2019年殺菌率試驗規(guī)程

1、Q/KM ZJ 2008液體洗滌劑殺菌試驗規(guī)程（內(nèi)部使用）2008年 月曰內(nèi)部執(zhí)行質(zhì)量管理中心實驗室gI用標(biāo)準(zhǔn)1、GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2、QB/T2738-2005日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法3、QB/T2850-2007抗菌抑菌型洗滌劑4、2002年版消毒技術(shù)規(guī)范（中華人民共和國衛(wèi)生部）5、2001年版藥品微生物學(xué)檢驗手冊（科技出版社）殺菌率試驗規(guī)程1、試驗菌、試驗溫度、作用時間、試液濃度試驗菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC 6538 ),大腸桿菌(8099或ATCC 25922 ),白色念珠菌試驗溫度：20 C ±1 C作用時間：最短不得小于30s

2、o常規(guī)作用時間為2min、5min、10min、20min。試液濃度：中和劑鑒定用試液濃度應(yīng)為正式殺菌試驗最高濃度。菌懸液用量：正式 殺菌試驗用菌懸液的濃度、取量應(yīng)與 中和劑鑒定中1組、2組所用菌懸液的濃度、 取量相同。2、細(xì)菌繁殖體懸液、菌片的制備程序：2.1菌懸液的制備 取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細(xì)吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吸吹數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0ml-10.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37c培養(yǎng)18h24h。用接種環(huán)取第1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37c培養(yǎng)18h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典 型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于

3、37 c培養(yǎng)18h24h,即為第3代培養(yǎng)物（放在4c左右冰箱中保藏。每隔2-3個月移種一次，繼續(xù)保藏。）。 取第3代14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（經(jīng) 18h24h培養(yǎng)）,用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用 5.0ml吸管將洗液移至另一無菌 試管中，在手掌上振敲80次（力度適中，勿濺出），以使細(xì)菌懸液均勻?；驈男迈r菌種斜面沾取少量菌 苔，接種在適合試驗菌生長的培養(yǎng)基中，37 c培養(yǎng)18h24h （或適宜時間）。作為原菌液。（源于藥 品微生物學(xué)檢驗手冊211頁） 細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在4c冰箱備用。盡量減少在室溫下放置時間，以減少細(xì)

4、菌的自然死亡。應(yīng)當(dāng) 天使用不得過夜。回收菌數(shù)為1X1049X104 cfu/ml用PBS液配置 GB15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)回收菌數(shù)為1 X 1085X 108cfu/ml用TSB營養(yǎng)肉湯配置一2002消毒技術(shù)規(guī)范2.2、菌片的制備程序：消毒技術(shù)規(guī)范 取凍干菌種管，在無菌操作下，以毛細(xì)吸管加入適量營養(yǎng)肉湯，輕柔吸吹數(shù)次，使菌種融化分散。取含5.0ml-10.0ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37c培養(yǎng)18h24h。用接種環(huán)取第1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37c培養(yǎng)18h24h。挑取上述第2代培養(yǎng)物中典 型菌落，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面，于

5、 37 c培養(yǎng)18h24h,即為第3代培養(yǎng)物。 取第3代14代的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（經(jīng) 18h24h培養(yǎng)）,用5.0ml吸管吸取3.0ml-5.0ml TSB營養(yǎng)肉湯加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml吸管將洗液移至另一 無菌試管中，在手掌上振敲 80次，以使細(xì)菌懸液均勻，含菌量1 x 1085X 108cfu/ml。用無菌鑲子夾住已滅菌10mm*10mm濾紙一角，一面朝上，注入10ul菌懸液，放到無菌平板內(nèi)，37 C 溫箱中干燥20min-30min ,（或在室溫自然陰干后使用）制成菌片。每個菌片回收菌落，按活菌培養(yǎng)計 數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為5x 1055x 106cf

6、u/片。）細(xì)菌繁殖體懸液和菌片，用畢應(yīng)隨時保存在4c冰箱內(nèi)。盡量減少在室溫下放置時間，以減少細(xì)菌的自然死亡。（應(yīng)當(dāng)天使用不得過夜。）3、操作程序3.1 、懸液定量法殺菌試驗操作程序、樣品用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋至同中和劑鑒定用試液濃度，或低于中和劑鑒定用試液濃度，制成（稀釋液）試驗樣液。、將試管按需要數(shù)量分別排列于試管架上，各組由左向右，排序、標(biāo)記。、配制菌懸液，濃度為1X1049X104 cfu/ml GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)或 1>108-5X10 8cfu/ml 2002消毒技術(shù)規(guī)范、取殺菌試驗用無菌大試管，先加入 0.5ml試驗用菌懸液，再加入0.5ml有機干

7、擾物質(zhì)，混勻，置20 土 C 5min ,用無菌吸管吸取步驟1中的試驗樣液4.0ml注入其中，立即開啟計時器，并迅速混勻（在 手掌上振搖80次）。-見消毒技術(shù)規(guī)范或吸取試驗用菌懸液0.1ml,加入到含5ml樣液的試管中，立 即開啟計時器，并迅速混勻（在手掌上振搖 80次）。-見QB/T 2738-2005、作用2min、5min、10min、20min ,即刻用無菌吸管吸取0.5ml移入鑒定合格的4.5ml中和劑溶液中（中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗結(jié)果規(guī)定的相同）充分混勻，中和作用 10min后，取樣液、10 倍系列稀釋液0.5ml （見GB15979-2002 ）或分別吸取1.0 ml （

8、-見消毒技術(shù)規(guī)范）（見圖四），置于 2個滅菌平皿，用涼至4045 c營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）15ml作傾注，轉(zhuǎn)動平皿， 使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，35c i2C培養(yǎng)48h （細(xì)菌）或（酵母菌）25c i2C培養(yǎng)72h ,作活菌菌落計數(shù)。、同時用稀釋液代替樣液進行平行試驗，作為陽性對照管。、陰性對照組：分別吸取試驗用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察有無污染。、計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu300cfu的平板為準(zhǔn)，每個稀釋度3個平板生長菌落數(shù)全部合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該3個平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有2個符合合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的2個平

9、板菌落的平均值作為結(jié)果。、試驗重復(fù)3次，求其平均值。根據(jù)各組活菌濃度（cfu/ml）,計算殺菌率，見計算公式1?；蚋鶕?jù)各 組活菌濃度換算為對數(shù)值（N）,計算殺滅對數(shù)值，見計算公式 2。3.2 載體法殺菌試驗操作程序、試驗樣品用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水（過濾除菌）稀釋至規(guī)定濃度，制成（稀釋液）試驗樣液。、吸取樣液5.0ml放入滅菌平皿，另吸取 PBS 5.0ml注入平皿中，作為陽性對照皿。每皿用無菌銀子 夾住菌片一角放入試樣皿和陽性對照皿。、作用至設(shè)定時間后，即刻用無菌銀子夾住菌片一角，投入含 5.0ml中和劑的試管中（中和劑的濃度 與容量應(yīng)與鑒定試驗結(jié)果規(guī)定的相同）充分混勻計時。（見圖三）、中和10min

10、后，取樣液或10倍系列稀釋液1.0ml （見圖四），置于兩個滅菌平皿，接種涼至 40 45 c營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）15ml,轉(zhuǎn)動平皿10-20下，使其充分均勻，凝固 后，于35±2培養(yǎng)48卜（細(xì)菌）或72h （酵母菌），作活菌菌落計數(shù)。、試驗重復(fù)3次，求其平均值。、陰性對照組：分別吸取試驗用相關(guān)溶液和培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，觀察有無污染。A、PBC液（0.03mol/L磷酸鹽緩沖液）、B、無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水1ml置于滅菌平皿內(nèi)、C、空白平皿，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌）或沙氏瓊脂培養(yǎng)基（酵母菌）15ml培養(yǎng)。、計數(shù)菌落時，一般以肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。以菌落數(shù)在15cfu3

11、00cfu的平板為準(zhǔn)，每個稀釋度3個平板生長菌落數(shù)全部合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該3個平板的菌落平均值作為結(jié)果；若有2個符 合合乎上述標(biāo)準(zhǔn)，則以該合格的2個平板菌落的平均值作為結(jié)果。4、計算公式1、殺菌率 X1= （A B ） / A X100%式中：X1殺菌率（）;A-對照樣品平均菌落數(shù)；B-被試樣品平均菌落數(shù)。2、殺滅對數(shù)值（KL）=對照組平均活菌濃度的對數(shù)值（No）試驗組活菌濃度的對數(shù)值（Nx） 備注：計算殺滅對數(shù)值時，取小數(shù)點后兩位值，可以進行數(shù)字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平 均生產(chǎn)菌落數(shù)，小于等于1時，即大于等于試驗前對照組平均活菌濃度的對數(shù)值。5、評價標(biāo)準(zhǔn)殺菌率90% ,廣品有殺菌作用

12、。懸液定量殺滅試驗中，各次的殺滅對數(shù)伯 5.00,可判定為消毒合格。6、操作要點：（消毒技術(shù)規(guī)范2002版）1、 對接觸消毒劑（殺菌劑）的樣本，在達(dá)到規(guī)定作用時間，即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中（中和劑的濃度與容量應(yīng)與鑒定試驗結(jié)果規(guī)定的相同）；2、 即刻混勻，并按規(guī)定時間吸取樣液進行隨后的培養(yǎng)檢測；3、 在將樣本接種培養(yǎng)基以前的操作，應(yīng)按規(guī)定時間內(nèi)進行，以免微生物與中和劑或中和產(chǎn)物接觸過久。審核：編制:中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序引用標(biāo)準(zhǔn)：QB/T2738-2005日化產(chǎn)品抗菌抑菌效果的評價方法（試驗菌懸液在1 X 104-9X 104cfu/ml ）GB 15979-2002 一次性使

13、用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（試驗菌懸液在1X 104 9 X 104cfu/ml）2002消毒技術(shù)規(guī)范（試驗菌懸液在1 X 1075X 107cfu/ml ）一、定義和術(shù)語中和劑一在微生物殺滅試驗中，試驗微生物與殺菌劑作用達(dá)到規(guī)定時間的終點時，用以中和殘留的殺菌劑，使其不在持續(xù)抑制和殺滅微生物的試劑。中和產(chǎn)物一中和劑加殺菌劑（樣品）=9: 1,作用10min配置而成。二、中和劑鑒定試驗原理中和劑鑒定試驗原理試驗分組第1組第2組第3組第4組第5組第6組殺菌劑十菌液（殺菌劑+菌中和劑十菌液（殺菌劑+中陽性菌數(shù)對照陰性對照。液）十中和劑和劑）+菌液觀察殺菌劑對觀察殘留殺菌觀察中和劑是觀察中和產(chǎn)陽性對照組。陰

14、性對照組。試驗菌有無殺劑被中和后,否抑菌。物，或未被完火或抑制能力受到殺菌劑作全中和的殘留試驗?zāi)康挠煤蟮脑囼灳鷼⒕鷦υ囼炇欠衲芑謴?fù)生菌的生長繁殖長。是否有影響。三、中和劑鑒定試驗中易出現(xiàn)的問題及解決方法出現(xiàn)的問題解決方法1、組無菌生長或組平板上少于5個菌落，其它組正常。降低消毒劑濃度或縮短作用時間。2菌落數(shù)較多且數(shù)量基本相同，其它組正常。提高消毒劑濃度或延長作用時間。3組中和劑菌落數(shù)明顯少于 PBS組菌數(shù)降低機口劑濃度或改變機口劑成分。4組（中和產(chǎn)物）菌落數(shù)明顯少于 PBS組菌數(shù)，其它組正常。提高中和劑濃度或改變中和劑成分。5多次更換中和劑均不能得到滿意結(jié)果。選用載體法進行中和劑鑒定，殺菌試

15、驗同時用載體法進行。四、1鑒定試驗操作程序中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序-消毒技術(shù)規(guī)范試驗分組第1組第2組第3組第4組第5組第6組取試驗樣品4.0ml加入各對應(yīng)組取4.5ml中和劑加入對應(yīng)組取4.9ml中和產(chǎn)物b力口入對應(yīng)組取 4.5mlPBS （稀釋液）加入對應(yīng)組一20 C ±1 C，叵溫5min菌懸液1.0ml菌懸液1.0ml0.1ml菌懸液+ 0.4ml硬水混勻0.1ml菌懸液0.1ml菌懸液+ 0.4ml硬水混勻一振敲80次，混勻作用至試驗預(yù)定時間，取0.5ml加入卜列對應(yīng)組作用10min ,取0.5ml加入卜列各對應(yīng)組一PBS4.5ml中和劑4.5ml中和劑4.5ml中和產(chǎn)

16、物4.5mlPBS4.5ml一振敲80次、混勻/作用10min/一取適宜稀釋度懸液 1.0ml 接#¥板（2個/樣本）活菌培養(yǎng)計數(shù)活菌培養(yǎng)計數(shù)用中和劑10倍系列稀釋用中和廣物10倍系列稀釋用稀釋液10倍系列稀釋PBS +中和劑各1.0ml接種平板中和劑鑒定評價規(guī)定第1組不長菌或明顯少于第2組第2組菌數(shù)大于5且明顯少于第3、 4、 5 組第3、4、5組菌數(shù)相似，誤差率015%二組向平均菌數(shù)=（第3+4+5組菌數(shù)）+3;誤差率=（二組平均菌數(shù)-各組菌落平均第6組無菌生長中和劑鑒定合05數(shù)）的絕又t值之和/3X三組間平均菌數(shù)X100格標(biāo)準(zhǔn)中對1、X (1-10)>(X + 5)2組菌

17、數(shù)要求。Y(>10)>1.5 Y結(jié)論符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用，和產(chǎn)物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑機口劑與試驗樣品的中備注a困懸液濃度及制備： 消場技術(shù)規(guī)氾 用PBS （試驗菌懸液在1X105X 10 cfu/ml ）b中和廣物的配置：先將試驗樣液 1.0ml與中和劑溶液9ml混作用10min后制成四、2鑒定試驗操作程序中和劑鑒定試驗操作程序-載體法試驗分組第1組第2組第3組第4組第5組第6組用無菌銀子取吸取試驗吸取試驗樣品吸取中和劑吸取中和產(chǎn)吸取PBS一菌片加入卜列樣品5.0ml5.0ml 丁,無菌平5.0ml 丁無國物5.0ml于5.0ml

18、 丁無國對應(yīng)組丁無國斗皿內(nèi)平皿內(nèi)無菌平皿內(nèi)平皿內(nèi)皿內(nèi)作用至預(yù)定時間，立即用無菌混勻作用10min,立即用無菌銀子取出菌片移入對應(yīng)組銀子取出菌片移入對應(yīng)組試管振打80次PBS中和劑中和劑中和產(chǎn)物稀釋液一5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml5.0ml作用作用10min/10min取原液或稀釋用稀釋液用稀釋液10倍用中和劑10用中和廣物用稀釋液10稀釋液+液1.0ml接種10倍系列系列稀釋倍系列稀釋10倍系列倍系列稀釋中和劑平板（2個/樣稀釋稀釋各 1.0ml本）接種平板操作要點即刻混勻，并按規(guī)定時間接種培養(yǎng)基中和劑鑒定評價第1組不第2組有且較第第3、4、5組菌數(shù)相似，且其誤差率0 15%第6組

19、無長菌或明1組為多，較第菌生長評價規(guī)定顯少于第23、4、5組為少二組向平均菌數(shù)=（第3+4+5組菌數(shù)）與；組的菌數(shù)生長，并符合卜表要求。誤差率%=（三組平均菌數(shù)-各組菌落平均中和劑鑒定合05數(shù)）的絕對值之和/3X三組間平均菌數(shù)X100格標(biāo)準(zhǔn)中對1、X (1-10)>(X+5)2組菌數(shù)要求。Y(>10)>1.5 Y結(jié)論符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用,中和劑與試驗樣品的中和產(chǎn)物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑。備注a菌懸液濃度及制備：用PBS將指示菌制成1X1049X104 cfu/ml懸液。（-GB15979 ）消場技術(shù)規(guī)氾 用PBS （試驗園懸液

20、在1X105X10 cfu/ml）b中和廣物的配置：先將試驗樣液 1.0ml與中和劑溶液9ml混作用10min后制成四、3鑒定試驗操作程序中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序-GB/T 15979 »試驗分組第1組第2組第3組第4組第5組第6組取0.10ml菌懸液，分別加入各組取試驗樣品5.0ml加入各對應(yīng)組取5.0ml中和劑加入對應(yīng)組取5.0ml中和產(chǎn)物b力口入對應(yīng)組取 5.0mlPBS （稀釋液）加入對應(yīng)組一振敲80次，混勻作用至試驗預(yù)定時間，取0.5ml加入卜列對應(yīng)組作用10min ,取0.5ml加入卜列各對應(yīng)組一PBS4.5ml中和劑4.5ml中和劑4.5ml中和產(chǎn)物4.5mlPB

21、S4.5ml一振敲80次、混勻/作用10min/一取適宜稀釋度懸液 1.0ml 接#¥板（2個/樣本）活菌培養(yǎng)計數(shù)活菌培養(yǎng)計數(shù)用中和劑10倍系列稀釋用中和廣物10倍系列稀釋用稀釋液10倍系列稀釋PBS +中和劑各1.0ml接種平板中和劑鑒定評價規(guī)定第1組不長菌或明顯少于第2組第2組菌數(shù)大于5且明顯少于第3、 4、 5 組第3、4、5組菌數(shù)相似，誤差率015%二組向平均菌數(shù)=(第3十4十5組困數(shù))+3;誤差率=(二組平均菌數(shù)-各組菌落平均數(shù))的絕又t值之和/3X三組間平均菌數(shù)X100第6組無菌生長中和劑鑒定合格標(biāo)準(zhǔn)中對1、2組菌數(shù)要求。05X (1-10)>(X + 5)Y(&g

22、t;10)>1.5 Y結(jié)論符合上述評價的中和劑表明可消除試驗樣品對指示菌的作用,中和劑與試驗樣品的中和產(chǎn)物對指示菌無毒害，鑒定為該試驗樣品的中和劑備注a菌懸液濃度及制備：用PBS將指示菌制成1X1049X104 cfu/ml懸液。(-GB15979 )b中和廣物的配置：先將試驗樣液1.0ml與中和劑溶液9ml混作用10min后制成七、消毒劑的常用中和劑的配置1、 用于氯型殺菌劑(有效氯0.1-0.5%):硫代硫酸鈉2、 用于非氧化型殺菌劑：a：磷酸二氫鉀1.36g、磷酸氫二鈉2.83g、卵磷脂10.0g、甘氨酸10.0g、吐溫-80 30.0g 、蒸儲水1000mlb:磷酸二氫鉀1.36g、磷酸氫二鈉2.83g、卵磷脂3.0g、吐溫-80 20.0g、蒸儲水1000ml3、 用于氧型殺菌劑：吐溫-80 20.0g、硫代硫酸鈉10.0g、PBS10