低劑量氟達拉濱、環(huán)磷酰胺聯(lián)合供者NK細胞作為非清髓性預處理用于小鼠單倍相合造血干細胞移植

1、低劑量氟達拉濱、環(huán)磷酰胺聯(lián)合供者NK細胞作為非清髓性預處理用于小鼠單倍相合造血干細胞移植         08-03-01 16:55:00     編輯：studa20                 作者：于津浦， 曹水， 辛寧， 安秀梅， 齊靜， 任秀寶【摘要】  本研究探討低劑量氟達拉濱、環(huán)

2、磷酰胺聯(lián)合供者異體反應性NK細胞（flu+cy+alloNK）作為新的非清髓性單倍相合造血干細胞移植（haploidentical HSCT）預處理方案的可行性。利用免疫磁珠富集F1供鼠(H2d/b)脾臟NK細胞，檢測其中Ly49C+、Ly49A+ 細胞的比例；LDH法檢測其異體反應性。建立小鼠單倍相合造血干細胞移植模型，并比較清髓性方案（9 Gy TBI）、各種非清髓性方案(6.5 Gy TBI，flu+cy，及flu+cy+alloNK)的體內(nèi)清髓效果、移植后供者嵌合率、GVHD的發(fā)生率及嚴重程度。結(jié)果表明： 與其他非清髓性預處理方案相比，flu+cy+alloNK組不能增加清髓程度，但可

3、顯著提高單倍相合移植后的供者嵌合率，移植后21天的嵌合率在骨髓為（28.70±5.90）%，脾臟為 (46.40±5.00)%，并持續(xù)2個月。與flu+cy組相比，flu+cy+alloNK組出現(xiàn)的GVHD反應輕微，僅有50%(5/10)受鼠出現(xiàn)體重減輕，flu+cy+alloNK組小鼠的肝臟、小腸、腎臟及皮膚的病理切片均未見明顯的組織損傷。結(jié)論： 供者alloNK具有促進單倍相合供者造血干細胞植入，減輕GVHD強度的作用；低劑量flu+cy+alloNK方案為高齡和一般情況差的腫瘤患者開展單倍相合造血干細胞移植提供了新的途徑。 【關(guān)鍵詞】  非清髓性預處理

4、60;    Application of Low Dose of Fludarabine and Cyclophosphamide Combined with Donor NK Cells as a Non myeloablative Conditio ning Regimen for the Haploidentical Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Mice        Department of Immunology, Key L

5、aboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Cancer Institute and Hospital, Tianjin Medical University, Tianjin  300060, China    Abstract    This study was aimed to investigate  the feasibity  of low dose of fludarabine, cyclophosphamide  com

6、bined with  donor derived alloreactive NK cells as a new nonmyeloablative conditioning regimen in the haploidentical hematopoietic stem cell transplantation (haploidentical HSCT).  F1 derivedNK cells were enriched  with MACS magnetic separation system, in which the proportions of the

7、Ly49C+ and Ly49A+ cells were detected by flow cytometry and the alloreactivity was measured by LDH method. The haploidentical HSCT models were constructed, and the myeloablativity in vivo, donor engraftment and the intensity of GVHD were compared between different myeloablative and nonmyeloablative

8、conditioning regimens, including 9 Gy TBI, 6.5 Gy TBI, flu+cy, and flu+cy+alloNK. The results showed that the flu+cy+alloNK conditioning was nonmyeloablative, but the rate of donor chimerism after haploidentical HSCT was significantly higher as compared with other nonmyeloablative methods, which wer

9、e (28.70±5.90)% in bone marrow and (46.40±5.00)% in spleen at  day 21  posttransplantation. When compared with the flu+cy conditioning, the intensity of GVHD was slight in the flu+cy+alloNK group, in which only a half of C57BL/6 recipients experienced weight loss, and no distinct

10、 pathological damages observed in the liver, intestine, kidney and skin samples. It is concluded  donor derivedalloreactive NK cells can facilitate engraftment of the haploidentical hematopoietic stem cells and mitigate GVHD. The flu+cy+alloNK conditioning  provides a new method for those

11、elder patients with highrisk solid tumor undergoing  haploidenticalHSCT.    Key words    alloreactive NK cell; haploidentical hemopoietic stem cell transplantation; nonmyeloablative conditioning regimen; fludarabine; cyclophosphamide    親緣間HLA單倍相合造血干

12、細胞移植（haploidentical HSCT）供者容易獲得，GVT效應顯著，適合用于實體腫瘤的治療。但haploidentical HSCT發(fā)生移植排斥和嚴重移植物抗宿主?。℅VHD）的機率較高，因此尋找一種新的非清髓性預處理方案，在保證移植物順利植入的基礎上控制GVHD和各種嚴重并發(fā)癥，是目前亟待解決的問題。    在haploidentical  HSCT中，當供者NK細胞表面KIR受體與受者的MHCI類分子不相配時，會產(chǎn)生供者對受者(GVH)NK細胞同種反應性，特異性殺傷受者靶細胞，這種NK細胞被稱為異體反應性NK（alloNK）。針對血液系統(tǒng)

13、惡性腫瘤的動物實驗和臨床回顧性分析均表明，alloNK用于haploidentical   HSCT的預處理，具有促進植入、預防GVHD和減少復發(fā)等優(yōu)點1,2。在本實驗中，通過比較低劑量氟達拉濱、環(huán)磷酰胺聯(lián)合alloNK（flu+cy+alloNK）與其他預處理方案的清髓效果、供者植入率和GVHD情況，初步探討其在haploidentical  HSCT治療實體瘤中的應用潛力。     實驗動物和藥物    供體鼠：清潔級（BALB/c×C57BL/6）F1(H2Db/d，)，8-12

14、周齡，體重18-22 g；受體鼠，近交系C57BL/6(H2Db ，)，8-12周齡，體重18-22 g，均購自北京維通利華動物中心，為清潔級動物。受鼠飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學動物實驗中心層流房內(nèi)，供鼠飼養(yǎng)在普通清潔動物房內(nèi)，每天更換墊料，受鼠移植前7天及移植后飲用的水中加入慶大霉素300 mg/L，飼料經(jīng)60Co照射滅菌。試驗用藥：氟達拉濱（flu, 福達華，先靈公司產(chǎn)品）；環(huán)磷酰胺（cy，Sigma公司產(chǎn)品）。    供者NK細胞的富集    供者NK細胞的富集按照小鼠NK細胞分選試劑盒（Miltenyi Biotec公司產(chǎn)品） 的操作

15、說明進行。F1供體鼠無菌取脾臟，制備單細胞懸液，用PBS+0.5% BSA+2 mmol/L EDTA洗液洗滌后棄上清，以40 l/107 cells的濃度重懸細胞，以10  l/107 cells比例加入生物素標記的單克隆抗體混合液（包括抗L3T4, Ly2, Ly1, CD19, Gr1和Ter119單克隆抗體），4-8孵育10分鐘，然后以20  l/107 cells比例加入包被抗生物素單克隆抗體的磁珠，4-8繼續(xù)孵育15分鐘，離心洗滌后用500  l洗液重懸，過柱，收集分選的細胞，用FITCNK1.1, FITCLy49A, PELy49C(BD Phar

16、Mingen,  Bioscience公司產(chǎn)品)標記，流式細胞儀檢測分選細胞中NK富集度，臺盼藍檢測活率。    供者NK細胞異體反應性的測定    用含10% FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整上述富集的供者NK細胞濃度為2×106/ ml，作為效應細胞。分別制備C57BL/6和F1來源脾細胞懸液，在體外用25 mg/ml的PHA連續(xù)刺激72小時，收集活化細胞。將NK細胞敏感的Yac1細胞及H2抗原不同的C57BL/6和F1來源的靶細胞離心洗滌后調(diào)整細胞濃度為1×105/ ml，作為靶細胞。按效靶比（

17、E/T）201、101和51，將效應細胞和不同靶細胞混合加入96孔凹孔板內(nèi)，200  l/well，然后置于37、5% CO2的條件下培養(yǎng)4小時，根據(jù)LDH殺傷試劑盒（Promega公司產(chǎn)品）的操作說明書測定各孔的細胞殺傷率。    不同預處理方案的體內(nèi)清髓效果比較    根據(jù)不同預處理方案，將28只小鼠分為4組，每組7只，分別為9 Gy TBI組，6.5 Gy TBI組，flu+cy組，flu+cy+ alloNK組。第組和第組C57BL/6小鼠分別于移植當天接受照射源為137Cs 射線9 Gy和6.5 Gy的全身照射，劑

18、量率為0.81 Gy/min。第組和第組的C57BL/6小鼠在移植前5天開始腹腔注射flu 100 mg/（kg·d）（移植前5天-移植前1天），cy 150 mg/（kg·d）（移植前2天-移植前1天），其中第組C57BL/6小鼠在移植當天同時經(jīng)尾靜脈給予供者alloNK細胞，每只小鼠2×106細胞。預處理后的小鼠不行移植，在移植后1、2、3、7和10天，分別處死小鼠，取小鼠脾臟和單根股骨，制備單細胞懸液，臺盼藍法計數(shù)脾臟單個核細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)。以正常C57BL/6小鼠的骨髓和脾臟有核細胞作為0天對照。    不同預處理方案的

19、小鼠haploidentical HSCT移植模型的建立    根據(jù)上述分組，再取72只C57BL/6小鼠行haploidentical HSCT，每組18只，建立不同預處理方案的小鼠haploidentical HSCT移植模型。第組和第組分別在照射后6小時經(jīng)尾靜脈給予（BALB/c×C57BL/6）F1小鼠的骨髓細胞，每只小鼠1.3×107細胞。第組和第組則在腹腔給藥后5天從尾靜脈給予F1小鼠的骨髓細胞每只小鼠1.3×107細胞。    不同預處理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后

20、供者植入的監(jiān)測    取行haploidentical  HSCT的C57BL/6小鼠32只，根據(jù)上述分組，每組8只，于移植后7、14、21和28天取不同預處理組的C57BL/6小鼠脾臟及骨髓，制備單細胞懸液，用FITCH2Kd單克隆抗體（BD PharMingen公司產(chǎn)品）經(jīng)流式細胞儀檢測H2d陽性細胞比例，確定受者C57BL/6鼠中供者F1鼠來源細胞的比例，對haploidentical HSCT移植后供者植入情況進行監(jiān)測。以FITCIgG2為同型對照，并取BALB/c和C57BL/6小鼠脾臟細胞分別作為陽性對照和陰性對照。  &

21、#160; 不同預處理方案的小鼠haploidentical HSCT移植后GVHD的觀察    取行haploidentical HSCT的C57BL/6小鼠40只，根據(jù)上述分組，每組10只，于移植后每日測量小鼠體重，連續(xù)觀察小鼠體重、體位、毛發(fā)、大小便及活動能力的改變。以移植前1天體重為參照，計算體重變化百分數(shù)，根據(jù)體重降低情況對移植后GVHD進行評分：0=正常，1=輕度，2=中度，3=重度。體重下降<10%為輕度，10%-20為中度，>20%為重度。同時在移植后7、14、21和28天取各組小鼠的肝臟、小腸、腎臟及皮膚標本，以甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，觀察是否存在GVHD的病理表現(xiàn)。    統(tǒng)計學分析    所有數(shù)據(jù)采用±SD表示，統(tǒng)計學分析利用SPSS 13.0軟件包，定量資料的比較采用單因素方差分析和重復測量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，p<0.05為有統(tǒng)計學意義。    結(jié)    果    供者NK細胞的富集