PCR技術(shù)在法醫(yī)物證中的概述5

1、PC做術(shù)在法醫(yī)物證中的概述1前言聚合酶鏈反響PC忘近幾十年來開展和普及最迅速的分子生物學(xué)新技術(shù)之一.由于它具有強大的擴增水平,并且可與其他生物學(xué)方法如核酸雜 交和免疫學(xué)方法相結(jié)應(yīng)用,使其敏感性和特異性都大大增強,因而廣泛地 應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的各個學(xué)科, 包括基因的克隆、修飾,遺傳病的診斷, 法醫(yī)學(xué)鑒定,物種起源,生物進化分析,流行病學(xué)調(diào)查等.法醫(yī)物證學(xué)是 具有法學(xué)特性的一門應(yīng)用科學(xué),屬于法醫(yī)學(xué)范疇,為司法機關(guān)偵破審理提 供科學(xué)的證據(jù).法醫(yī)物證又可以稱為法醫(yī)生物物證,包括人體構(gòu)成成分檢 材、動物相應(yīng)的各類檢材和局部植物檢材,例如人體的各種分泌物及排泄 物、血液、毛發(fā)、牙齒、骨骼以及植物纖維、種

2、子、花粉等.法醫(yī)物證涉 及多個學(xué)科,與現(xiàn)代分子生物學(xué)、免疫微生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多個學(xué)科緊 密相關(guān),這些學(xué)科的高速開展,也相應(yīng)的推動了法醫(yī)物證學(xué)的跨越式開展.2 PCR技術(shù)聚合酶鏈反響PC叱術(shù)具有特異、快速、簡便等很多優(yōu)點,在短時間 內(nèi)能將所要研究的目的基因擴增至數(shù)萬乃至數(shù)百萬倍.PCR技術(shù)的根本原理類似于DNA勺天然復(fù)制過程,PCR由變性一退火一延伸三個根本反響步 驟構(gòu)成,DNA1合酶以一段單鏈 DNA為模板,借助一小段雙鏈 DN林啟動 合成,通過一個或兩個人工合成的寡核昔酸引物與單鏈DNA莫板中的一段互補序列結(jié)合,形成局部雙鏈.在適宜的溫度和環(huán)境下,在體外通過酶促 反響以百萬倍擴增一段目的基

3、因.其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡 核昔酸引物2.1 常規(guī)PC做術(shù)該技術(shù)的主要步驟是首先從細(xì)胞中提取RNA將細(xì)胞中mRN高析出；其次在反轉(zhuǎn)錄酶的催化下以 mRN砌模板合成DNA再次以DNA模板,用 PCRS行擴增；最后PCRT增的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測.它的主要應(yīng) 用是：該技術(shù)主要用于獲取目的基因的和合成DNA探針.2.2 多重PC做術(shù)多重PC做術(shù)這是一種新型 PCR的擴增技術(shù),是對常規(guī) PCRW改良, 其原理是：設(shè)計多對引物同時擴增一份 DNA羊品中幾個不同DNA目的片段. 根本步驟與常規(guī)PCFB作相同,只是反響中參加的是多對引物,而不是一 對引物.主要應(yīng)用：常用于診斷疾病和法醫(yī)學(xué)研究

4、分析等方面的應(yīng)用.多 重PC做術(shù)可以擴增一個物種的一個片段,也可以同時擴增多個物種的不 同片段.在同一反響體系中,多重PC做術(shù)進行多個位點的特異性擴增時, 引物間的配對、引物間的競爭性擴增等會對擴增效果產(chǎn)生重要影響.一方 面,如果能選擇適宜的反響體系和反響條件,可極大地提升多重PCRW擴增效果.主要包括退火溫度、退火及延伸時間、PC礴沖液成分、dNTP的用量、引物及模板的量等.另一方面,DNA勺抽提質(zhì)量也影響多重 PCFT增效率.2.3 定量PC做術(shù)定量PC做術(shù)是指以一種標(biāo)準(zhǔn)作對照,通過對 PC嗨始模板量進行定 量的技術(shù).目前主要采用的定量 PC昉法是熒光定量PCFfe,熒光定量PCR 是一種

5、高度靈敏的核酸定量技術(shù),與傳統(tǒng)PCR相比,定量PCR夠更加快速靈敏以及有效地對核酸進行定量檢測.熒光定量PC曲術(shù)最大的特點是第2頁能將熒光基團參加到 PC皈應(yīng)體系中,借助于熒光信號,累積實時監(jiān)測整 個PCRS程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析.熒光信號在指 數(shù)擴增階段,PCRT物熒光信號的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性對應(yīng) 關(guān)系,然后進行定量分析.3 PCR在法醫(yī)中的應(yīng)用3.1 PCR-STR分析技術(shù)STR分析技術(shù)被認(rèn)為是目前國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)個體識別和親權(quán)鑒定的主要 研究方向,是第二代法？tDNA指紋技術(shù)的核心.STR即短串聯(lián)重復(fù)序列, STR的結(jié)構(gòu)特點很適合PCFT增,為微量的生物學(xué)物證

6、的個體認(rèn)定提供了 技術(shù)根底,近年來隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)以及復(fù)合擴增技術(shù)和自動化測 序儀的日趨成熟,STR的靈敏度和個體識別率很高,對指紋和皮膚脫落上 皮細(xì)胞等微量物證的取證方面發(fā)揮了重要作用.復(fù)合STR-PC戲光標(biāo)記自動檢測系統(tǒng)已成為當(dāng)今法醫(yī) DNA僉驗的主要技術(shù)手段.3.2 PCR在物證領(lǐng)域使用考前須知PC皈應(yīng)的最大特點是具有較大擴增水平與極高的靈敏性,但在PCR中普遍遇到的問題是可被寡核昔酸引物擴增的外源DNAf列的污染問題.污染原因有來自實驗材料污染、來自其他測試樣品污染,最可能造成PCRT物污染的形式是氣溶膠污染.在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比擬劇烈地?fù)u動反 應(yīng)管,開

7、蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.3.3 預(yù)防污染的方法有合理分隔實驗室.在理想的條件下,PC延該在一間單獨的實驗室內(nèi)進行操作,但是較為實際的選擇是在實驗室中為設(shè)置PCRJ出特定的區(qū)域:將樣品的處理、配制PC皈應(yīng)液、PCR1環(huán)擴增及PC*物的鑒定等步驟 分區(qū)或分室進行,特別注意樣本處理及PCFT物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴(yán)格分開.吸樣槍污染是一個值得注意的問題.由于操作時不慎將樣品或模板 核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴(yán)重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸 時要十分小心,吸樣要慢,吸樣時盡量一次性完成,忌屢次抽吸,以免交 叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.預(yù)防操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、 小離心管應(yīng)一次性使用.4結(jié)語隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的迅速開展,科學(xué)技術(shù)的不斷進步,新型PCFa器及相應(yīng)試劑、試劑盒、新的凝膠電泳設(shè)備的不斷出現(xiàn),PC曲術(shù)的實驗方法也變得越來越簡便、快捷、實用,也向著更加智能化的方向開展.操 縱遺傳物質(zhì)來滿足生命體的特殊要求,將會給人類的現(xiàn)代生活帶來根本性 的重大變化.PC做術(shù)使得法醫(yī)物證技術(shù)在法醫(yī)學(xué)已取得了輝煌的成果, 解決了法醫(yī)物證正面認(rèn)定的歷史難題,為法庭科學(xué)的開展作出了巨大的貢 獻(xiàn),使整個法醫(yī)物證發(fā)生了