青霉菌固體發(fā)酵三七藥材的活性成分變化研究

1、青霉菌固體發(fā)酵三七藥材的活性成分變化研究（8683）三七Panax notoginseng (Burk).F.H.Chen為五加科人參屬多年生草本植物，用于治療疾病已有悠久歷史,是我國的傳統(tǒng)珍貴藥材1?，F(xiàn)代藥理研究表明,三七具有活血、止血、保護心肌、降血糖、提高記憶力、滋補強壯、免疫調(diào)節(jié)等療效2-3。在臨床上可應(yīng)用于治療血栓、心腦血管疾病、肝炎、頑固性頭痛等。三七總皂苷(PNS)是三七中主要的生理活性成分，含量在三七中高達6%4，是三七發(fā)揮藥效的主要成分5，其中尤以含量較低的稀有皂苷活性較強，生物利用度較高，對于誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡6、逆轉(zhuǎn)白血病細胞耐藥7、調(diào)節(jié)蛋白激酶C的活性8及抑制腫瘤細胞的增

2、殖9等都具有很好的療效，因此，如何提高稀有皂苷的含量就成為了三七藥材深度開發(fā)利用的熱點內(nèi)容。利用微生物對中藥材進行生物轉(zhuǎn)化目前已經(jīng)可以成熟的應(yīng)用到中藥炮制和加工的領(lǐng)域中，通過中藥發(fā)酵可以達到改變藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)，提高有效成分含量，降低毒副作用等目的。青霉菌（Penicillium sp.）是環(huán)境中的常見菌種，生長速度快，環(huán)境適應(yīng)能力強，且生物安全性較高，非常適用于在中藥基質(zhì)上生長10-14；本課題組前期發(fā)現(xiàn)三七藥材自然貯存過程中，非常容易感染青霉。本實驗首先利用青霉菌對三七藥材進行發(fā)酵，然后采用LC-MS方法，對青霉菌發(fā)酵三七藥材過程中，主要活性成分的變化進行檢測，考察稀有皂苷的產(chǎn)生和積累過程，

3、為指導(dǎo)三七藥材的開發(fā)和利用以及稀有皂苷的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。2 材料與方法2.1 實驗材料Agilent 1260 高效液相 (Agilent Technologies, USA)、Agilent 6520 Q-TOF 質(zhì)譜儀(Agilent Technologies, USA)；生物安全柜（Thermo scientific 1300 A2）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（金壇市天竟實驗儀器廠）； TG328A（S）分析天平（ 北京斯達恒通科技有限公司）； 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；真空干燥箱（DZF-6090）；高速萬能粉碎機（FW100型）；藥典篩一、四號（浙江上虞市五

4、四儀器廠）；廣口三角瓶（250ml）。乙腈、甲醇為色譜純（Thermo scientific），甲酸為質(zhì)譜純（Sigma），其他化學(xué)試劑均為分析純（北京化工廠）。青霉菌（CICC 2515）購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，復(fù)蘇后先于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上擴繁，積累到一定生物量后，4斜面保存，備用。2.2 實驗方法2.2.1 三七藥材固體發(fā)酵三七藥材粉碎（過1號篩），加入60%（V/W）的蒸餾水水，攪拌均勻，分裝于250ml廣口瓶中，放入高壓蒸汽滅菌器中保持溫度121，滅菌60min，取出，自然冷卻至室溫，在生物安全柜中接種青霉菌適量，待接種完成后放入溫度為28，濕度65%的恒溫

5、恒濕培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20天，備用。2.2.2發(fā)酵產(chǎn)物分析2.2.2.1 對照品溶液的制備精密稱定人參皂苷Rh1、人參皂苷F1、人參皂苷Rg3、人參皂苷F2、人參皂苷Rh2和人參皂苷CK對照品適量，用甲醇溶解稀釋成每1 mL含單體皂苷各0.03mg的溶液，即為對照品溶液。2.2.2.2發(fā)酵產(chǎn)物及對照藥材樣品的制備 取2.2.1項下發(fā)酵產(chǎn)物，置于減壓真空干燥箱干燥，粉碎。取本品粉末、三七藥材粉末（過四號篩）0.2g，精密稱定，精密加入甲醇4ml，稱定重量，超聲處理60min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，0.22um濾膜過濾，備用。2.2.3 分析條件的選擇2.2.3

6、.1色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-AQ (4.6×250 mm，5 um)流速：1.0ml/min；柱溫：室溫；檢測波長：203nm；進樣量：10ul洗脫條件：見表1表1 色譜洗脫條件Table 1 Chromatographic condition時間（min）0.1%甲酸乙腈(%)0.1%甲酸水(%)0351981355519298171557029717010029407160100120409060102.2.3.2質(zhì)譜條件離子源：ESI；電離模式：Negative；噴霧器壓力：30 psi；干燥氣（N2）流速：10 L/min；干燥氣溫度：350；毛細

7、管電壓：3500V；碎裂電壓：175V；錐孔電壓：65V；質(zhì)量檢測范圍(m/z）：300-1400；數(shù)據(jù)分析軟件：Agilent MassHunter Workstation software-Qualitative Analysis (version B.04.00, Build 4.0.479.5, Service Pack 3, Agilent Technologies, Inc. 2011)。2.2.4 方法學(xué)考察2.2.4.1精密度考察 取同一供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，并計算共有峰與特征峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，計算RSD值。結(jié)果表明共

8、有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，說明該方法精密度符合要求。2.2.4.2 重復(fù)性考察 取同一批次三七發(fā)酵產(chǎn)物樣品6份，依2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.2.3項下色譜條件測定，記錄色譜圖，并計算共有峰與特征峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，計算RSD值。結(jié)果表明共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，說明該方法精密度符合要求。2.2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液分別于制備后0，2，4，6，8，10h按2.2.3項下色譜條件測定，記錄色譜圖，并計算共有峰與特征峰的相對保留時間和相對峰面積的一致性，計算RSD值。結(jié)果表明共有峰的相對保留時間和相

9、對峰面積的RSD值均小于3%，說明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。3 結(jié)果3.1 色譜峰歸屬由圖1可知，三七藥材經(jīng)青霉菌固體發(fā)酵后主要活性成分發(fā)生較大變化。根據(jù)分子量和結(jié)構(gòu)裂解規(guī)律，我們推斷1-12號色譜峰均為皂苷類成分。通過查閱大量文獻15-19對皂苷類成分的分子量、極性的大小及相對保留時間，進行歸納總結(jié)，將色譜峰1、2、3、6、8、9分別指認為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd和Rh4；經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品對照，色譜峰4、5、10、11和12分別鑒定為Rh1、F1、F2、Rg3和CK；色譜峰7的m/z = 637.4451 M-H-，計算分子式為C36H62O9，是人參皂苷Rh1和F1

10、的同分異構(gòu)體，根據(jù)三七及其加工產(chǎn)品成分分析的文獻報道，推測該化合物為Sanchinoside B1 20。具體的色譜峰歸屬結(jié)果見表2。圖1 混標(biāo)和發(fā)酵產(chǎn)物MS總離子流圖Figure 1 MS total ion chromatogram (TIC) of the mixed standards and fermentation product表2 色譜峰指認Table 2 Identification of the chromatographic peaksSequence numberTimeM-HIdentification125.98931.5347R1233.76799.5020Rg1

11、341.23945.5500Re467.02637.4463Rh1 571.54637.4479F1 679.851107.5915Rb1783.27637.4451Sanchinoside B1889.60945.5498Rd997.28619.4359Rh410105.48783.4971F211106.52783.4962Rg312111.92621.4526CK3.2 藥材及發(fā)酵產(chǎn)物皂苷含量變化由圖2可以看到，三七藥材經(jīng)過發(fā)酵之后，原生苷R1、Rg1、Re以及Rb1的含量均有不同程度的降低，而極性較低的稀有皂苷含量均有大幅度的提高；通過液質(zhì)聯(lián)用的定量模式，記錄不同色譜峰發(fā)酵前后的峰面積

12、變化（結(jié)果見表3），并利用下面的公式計算含量變化百分比：含量變化（%）=三七發(fā)酵產(chǎn)物峰面積三七藥材峰面積×100%三七藥材峰面積結(jié)果表明：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1經(jīng)發(fā)酵后含量分別降低64.15%、6.89%、1.99%、87.84%；而人參皂苷Rd和F2的含量提高顯著，分別提高161.20%和372.35%；同時，在青霉發(fā)酵后的三七中檢出了稀有皂苷F1、Sanchinoside B1、人參皂苷Rg3和人參皂苷CK。圖2 三七發(fā)酵前后總離子流圖對比Figure 2 TIC comparison between panax notoginseng and

13、 the fermentation product表3 藥材及發(fā)酵產(chǎn)物皂苷峰面積Table 3 Peak areas of different saponins in panax notoginseng and the fermentation product序號皂苷名稱三七藥材峰面積（Intensity）三七發(fā)酵產(chǎn)物峰面積（Intensity）1R121924327860252Rg132043845298342333Re164243916096814Rh11877475136827055F152746756Rb176550019309137SanchinosideB160788398Rd15

14、7898141243429Rh4378989910F2523449247253311Rg373551212CK3650685注：“”未檢出。4 討論通過上述實驗結(jié)果，我們得出青霉菌可以對三七藥材中皂苷類成分進行轉(zhuǎn)化，并提高稀有皂苷含量，使得到的發(fā)酵產(chǎn)物展現(xiàn)出較高的臨床應(yīng)用價值和挖掘潛力，為指導(dǎo)三七藥材的開發(fā)和利用以及稀有皂苷的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)。然而，利用提取離子模式（EIC）對特定分子量的黃曲霉素和赭曲霉素進行檢測，并未發(fā)現(xiàn)明顯的微生物毒素產(chǎn)生，推測可能是在三七藥材基質(zhì)上生長抑制了青霉合成微生物毒素的能力，因此，利用青霉菌發(fā)酵三七，提高活性成分含量，改造藥材品質(zhì)具有一定的可行性。參考文獻

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