新型吡啶并咪唑類CDC25小分子抑制劑的抗腫瘤作用及機(jī)制研究

1、新型叱咤并咪嚏類CDC25J、分子抑制劑的抗腫瘤作用及機(jī)制研究研究背景：全世界每年死于癌癥的病人數(shù)以千萬計(jì),癌癥嚴(yán)重威脅著人類的健康和生存。雖然每種惡性腫瘤可能由不同的病因引起并具有不同的癥狀,但是它們最重要的共同特征就是腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。而細(xì)胞增殖又需要通過細(xì)胞周期來進(jìn)行調(diào)控。在細(xì)胞周期調(diào)控中起著核心作用的是CDK/Cyclin復(fù)合物,CDK/Cyclin的活性受多種因子的調(diào)控，如Weel,CDC25等。CDC251一種雙特異Tt蛋白磷酸酶,它可以去磷酸化CDK/Cyclin復(fù)合物從而使其活化，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)并調(diào)控應(yīng)對(duì)DN頗傷，在正常的細(xì)胞周期中具有重要的作用。近來很多研究表明，CDC2

2、5在多種癌癥組織中均呈現(xiàn)過表達(dá)，如結(jié)腸癌，肺癌,胃癌,乳腺癌,前列腺癌,肝癌等等,其過表達(dá)往往與腫瘤生成及癌癥的預(yù)后不良有關(guān)。由于CDC25寸細(xì)胞周期的調(diào)控作用以及在癌細(xì)胞中的異常表達(dá)，它已成為一個(gè)熱門的癌癥治療靶點(diǎn)。近年來,許多類型的化合物被發(fā)現(xiàn)并證明在體外具有抑制CDC2嘛酸酶活性的作用。這些化合物主要是以維生素K3及其衍生物為代表的釀源類化合物，另外還有喹啉二酮類化合物及萘醌類化合物等等。它們共同的特征是具有醌類結(jié)構(gòu),在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中可以誘導(dǎo)G1/S期和G2/M期的細(xì)胞周期阻滯。但是它們的效價(jià)可能因?yàn)轷€原酶而降低,并且嚴(yán)重的毒副作用和耐藥性也限制了其開發(fā)潛力。故開拓思路、尋找新結(jié)構(gòu)、新代謝

3、途徑的CDC25卬制劑勢(shì)在必行。雜環(huán)化合物在有機(jī)藥物中占有重要地位。大量的、結(jié)構(gòu)多樣性的雜環(huán)化合物的合成是發(fā)現(xiàn)具有生物學(xué)功能的化合物的源泉,尤其在抗腫瘤新藥發(fā)現(xiàn)中具有重要的地位(宋宇寧,等,CurrPharmDes.2013;19(8):1528-48.)。通過對(duì)近幾年文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn),芳雜環(huán)巰乙酸衍生物是具有廣泛的生物活性的優(yōu)勢(shì)雜環(huán)結(jié)構(gòu),引起了我們的研究興趣(宋宇寧,等,Med.Chem.Commun.2013;4:810-816;宋宇寧,等,CurrPharmDes.2013;19(40):7141-54.)。它們可以作為構(gòu)成藥效團(tuán)的基本結(jié)構(gòu)母核,通過剛性雜環(huán)及柔性巰烷鏈的協(xié)調(diào)匹配以適合藥物特

4、殊作用靶點(diǎn)的空間要求；還可以作為活性取代基或環(huán)系的組成部分而產(chǎn)生相應(yīng)的生物活性；同時(shí)具有較好的體內(nèi)代謝穩(wěn)定性及生物相容性。因此它們近期被廣泛應(yīng)用于新型抗腫瘤先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化。根據(jù)上述分析及我們近幾年在該類雜環(huán)化學(xué)及生物學(xué)方面的研究基礎(chǔ),為發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的CDC25卬制劑，構(gòu)建了含有60余個(gè)雜環(huán)琉基烷姓:衍生物的小型化合物庫，并對(duì)其進(jìn)行活性篩選,發(fā)現(xiàn)嘧啶并咪唑巰乙酮類及嘧啶并咪唑巰乙酰胺類化合物這兩大類結(jié)構(gòu)具有較好的抗腫瘤活性,根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn),推測(cè)其可能是潛在的CDC25卬制齊1J。本文對(duì)篩選出的6個(gè)化合物(CHEQ-卜CHEQ-6進(jìn)行了進(jìn)一步的活性測(cè)定，對(duì)其中藥效最為顯著的CHEQ-2

5、(1-(3,4-二羥基苯基)-2-(1-(2,4,6-三甲基苯)-1H-咪唾4,5-c叱噬-2-琉基)乙酮)，探討了其對(duì)MCF-7HepG2MHT-29三種細(xì)胞的體外抗腫瘤活性及其機(jī)制,并對(duì)其安全性及體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。研究目的：本研究對(duì)6個(gè)新型吡啶并咪唑巰烷類化合物進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其中活性最佳的CHEQ-2勺抗月中瘤活性進(jìn)彳T進(jìn)一步的研究，探討其作用機(jī)制，對(duì)發(fā)現(xiàn)高效低毒且具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型CDC25卬制劑具有重要意義.實(shí)驗(yàn)方法:以O(shè)MF的底物測(cè)定體外CDC25勺磷酸酶活性,評(píng)價(jià)該系列化合物對(duì)CDC25A口CDC25訃外酶活性的抑制作用。選用人結(jié)月癌細(xì)胞HT-29和人肝癌細(xì)胞Hep

6、G2以MTT法檢測(cè)了該系列化合物對(duì)月中瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。對(duì)篩選出的活性較好的CHEQ-2進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)其它多種不同類型月中瘤細(xì)胞生存率的影響,并與陽性化合物VK3以及XDW-M行比較。用PI染色配合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CHEQ-2寸MCF-7HepG2以及HT-29的細(xì)胞周期的影響,并用Westernblotting法對(duì)周期相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。Hochest33342染色法和流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)測(cè)定CHEQ-2寸三種腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,Westernblotting法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3,PARP,Bax以及Bcl-2的表達(dá)。用DCFH-DAf

7、e色和JC-1染色分別測(cè)定MCF-7HepG”及HT-29細(xì)胞中ROS和線粒體膜電位的變化，并用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行定量分析。用抗氧化劑NAC1處理細(xì)胞后再加入CHEQ-2a行彳用，檢測(cè)合用后ROSK平、線粒體膜電位的變化以及細(xì)胞生存率。一次性灌胃或腹腔給予小鼠2000mg/kg的CHEQ-2觀察2周內(nèi)動(dòng)物的急性毒性反應(yīng)及體重變化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，將HepG物胞接種于裸鼠腋下，檢測(cè)CHEQ-2寸月中瘤生長(zhǎng)的抑制作用，進(jìn)一步用Westernblotting法檢測(cè)了CHEQ2寸月中瘤組織中CDC25、ACDC25、BCDK、2CyclinA、CyclinB以及CyclinE的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：該系列6個(gè)叱噬

8、并咪唾類化合物對(duì)CDC25抹口CDC25B勺體外酶活性均具有一定的抑制作用，同時(shí)也在HT-29和HepG2ffi胞中表現(xiàn)出的良好的抗月中瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的作用。其中，CHEQ-2的酶抑制活性及抗月中瘤活性最佳，它可以抑制多種不同月中瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，IC50值低于VK3和XDW-1進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CHEQ-2可以下調(diào)CDC25A/BCDK2CyclinA、BE的表達(dá)，誘導(dǎo)MCF-7HepG2ffiHT-29細(xì)胞中的細(xì)胞周期阻滯，將細(xì)胞阻滯在S期。被阻滯在S期的細(xì)胞比例可達(dá)66.9%、63.7%及61.6%。CHEQ-2J可以誘導(dǎo)MCF-7HepG2ffiHT-29細(xì)胞發(fā)生凋亡.Hoechst

9、33342染色顯示，經(jīng)CHEQ-處理48h后，細(xì)胞的細(xì)胞核染色質(zhì)均出現(xiàn)不同程度的固縮濃染，有的細(xì)胞核甚至出現(xiàn)碎裂呈珠鏈狀的現(xiàn)象。通過AnnexinV/PI雙染法定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),CHEQ-23眺理組對(duì)三種細(xì)胞均作用顯著，細(xì)胞凋亡率最高可達(dá)49.5%、45.7%和52.8%。通過Westernblotting對(duì)凋亡相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明CHEQ-2以激活MCF-7HepG2ffiHT-29細(xì)胞中的Caspase-3及其下游底物PARP使其活性形式增加。還可以增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)同時(shí)降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。另外，在加入DCFH-DAt光探針后，在CHEQ-班理過的細(xì)胞中可以觀察到綠色

10、熒光增多，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明細(xì)胞中ROSK平升高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)CHEQ-230M處理48h后,MCF-7、HepG2sHT-29三種細(xì)胞中的ROSK平分別升高33.3%、359.8%及78.2%。在加入熒光探針JC-1后,可以觀察到陰性對(duì)照組的細(xì)胞呈紅色熒光,說明其線粒體膜電位較高。而經(jīng)CHEQ-230M處理的三種細(xì)胞中分別有38.0%、72.7%及36.3%的細(xì)胞呈綠色熒光,表明這部分細(xì)胞的線粒體膜電位下降,線粒體功能受損。將CHEQ-加抗氧化劑NAC用，并對(duì)合用后細(xì)胞中的ROSK平、線粒體膜電位及細(xì)胞生存率進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAC可以清除CHEQ-陰激所產(chǎn)生的ROS,使之還

11、原成正常水平,還可以消除CHEQ-明導(dǎo)的線粒體膜電位下降。另外NAC可以拮抗CHEQ-2勺抗月中瘤活性，提高月中瘤細(xì)胞的生存率。在加入CHEQ-Z前用5mMi勺NAC處理細(xì)胞，MCF-7、HepG2sHT-29的細(xì)胞生存率由37.3%、15.5%及44.7%,分別上升至57.3%、48.9%及63.2%。急性毒性實(shí)驗(yàn)中，灌胃或腹腔給予小鼠2000mg/kg的CHEQ-而,腹腔注射組有1只小鼠于給藥4h后死亡，繼續(xù)觀察14d未見小鼠再有死亡。而灌胃給藥組全部小鼠均無死亡現(xiàn)象。由此可見，腹腔給藥及灌胃給藥組LDso均高于2000mg/kg。同時(shí)對(duì)動(dòng)物的體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),灌胃給藥后對(duì)小鼠的體重沒有明顯影響,給藥組與空白對(duì)照組相比沒有顯著性差異。而腹腔給藥組在給藥1d后，會(huì)出現(xiàn)7.5%至微的體重下降，第2天即開始逐漸恢復(fù)。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，口服給予荷瘤小鼠CHEQ-210mg/kg5日1次，連續(xù)給藥2周，可明顯抑制HepG2B中瘤生長(zhǎng)，抑制率可達(dá)43.0%,且對(duì)裸鼠體重?zé)o明顯影響。Westernblotting檢測(cè)月中瘤組織蛋白顯示，CHEQ-2可以抑制月中瘤組織中CDC25ACDC25吸CyclinB的表達(dá)，抑制率分別為51.3%、61.1%?