實驗一植物DNA的提取與純化

1、百度文庫-讓每個人平等地提升自我實驗一 植物DNA的提取與純化一、實驗?zāi)康模赫莆罩参顳NA的提取與純化的原理和一般步驟。二、實驗原理：植物DNA的分離是分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和育種學(xué)等植物科學(xué)研究的基礎(chǔ)要求。對DNA提取一般有三個要求：1. DNA的純度可以滿足下游操作的要求；2. DNA必須完整;3. DNA應(yīng)當(dāng)有足夠的量。一般來說構(gòu)建基因組文庫，初始DNA長度必須在100kb以上,否則酶切后兩邊都帶 合適末端的有效片段很少。而進(jìn)行RFLP和PCR分析，DNA長度可短至50kb,在該長度以上，可保證酶切后產(chǎn)生 RFLP片段（20kb以下），并可保證包含 PCR所擴(kuò)增的片段（一 般2kb以下）。天

2、然狀態(tài)的DNA是以脫氧核糖核蛋白（DNP）形式存在于細(xì)胞核中。要從細(xì)胞中提取 DNA時，先把DNP抽提出來，再把蛋白質(zhì)和糖去除，同時除去 RNA及無機(jī)離子等，從 中分離DNA 。提取植物DNA的方法主要采用 SDS和CTAB法，對它們進(jìn)行稍加修改就可以應(yīng)用于 DNA的微量提取。兩種方法均采用去污劑裂解細(xì)胞并保護(hù)DNA不受內(nèi)源核酸內(nèi)切酶降解。本實驗采用SDS法提取DNA。SDS是有效的陰離子去垢劑，細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之 間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合，SDS能夠破壞這種價鍵。具體方法簡單說來就是利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。細(xì)胞提取液中含有的 SDS溶解膜蛋白而破壞細(xì) 胞膜，使蛋白質(zhì)變

3、性而沉淀下來。EDTA卬制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的 DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀。三、實驗材料和試劑：1 .實驗材料：新鮮植物組織（小麥嫩葉） 。2 .器材：研缽和研棒、水浴鍋、離心機(jī)、移液器及槍頭、離心管。3 .藥品試劑：提取液、無水乙醇、70%乙醇、TE緩沖液、氯仿：戊醇（24:1）。四、實驗步驟：1 .取新鮮葉片約3g,剪碎，加入液氮充分研磨后轉(zhuǎn)移至2ml離心管中；2 .在65c預(yù)熱的提取液中按 L加入Na Bisufite , 充分混勻；3 .在管中加入適量提取液，60c水浴保溫約30min,不時顛倒混勻；4 .冷卻至室溫后加入等體積氯仿 /異戊醇，用力搖勻后，放

4、置搖床上搖動15min左右；5 .室溫下 10000rpm離心15min,小心吸上清于新的離心管中，加入兩倍體積的冷酒精， -20 C放置 1h；/6 .挑出DNA置于新的管中。加入適量 70%酒精，搖動洗滌10min,重復(fù)洗滌2-3次；7 .吹干DNA,加入適量TE在65c溶解，4c或-20C貯存。/五、實驗結(jié)果：如下圖所示，所提 DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如示：12百度文庫-讓每個人平等地提升自我其中第八泳道（從右至左，箭頭所指）為我們所提DNA的電泳結(jié)果?？梢钥闯鲇袃蓷l比較亮的帶，其中靠近點樣孔的條帶為DNA帶，遠(yuǎn)離點樣孔的條帶為 RNA帶。由于此次實驗沒有對RNA消化，所以泳道有 RN

5、A條帶。 六、注意事項：1 .盡量取材幼嫩組織，最好在早晨取材，可以避免過多的糖分污染；2 .提取液不能加入過多，否則影響后續(xù)反應(yīng)的進(jìn)行；3 .加入提取液后應(yīng)多次顛倒混勻，以確保反應(yīng)充分進(jìn)行，顛倒不能過于劇烈，劇烈顛倒會導(dǎo)致DNA分子的斷裂；4 .加入氯仿：戊醇后要劇烈搖晃，確保雜質(zhì)去除徹底；5 .微量移液槍的使用一定要規(guī)范，吸取氯仿等有機(jī)試劑要注意不要將試劑吸入槍中。22百度文庫-讓每個人平等地提升自我實驗二PCR和分子標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用一、實驗?zāi)康模赫莆誔CR的基本操作及分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用。2、 實驗原理：/PCR原理：類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增 DNA?模板加熱變性解鏈，隨之將 反

6、應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高 使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以延伸。？這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個 PCR 循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。DNA分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)。分子標(biāo)記具有數(shù)量 豐富、信息量大、與生長發(fā)育無關(guān)，取材不受限制；較多共顯性，信息量完整在真核生 物中，基因組DNA多態(tài)性要遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于各種基因的遺傳多態(tài)性，因為基因組中存在著大 量的不編碼的 DNA序列，它們的變異不受或較少地受自然選擇的制約?？梢杂糜诜N質(zhì) 資源研究、品質(zhì)純度鑒定、構(gòu)建遺傳連鎖圖、基因定位(QTD、標(biāo)記輔助選擇、比

7、較基因組研究、基因克隆(圖位克隆)、生物起源進(jìn)化的研究。(1) RFLP物種的基因組 DNA在限制性內(nèi)切酶作用下，產(chǎn)生相當(dāng)多的大小不等的 片段，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA作探針，把與被標(biāo)記 DNA相關(guān)的片段檢測出來，從 而構(gòu)建出多態(tài)性圖譜。優(yōu)點：共顯性，非常穩(wěn)定。缺點：檢測步驟多，周期長，費(fèi)時、 費(fèi)錢；用作探針的DNA克隆制備、保存不方便。(2) RAPD只需一個長度9-10個核甘酸的隨機(jī)引物，退火溫度低。優(yōu)點：實驗步 驟少，省工、省力、進(jìn)度快；不需先知道基因組白任何分子信息；所用材料不需有性世代，可用任何單一親本、任何部位的材料，在沒有有性世代的線粒體、葉綠體 ？DNA研 究中也可使用；引

8、物沒有嚴(yán)格的種屬界限，同一套引物可用于任何一種植物的研究，具 有廣泛性和通用性。 缺點：顯性標(biāo)記，無法區(qū)別顯性純合體和雜合體；對反應(yīng)條件敏感，重復(fù)性差。包括模板濃度、Mg2+濃度，PCR反應(yīng)中條件的變化等；存在共遷移問題，不同個體相同分子量的片段不一定同源；一條帶可能包含不同的產(chǎn)物。(3) AFLP對基因組DNA進(jìn)行酶切，連上雙鏈人工接頭，根據(jù)接頭的核甘酸序列 和酶切位點設(shè)計引物，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。在不需要DNA序列的情況下，利用一套特定引物可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段。它將RAPD隨機(jī)性和專一性擴(kuò)增巧妙結(jié)合，再選用內(nèi)切酶以達(dá)選擇的目的。(4) SSR在基因組中，每個 SSR序列的基本單兀

9、重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很 大，從而形成其座位的多態(tài)性。優(yōu)點：SSR數(shù)量多且均勻分布在基因組中；微衛(wèi)星 DNA具有豐富的多態(tài)性， 并且微衛(wèi)星是共顯性標(biāo)記， 位點檢測可以顯示純合子和雜合子；/微 衛(wèi)星檢測容易、重復(fù)性較好、省時，適合于進(jìn)行自動化分析。缺點：要了解SSR1位的側(cè)翼序列，必須進(jìn)行大量的測序工作。(5) STS STS標(biāo)記是根據(jù)單拷貝的 DNA片斷兩端的序列，設(shè)計一對特異引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增基因組DNA而產(chǎn)生的一段長度為幾百 bp的特異序列。/(6) SNP繼RFLP和SSB后出現(xiàn)的第三代分子標(biāo)記，指染色體基因組水平上某個 特定位置單堿基的置換或插入缺失引起的DNA序列多態(tài)性。3、

10、實驗材料和試劑：/1 .實驗材料：實驗1所提小麥DNA2 .器材：PCR儀、電泳儀、移液器、槍頭、離心管3 .藥品試劑：SSR弓I物、反應(yīng)緩沖液、 Mg2+、dNTP、rTaq、上樣緩沖液 四、實驗步驟：33百度文庫-讓每個人平等地提升自我反應(yīng)：在離心管管中分別加入1uL DNA模板、SS時物、1uL緩沖?夜、dNTP、Mg2+、ddH2。、 rTaq2 .將加好樣后的離心管放入 PCR儀中，按下述程序進(jìn)行 PCR擴(kuò)增：94c預(yù)變性5分鐘， 94c 45秒、36c 40秒、72C1分鐘，連續(xù)40個循環(huán)，最后在 72c延伸5分鐘。3 .擴(kuò)增完畢后，取1uL擴(kuò)增產(chǎn)物加4uL ddH2。、1uL上樣

11、緩沖液，混勻后取進(jìn)行 PAGE電 泳檢測。五、實驗結(jié)果：如下圖所示，所得的13泳道（從左至右，箭頭所指）為我們實驗的結(jié)果。所選的Marker 分子量過大沒有跑開。通過實驗結(jié)果可以明顯看到有一條很亮的帶，即為SSRT增的結(jié)果，但其上方還有幾條很弱的帶，排除引物特異性差的原因，可能是由于 Mg2+濃度過高或酶過量等原因引起的?？v觀全圖，可以看出有3種SSR擴(kuò)增產(chǎn)物，可以認(rèn)為這是由于不同的小麥 品種差異所引起的。六、注意事項：1 .反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響非常大：DNA模板的純度要高，完整性好，濃度適宜；引 物具有特異性，濃度適宜；鎂離子濃度必須掌握好。2 .正向和反向引物的 Tm相差不能過大，要

12、避免形成引物二聚體。3 . PCR反應(yīng)前要進(jìn)行預(yù)變性，循環(huán)數(shù)要適宜。44百度文庫-讓每個人平等地提升自我實驗三 用于大分子分離的電泳技術(shù)一、實驗?zāi)康模赫莆针娪炯夹g(shù)的原理和方法二、實驗原理：/電泳技術(shù)，是指在電場作用下，帶電顆粒在由于所帶的電荷不同以及分子大小差異 而有不同的遷移行為從而彼此分離開來的一種實驗技術(shù)。 許多生物分子都帶有電荷，其 電荷的多少取決于分子結(jié)構(gòu)及所在介質(zhì)的pH值和組成。由于混合物中各種組分所帶電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及相對分子質(zhì)量的不同，在同一電場的作用下， 各組分泳動的方向和速率也各異。因此，在一定時間內(nèi)各組分移動的距離也不同，從而達(dá)到分離鑒定各組 分的目的。/電泳技術(shù)主要

13、用于分離各種有機(jī)物（如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、脂類、核甘酸、核酸等）和無機(jī)鹽；也可用于分析某種物質(zhì)純度，還可用于分子量的測定。1 .瓊脂糖凝膠電泳原理：'在pH值為 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB ）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖凝膠分離DNA度大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp 至近 50kb 的 DNA 段。2 .聚丙烯酰胺凝

14、膠電泳原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱 PAGE是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺 凝膠是由單體的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學(xué)聚合和光聚合。 化學(xué)聚合通常是加入催化劑過硫酸俊（AP）以及加速劑四甲基乙二胺 （TEMED）,四甲基乙二胺催化過硫酸錢產(chǎn)生自由基。聚丙烯酰胺凝膠電泳，普遍用于分離蛋白質(zhì)及較小分子的核酸。聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辯力極高，甚至相差1bp的DNA段就能分開。聚丙 烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進(jìn)行

15、電泳。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分為變性聚丙烯酰胺凝膠和非變性聚丙烯酰胺凝膠兩種。變性聚丙烯酰胺凝膠常用于用于單鏈DNA片段的分離或純化，非變性聚丙烯酰胺凝膠用于雙鏈DNA片段的分離和純化。/三、實驗材料加試劑：/1 .器材：垂直電泳槽、玻璃板、電泳儀、墊片、膠頭吸管、移液器、三角瓶2 .藥品試劑：丙烯酰胺、 N,N'-甲叉雙丙烯酰胺、Tris堿、硼酸、加樣緩沖液、瓊脂糖膠 四、實驗步驟： /1、按要求裝配好垂直電泳板， 兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用1%的瓊脂糖封邊，防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出。2、將裝好的玻璃電泳板傾斜成、4560 c角。/3、按表3配制所需濃度凝膠的毫升數(shù)。4、加入TEMED后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時為 止。5、立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使成 10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會。55百度文庫-讓每個人平等地提升自我6、室溫聚合一小時后，將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入X TB沖液。7、小心取出梳子，加樣。五、實驗結(jié)果：由于時間有限，我們只制備了聚丙烯酰胺凝膠,'>