯(cuò)配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反應(yīng)順暢進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，按15:1的比例混合使用 Klentaq l 和Pfu DNA聚合酶， 引物大小為27-33nt,即可使反應(yīng)有效進(jìn)行。當(dāng)然，對于各種不同條件的反應(yīng)，兩種類型酶 的最佳配比需要具體考慮?？刂泼撪┮鞣磻?yīng)增強(qiáng)擴(kuò)增效率在PC或應(yīng)體系中某些成分耐熱性較差，會影響反應(yīng)效率。DN咪合酶的熱穩(wěn)定性一般都是較好的，可能是模板DNAE溫度較高的環(huán)境中某些位點(diǎn)發(fā)生脫喋吟反應(yīng)從而阻礙反應(yīng)的 順利進(jìn)行。Lindahl和Nyberg的研究結(jié)果顯示：在70C

48、 pH7.4的條件下， 單鏈DNAB喋 吟 反應(yīng)的速度是雙鏈 DNA勺4倍；100c pH7.0時(shí)，100kb的堿基中每分鐘將有 1個(gè)位點(diǎn)脫喋 吟。這一反應(yīng)與緩沖體系中酸堿度的變化有關(guān)。人們注意到：三羥甲基氨基甲烷（ Tris ）的 酸解離常數(shù)（pKa）會隨溫度升高而改變， 平均每升高1C, pKa值降低0.03。因而，在25C 時(shí)pH8.55的PCR應(yīng)體系，至ij 95c熱變性時(shí)，pH值將變?yōu)?.45 ,這就很可能誘導(dǎo)脫喋吟 反應(yīng)。 為了解決這一問題，可以采取下列措施：縮短熱變性時(shí)間，Barnes等在擴(kuò)增35kb的大片段時(shí)，變性條件為 95c 5秒，取得滿 意結(jié)果；盡可能使升溫、降溫過程縮短

49、，可選擇使用導(dǎo)熱性能優(yōu)越的薄壁反應(yīng)管及較為先進(jìn)的 擴(kuò)增設(shè)備；適當(dāng)提高反應(yīng)體系的 pH值，反應(yīng)最初應(yīng)控制在pH8.8-9.2范圍；適當(dāng)增加延伸時(shí)間（可長至20分鐘）。使用這種方法可以擴(kuò)增最大為35kb的DNAf段，產(chǎn)物的準(zhǔn)確性亦有充分保證，克服了以往基因克隆過程中出現(xiàn)的DNA分子內(nèi)的堿基重排和可能的毒性危險(xiǎn)等問題。酶及其濃度目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)，一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然 酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PC或應(yīng)約需酶量2。5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)），濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和 PC

50、RT增效率有密切關(guān)系，dNTP#呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNT畸液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以 1MNaOH或1M Tris 。 HCL的緩沖液將其 PH調(diào)節(jié)到7.07.5，小量分裝，-20c冰凍保存。多次凍 融會使dNTP降解。在PC或應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L ,尤其是注意4種dNTP的濃度 要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會引起錯(cuò)配。濃度過低又會降低 PCRT物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+吉合，使游離的 Mg2瞇度降低。模板（靶基因）核酸 模板核酸的量與Z化程度，是PC做敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，傳統(tǒng)的DNA屯化方

51、法通常采用 SDS蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是：溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)， 因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜，并解離細(xì)胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白，再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PC即應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體， 消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCFT增。RNA莫板提取一般采用異硫鼠酸月瓜或蛋白酶 K法，要防止 RNase降解RNAMg2+濃度Mg2+對PCRT增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的P

52、CR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2鉞度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+t度過高，反應(yīng)特異性 降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置：基于PCRM理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法， 雙鏈DNA在9095c變性，再迅速冷卻至4060C,引物退火并 結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至7075C,在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，除變性溫度外、退

53、火與延伸溫度可合二為一，一般采用94c變性，65c左右退火與延伸（此溫度Taq DNA1仍有較高的催化活性）。變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93c94Clmin足以使模板DNA變性，若低于93c則需延長時(shí)間， 但溫度不能過高， 因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCRT物完全變性，就會導(dǎo)致 PC勝敗。退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40c60C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，

54、取決于引物的長度、堿基組成及其濃度， 還有靶基序列的長度。 對于20個(gè)核甘酸，G+C含量約50%勺引物，55 C為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm 彳1(解鏈溫度)=4(G+C) + 2(A+T)復(fù)性溫度=Tmf直-(510C)在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCWE應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：7080 c 150核甘酸/S/酶分子70 C 60核甘酸/S/酶分子55 C 24核甘酸/S/酶分子高于90

55、c時(shí)，DNA合成幾乎不能進(jìn)行。一、RT-PCR1. cDNA產(chǎn)量的很低 可能的原因：* RNA模板質(zhì)量低* 對mRN膿度估計(jì)過高* 反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足* 同位素磷32過期* 反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50“2.擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺* 最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是 RT-PCR的反應(yīng)體系* 與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)* 建議在試驗(yàn)中加入對照 RNA*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物( GSP用于第一鏈合成。由于 RNA 模板存在二

56、級結(jié)構(gòu)，如環(huán)結(jié)果，有可能導(dǎo)致gs叱法與模板退火；或 ssn反轉(zhuǎn)錄酶無法從此引物進(jìn)行有效延伸。*目的mRN刖含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：a.將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50Cob.使用隨機(jī)六聚體代替 Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。3.產(chǎn)生非特異性條帶*用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR吉果也顯示同樣條帶，則需要用 DNase I重新處理樣品。*在PC或應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物 Tm 2至5C 的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。*由于mRN曲切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。4 .產(chǎn)生彌散(smear)條帶* 在PC或