標(biāo)書(shū)-ceRNA介導(dǎo)的miR-7SP1IGF-1R調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機(jī)制

1、ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路影響胃痛細(xì)胞惡性表型的研究機(jī)制中文摘要胃癌作為最常見(jiàn)的惡性腫病之一已嚴(yán)重威脅人們的健康，對(duì)其發(fā)生發(fā) 展的機(jī)制研究巳成為當(dāng)今腫瓶研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性*pethig endogenous RNA, ceRNA)在癌癥發(fā)生發(fā)展的的作用已日益被重視。我們通過(guò)預(yù) 實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：Spl為miR-7的直接耙基因；IGF1R的3' UTR區(qū)存在miR7 的結(jié)合位點(diǎn)；胃痛細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染IGF_1R 3' UTR序列能明顯逆轉(zhuǎn)miR-7對(duì)Spl 的抑制作用。由此我們推出假說(shuō)：IGF_1R 3' UTR作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA (

2、ceRNA),參與iniR_7/Spl/IGFlR調(diào)控環(huán)路。本課題擬以SGC7901胃痛細(xì)胞 為模型，以轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、基因回復(fù)等手段，全面分析ceRNA (IGF-1R 3' UTR) /miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控通路對(duì)胃痛表型的影響，從而為尋找胃痛的 治療配點(diǎn)提供依據(jù)。英文摘要(一)立項(xiàng)依據(jù)與研究?jī)?nèi)容L項(xiàng)目的立項(xiàng)依據(jù)一、ceRNA在腫瘤中的作用腫瘤分子生物學(xué)的研究表明細(xì)胞癌變是多基因異常調(diào)控導(dǎo)致的結(jié)果，主要 的改變包括癌基因的活化和抗癌基因的失活?，F(xiàn)有的結(jié)果表明，胃癌癌變過(guò)程中 有多種基因的異常改變，但目前時(shí)胃癌癌變過(guò)程中基因變異的規(guī)律,特別是與胃癌 發(fā)生直接相關(guān)的

3、基因變化還不清楚。因此尋找胃癌疾病的易感基因是胃癌癌變機(jī) 理研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性*peting endogenous RNA, ceRNA)在癌癥發(fā)生發(fā)展的的作用已成為研究熱點(diǎn)：Pandolfi等1人認(rèn)為這種ceRNA活 性能形成一種大規(guī)模轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以擴(kuò)大人類基因組中的功能性遺傳信息。他們認(rèn)為這種活性通過(guò)miRNAs應(yīng)答元件(microRNAs response elements, MREs), 可以作為mRNAs轉(zhuǎn)錄假基因，以及長(zhǎng)鏈非編碼RNAs相互“交流”的新語(yǔ)言， 此外ceRNA活性也在癌癥中扮演了重要角色，因此對(duì)于解開(kāi)一些癌癥研究之謎 具有重要意義。Xia等人研究

4、表明在胃癌中存在著長(zhǎng)鏈非編碼RNA和微小 RNA通過(guò)MREs而相互作用的網(wǎng)絡(luò)從而調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。Liu等人證實(shí) 長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOTAIR作為ceRNA抑制胃癌的生長(zhǎng)，侵襲并且促進(jìn)其凋亡。由此可見(jiàn)，越來(lái)越多的研究表明，ceRNA正H趨成為胃癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。ceRNA假說(shuō)是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，其核心內(nèi)容是具有相同MREs的mRNA、假基 因轉(zhuǎn)錄物、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等轉(zhuǎn)錄物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合同種miRNA來(lái)調(diào)控各自的表達(dá)水平， 從而影響細(xì)胞的功能。miRNA作為ceRNA假說(shuō)的核心，而miRNA主要通過(guò)與轉(zhuǎn)錄物3,非翻 譯區(qū)-untranslated region, 歲-UTR)的M

5、RE互配對(duì)來(lái)沉默基因的表達(dá)，所以3，-UTR值得我 們重點(diǎn)關(guān)注。早在1993年，研究者就已發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)一些基因的3，-UTR會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分化，究 其原因，相當(dāng)反式作用因子調(diào)控了細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。這一現(xiàn)象可以通過(guò)ceRNA 假說(shuō)加以解釋：過(guò)表達(dá)的才-UTR與細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄物具有相同的MRE,當(dāng)3，-UTR 表達(dá)上調(diào)時(shí)，它就會(huì)結(jié)合大量的本來(lái)能與這些分化相關(guān)基因mRNA結(jié)合的miRNA,從而解 除了對(duì)細(xì)胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后抑制作用，結(jié)果促進(jìn)了細(xì)胞分化。引-UTR在此過(guò)程中發(fā)揮 了反式作用因子的作用?；谝陨侠碚摬浑y發(fā)現(xiàn)，ceRNA確實(shí)在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用，W 此對(duì)ceRNA形

6、式和作用機(jī)制的進(jìn)一步研究將有助于拓展我們對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)理的 認(rèn)識(shí)，也有助于建立新的診治方法。二、腫病細(xì)胞的惡性表型與miRNA的研究微小RNA(microRNA, miRNA)是一組由基因組編碼的長(zhǎng)度約2023個(gè)核昔酸的非編碼RNA,通過(guò)與耙基因的互補(bǔ)配對(duì)，降解相應(yīng)的mRNA和抑制翻譯，以負(fù)性調(diào)控耙基因的表達(dá)。大量研究已證實(shí)，每個(gè)miRNA可以有多個(gè)耙基因， 而幾個(gè)miRNA也可以共同調(diào)節(jié)同一個(gè)耙基因。miRNA及其耙基因種類繁多并且 數(shù)目巨大，廣泛參與到細(xì)胞信號(hào)的調(diào)節(jié)，近年發(fā)現(xiàn)50%以上的miRNA基因定位 于腫瘤相關(guān)的染色體座位或其脆性位點(diǎn)，直接或間接導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生。大量的文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)mi

7、RNA對(duì)胃癌的發(fā)生發(fā)展同樣發(fā)揮著重要的作用。例 如，MiR-145, miR-133a和miR-133b能通過(guò)靶向抑制Spl的表達(dá)而調(diào)控胃癌細(xì) 胞的周期進(jìn)程6; MiR-22同樣也可以靶向抑制Spl的表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞的 侵襲和轉(zhuǎn)移7; MiR-1271通過(guò)靶向抑制IGF1R的表達(dá)從而調(diào)控胃癌細(xì)胞的耐藥 性8。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：MiR-7在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)并且與病人的預(yù)后相 關(guān)，在體外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)MiR-7的表達(dá)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制（見(jiàn)工作基礎(chǔ)）。 提示MiR-7對(duì)胃癌的惡性表型有著重要的作用。三、ceRNA介導(dǎo)的miR7/SPVIGFlR調(diào)控環(huán)路影響胃痛細(xì)胞惡性衰型Spl屬于Sp/類K

8、rppel轉(zhuǎn)錄因子家族（Sp/KLF家族）是參與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 的高度相關(guān)的鋅指蛋白，以細(xì)胞和啟動(dòng)子特異性方式通過(guò)富含GC啟動(dòng)子的基因 表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能如細(xì)胞增生、凋亡、分化和腫瘤形成，依功能不同可以 分為四部分：DNA結(jié)合區(qū)域、Spl的活化區(qū)、Btd盒以及Spl盒9, 10。Spl的 活化區(qū)可以形成四聚體，四聚體的形成是結(jié)合有Spl的DNA彎曲成環(huán)狀，從而 有利于遠(yuǎn)處的Spl的蛋白轉(zhuǎn)移到啟動(dòng)子上，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。已形成的Spl四 聚體還能招募更多的四聚體與DNA環(huán)連接處相結(jié)合，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄啟到正反饋調(diào) 控作用。而B(niǎo)td盒以及Spl盒則可能參與到Spl轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。Spl蛋白在多種 腫瘤組織

9、中都有高表達(dá)10。Zhang等11人發(fā)現(xiàn)，在同一患者體內(nèi)，腫瘤組織中 的Spl表達(dá)水平顯著高于周圍正常組織；且與腫瘤的浸潤(rùn)程度呈正相關(guān)。Spl過(guò) 表達(dá)的患者中位生存期顯著低于低表達(dá)或者不表達(dá)的Spl的胃癌患者，此外下調(diào)Spl的表達(dá)則顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)12。因此，目前Spl可以被認(rèn)為是一個(gè) 促癌蛋白。在前期研究中：我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)MiR-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Spl 的表達(dá)受到明顯的抑制，隨后通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Spl 3，-UTR區(qū)存在 MiR-7的結(jié)合位點(diǎn)，最后我們用熒光素醴報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 Spl為MiR-7的直接 耙基因。腹島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF1R）是一跨膜受體，屬于受體酪氨

10、酸激誨，其 基因定位于染色體15q25-26,在核糖體中合成。IGF1R表達(dá)于多種類型的細(xì)胞 表面，可以促進(jìn)機(jī)體的蛋白質(zhì)和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代謝。而且 它與細(xì)胞的生長(zhǎng)分化、胚胎的發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)過(guò)度時(shí)，細(xì)胞則可以向惡 性表型轉(zhuǎn)化。目前在多種腫瘤中包括乳腺癌，結(jié)腸癌，小細(xì)胞肺癌都檢測(cè)到IGF1R 的表達(dá)異常。Li等13人發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)IGF1R可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的血管生長(zhǎng)從而促 進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)MiR-7的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IGF1R的表 達(dá)受到明顯的抑制，隨后通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IGF1R 3，-UTR區(qū)存在MiR-7 的結(jié)合位點(diǎn)，最后我們用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證

11、實(shí)了 IGF1R為MiR-7的直接耙基 因。此外,我們采用Chip M叩per（）數(shù)據(jù)庫(kù)在IGF1R的啟動(dòng)子區(qū)的 保守序列中成功篩選Spl的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖），提示Spl也可能直接調(diào)控IGF1R 的轉(zhuǎn)錄。四、科學(xué)假說(shuō)的內(nèi)容與意義基于上述理論以及前期相關(guān)研究工作，申請(qǐng)人提出擬解決的科學(xué)問(wèn)題 “ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機(jī) 制”。本研究擬構(gòu)建不同胃癌細(xì)胞系模型，初步探索ceRNA調(diào)控胃癌細(xì)胞惡 性表型的機(jī)制；（2）明確miR-7在胃癌在組織與胃癌周圍組織表達(dá)量，同時(shí)在不 同胃癌細(xì)胞系的進(jìn)一步驗(yàn)證；（3）確立miR

12、-7與Spl和IGF1R之間的耙向調(diào)控關(guān) 系；(4)驗(yàn)證胃癌細(xì)胞中Spl和IGF1R之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系；(5)探索Spl和IGF1R 3，-UTR介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控胃癌細(xì)胞惡性表型的影響；(6)確認(rèn) ceRNA在體內(nèi)的抑制成瘤作用。上述思路是建立在課題組成員多年來(lái)對(duì)胃癌發(fā) 生發(fā)展的機(jī)理探討的基礎(chǔ)上，結(jié)合國(guó)內(nèi)的研究進(jìn)展，在體外實(shí)驗(yàn)中逐步驗(yàn)證 ceRNA在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮的作用。為探索ceRNA在胃癌發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用 具有重要的意義，為尋求胃癌新的治療耙點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。圖1科學(xué)假說(shuō)示意圖1 . Salmena L, Poliseno L, Tay Y, Kats L, Pan

13、dolfi PP. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language?JCell.2011,146(3):353-8.2 . Xia T, Liao Q, Jiang X, et al. Long noncoding RNA *peting endogenous RNAs in gastric cancerJSci Rep.2014,4:6088.3 . Liu XH, Sun M, Nie FQ, et al. Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RN

14、A to regulate HER2 expression by sponging miR-331-3p in gastric cancerJMol Cancer.2014,13:92.4 . Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functionsJCell.2009,l 36(2):215-33.5 . Rastinejad E Blau HM. *plementation reveals a novel regulatory role for 3' untranslated regions in growt

15、h and differentiationJCell. 1993,72(6):903-17.6 . Qiu 1, Zhou X, Wang J, et al. MiR-145, miR-133a and miR-133b inhibit proliferation, migration, invasion and cell cycle progression via targeting transcription factor Spl in gastric cancerJFEBS Lett.2014,588(7):1168-77.7 . Guo MM, Hu LH, Wang YQ, et a

16、l. miR-22 is down-regulated in gastric cancer, and its overexpression inhibits cell migration and invasion via targeting transcription factor SplJMed Oncol.2013,30(2):542.8 . Yang M, Shan X, Zhou X, et aL niiR-1271 regulates cisplatin resistance of human gastric cancer cell lines by targeting IGF1R,

17、 IRS1, mTOR, and BCL2JAnticancer Agents Med Chem.2014,14(6):884-91.9 . Black AR, Black JD, Azizkhan-CIifford J. Spl and kruppel-like factor family of transcription factors in cell growth regulation and cancerJJ Cell Physiol.2001,188(2): 143-60.10 . Safe S, Abdelrahim M. Sp transcription factor famil

18、y and its role in cancerJEur J Cancer.2005,41(16):2438-48.11 . Zhang J, Zhu ZG, Ji J, et al. Transcription factor Spl expression in gastric cancer and its relationship to long-term prognosis J World J Gastroenterol.2005,11(15):2213-7.12 . Lou Z, O'Reilly S, Liang H, Maher VM, Sleight SD, McCormi

19、ck JJ. Down-regulation of overexpressed spl protein in human cell lines inhibits tumor formationJCancer Res.2005,65(3): 1007-17.13 . Li H, Adachi 丫 Yamamoto H, et al. Insulin-like growth factor-1 receptor blockade reduces tumor angiogenesis and enhances the effects of bevacizumab for a human gastric

20、 cancer cell line, MKN45JCancer.2011/117(14):3135-47.2.項(xiàng)目的研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)、以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。(此部分為重點(diǎn)闡述內(nèi)容)*研究?jī)?nèi)容第一部分 分析IGF-1R、miR-7、Spl在胃癌中的表達(dá)及ceRNA (IGF-1R3，UTR序列)、miR-7、 Spl對(duì)胃癌惡性表型的影響；1 .檢測(cè)正常胃粘膜上皮組織及胃癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)(其中miR-7、Spl的表達(dá)檢測(cè)已完成）。2 .建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）、miR-7、Spl的不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞 模型。3 .在上述細(xì)胞模型中分析細(xì)胞增

21、殖、侵襲和遷移的生物學(xué)行為變化，RNA測(cè)序 分析篩選差異表達(dá)基因，檢測(cè)可能信號(hào)通路變化，初步確定胃癌發(fā)生發(fā)展中 IGF-1R3PTR序列、IGF-1R、m退-7、Spl對(duì)下游通路的影響。第二部分明確Spl是miR-7的直接作用耙點(diǎn)；1 .在miR-7不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞系中檢測(cè)Spl的mRNA及蛋白表達(dá)水平 （蛋白檢測(cè)已完成）。2 .克隆含有Spl 3，UTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素誨報(bào)告載體，通過(guò)熒光素語(yǔ) 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-7對(duì)Spl的直接調(diào)控。（預(yù)實(shí)驗(yàn)已完成）。第三部分 明確ceRNA （IGF-1R3PTR序列）能作用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對(duì)Spl的抑制作用。

22、1 .克隆含有IGF-1R 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素磁報(bào)告載體，通過(guò)熒光 素醴報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)IGF-1R3PTR區(qū)與miR-7的直接結(jié)合效應(yīng)。2 .在IGF-1R 3PTR不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型中檢測(cè)Spl的蛋白及mRNA 水平。第四部分 驗(yàn)證Spl對(duì)IGF-1R的調(diào)控；1 .在Spl不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞中檢測(cè)IGF-1R的蛋白及mRNA表達(dá)水平2 .染色體免疫沉淀技術(shù)（Chip）驗(yàn)證Spl與IGF-1R啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)。3 .熒光素磁實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)Chip驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。第五部分 回復(fù)實(shí)驗(yàn)探索ceRNA （IGF-1R3PTR序列）通過(guò)miR-7調(diào)控Spl進(jìn)而

23、影響IGF-1R表達(dá)形成環(huán)路對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過(guò)程的影響。1 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）高表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7模擬物提高miR-7的表達(dá),檢測(cè)Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響。2 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）低表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7的siRNA,降低miR-7的表達(dá)，檢測(cè)Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響。第六部分 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1R3PTR序列/miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路對(duì)胃癌發(fā)生發(fā)展的作用。*研究目的本研究主要驗(yàn)證在胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-7通過(guò)靶向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子

24、SP1,繼而調(diào)控下游 IGF-1R,而ceRNA （IGF-1R3ZUTR）能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對(duì)Spl的抑制作用, 形成IGF-lR3，UTR/miR-力SPVIGF-1R調(diào)控環(huán)路，影響胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的過(guò)程以及 對(duì)下游通路的影響。本研究提出了 ceRNA介導(dǎo)的影響胃癌發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制，為同癌的分 子生物學(xué)診斷、治療及預(yù)后提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及臨床參考。*擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題1 .驗(yàn)證胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-SP1/IGF-1R通路中關(guān)鍵行點(diǎn)的相關(guān)性：本課題擬在組織樣本及體外實(shí)驗(yàn)中分析通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)檢測(cè)，以及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中干涉和過(guò)表

25、達(dá)這些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的干預(yù)性處理 及相應(yīng)表型的檢測(cè)。2 .驗(yàn)證胃癌中miR-7對(duì)Spl的耙向調(diào)控關(guān)系，Spl對(duì)IGF-1R的調(diào)控關(guān)系:本課題擬用RNA干涉技術(shù)與熒光素醴報(bào)告質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行miRNA耙基因調(diào) 控的研究。3驗(yàn)證ceRNA （IGF-1R3PTR序列）能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7從而降低miR-7對(duì)Spl 的抑制作用：本課題擬建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型。在上述細(xì)胞模型中分析Spl的表達(dá)以及細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生 物學(xué)行為變化。4. RNA測(cè)序分析篩選差異表達(dá)基因，檢測(cè)可能信號(hào)通路變化，初步確定胃癌發(fā) 生發(fā)展中IGF-1R3PTR、IGF-1R, miR

26、-7、Spl對(duì)下游通路的影響3.擬采取的研究方案及可行性分析。*技術(shù)路線（見(jiàn)國(guó)2）圖2研究技術(shù)路線*詳細(xì)研究方案第一部分 分析IGF-1R、miR-7、Spl在胃癌中的表達(dá)及ceRNA （IGF-1R3'UTR序列）、miR-7、 Spl對(duì)胃癌惡性表型的影響；1 .檢測(cè)正常胃粘膜上皮組織及胃癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)（其中 miR-7、Spl的表達(dá)檢測(cè)已完成）。已收集臨床獲得家屬或病人同意后手術(shù)切除的15例胃癌組織。另外收集10例獲 得家屬同意后在胃穿孔術(shù)中取得的正常胃粘膜上皮組織作為陰性對(duì)照。Realtime PCR檢測(cè)組織中miR-7的表達(dá)，Westemblot

27、檢測(cè)IGF-1R及Spl的表達(dá)。Real-time PCR: Ambion mirVanaTM miRNA （Ambion 公司）提取試劑盒抽提總 miRNA, ND 1000 （NanoDrop Technologies）測(cè)定總 miRNA 濃度和純度。73OOHT 熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)行熒光定量，檢測(cè)目的基因 （hsa-miR-181b）和內(nèi)參基因（U6）在不同濃度稀釋樣本中的擴(kuò)增情況，選擇當(dāng) 反應(yīng)達(dá)到域值時(shí)，目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增循環(huán)數(shù)均位于15-30個(gè)循環(huán)之間的樣 本濃度為最佳稀釋濃度，反應(yīng)結(jié)束后分析PCR反應(yīng)曲線，得到Ct值，即熒光達(dá) 域值所需的PCR循環(huán)數(shù)，隨后在

28、ABI 7300 System SDS Software 1軟件上 分析，查看每個(gè)基因的擴(kuò)增情況，記錄相應(yīng)的Q值。計(jì)算方法：以U6rRNA為陽(yáng) 性對(duì)照基因來(lái)校正PCR模板的細(xì)胞拷貝數(shù)（目標(biāo)基因AQ值=目標(biāo)基因Q值-同 一樣本U6ct值），消除組間的加樣量誤差，重復(fù)三次。目標(biāo)組的ACt平均值減去 其對(duì)照組的ACt平均值得到每個(gè)目的基因相對(duì)循環(huán)數(shù)（Ct值），即AACt目標(biāo)基 因二處理組ACt目標(biāo)基因-對(duì)照組口目標(biāo)基因，基因相對(duì)表達(dá)量采用2 -AACt 方法計(jì)算。Western blot： RIPA裂解液裂解，冰上消化15min,離心取上清并行BCA法定量，20卜1 1上樣量進(jìn)行電泳。

29、ECL顯色，GAPDH為內(nèi)參。2 .建立ceRNA （IGF-1R3PTR序列）、miR-7、Spl的不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞 模型。細(xì)胞培養(yǎng)：SGC7901胃癌體外細(xì)胞系課題組實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。10%熱滅活FBS,4 mM 谷氨酰胺,50U/ml青霉素和50.g/ml鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，37, 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：分別合成針對(duì)IGF-1R3PTR、miR-7、SP1、IGF-1R的干擾 和過(guò)表達(dá)的OligoDNA,與經(jīng) MluI和Clal誨切后和帶有EGFP的pLVTHM 載體連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序。溶于除菌 的TE中，保

30、證所提質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.82.0之間，DNA濃度在500 ng（ 1以上。分別轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞。3 .在上述細(xì)胞模型中分析細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的生物學(xué)行為變化，RNA測(cè)序 分析篩選差異表達(dá)基因，檢測(cè)可能信號(hào)通路變化，初步確定胃癌發(fā)生發(fā)展中 IGF-1R3PTR序列、IGF-1R、miR-7、Spl對(duì)下游通路的影響。笫二部分明確Spl是miR-7的直接作用耙點(diǎn)；1 .在miR-7不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞系中檢測(cè)Spl的mRNA及蛋白表達(dá)水平 （蛋白檢測(cè)已完成）。PCR檢測(cè)Spl的mRNA表達(dá)，westernblot檢測(cè)Spl的蛋白水平表達(dá)，具體方法 同上。2 .克隆含有Sp

31、l 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素誨報(bào)告載體，通過(guò)熒光素施 報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-7對(duì)Spl的直接調(diào)控。（預(yù)實(shí)驗(yàn)已完成）。熒光素陳報(bào)告實(shí)驗(yàn)：克隆含有SP1 3' UTR miR-7結(jié)合“種子序列”的熒光素誨 報(bào)告載體，通過(guò)熒光紊酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-7對(duì)SP1的直接調(diào)控。1）目的片段的獲得：PCR擴(kuò)增構(gòu)建的DNA序列中的3' UTR序列，克隆至 pGL-Basic報(bào)告基因質(zhì)粒（pGL-UTR），測(cè)序驗(yàn)證?；瘜W(xué)合成的miR-181b duplexes 與對(duì)照miRNAduplexes由上海吉瑪公司完成。2）熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建：提取總RNA, RT-PCR擴(kuò)增SP13&#

32、39; UTR結(jié)合區(qū)域, PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收。采用上海生工生物工程公司pGEM-T Easy載體進(jìn)行TA 克隆。目的基因與載體的摩爾比約為3: 1, lOXLigase Buffer 1回，純化的目的 基因 5Ong,載體 pGEM-T Easy 約 50 ng, T4DN A Ligase lul, ddH2O 補(bǔ)齊至 10 回，16連接過(guò)夜，Sall磁切鑒定。pGL-3質(zhì)粒載體的Xbal誨切處理，1%瓊脂 糖凝膠電泳，回收純化線性質(zhì)粒DNA,溶于適量TE中。目的基因與E.coliDH5 “表達(dá)載體的連接，使用限制性內(nèi)切誨Sall酶切鑒定構(gòu)建質(zhì)粒：將含有插入片段 的重組質(zhì)粒命名為質(zhì)粒pGL

33、-UTR。由大連寶生物公司完成測(cè)序工作。3）脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將熒光素霜報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒（pGL-UTR或?qū)φ誴GL-Basic）與化學(xué) 合成的 miRNAduplexes （hsa- miR- 181b duplexes 或?qū)φ?miRNAduplexes）轉(zhuǎn)染 細(xì)70%匯合的HEK293細(xì)胞,48小時(shí)后應(yīng)用Promega公司的luciferase assays Kit 檢測(cè)熒光素活性，間接反映miR-7與耙標(biāo)蛋白SP1的作用關(guān)系；提取瞬時(shí)共轉(zhuǎn) 染48小時(shí)的HEK293細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR及Western blot的方法檢測(cè)耙標(biāo)蛋白編 碼基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平。笫三部分 明確ceRNA （IGF

34、1R3，UTR序列）能作用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7從而降 低miR7對(duì)Spl的抑制作用。1 .克隆含有IGF-1R 3PTR區(qū)miR-7結(jié)合序列的熒光素酶報(bào)告載體，通過(guò)熒光素藤報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)IGF-1R3PTR區(qū)與miR-7的直接結(jié)合效應(yīng)。熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-7與IGF-1R3PTR結(jié)合，具體方法同上。2 .在IGF-1R 3PTR不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型中檢測(cè)Spl的蛋白及mRNA 水平。SGC7901胃癌細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染IGF-1R3PTR片段，提高IGF-1R 3，UTR序列在細(xì) 胞中的表達(dá)，PCR檢測(cè)Spl的mRNA表達(dá)，westernblot檢測(cè)Spl的蛋白水平表 達(dá)，具體方法

35、同上。笫四部分驗(yàn)證Spl對(duì)IGF_1R的調(diào)控；1 .在Spl不同表達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞中檢測(cè)IGF-1R的蛋白及mRNA表達(dá)水平。 構(gòu)建Spl的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入SGC7901胃癌細(xì)胞系提高Spl的表達(dá)，PCR檢測(cè) IGF-1R的mRNA表達(dá),westernblot檢測(cè)IGF-1R的蛋白水平表達(dá)，具體方法同 上。2 .染色體免疫沉淀技術(shù)(Chip)驗(yàn)證Spl與IGF-1R啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位 點(diǎn)。染色體免疫沉淀技術(shù)(Chip):1)體外交聯(lián)和細(xì)胞的裂解:：取各種處理的細(xì)胞2X107, 37%福爾馬林體外交 聯(lián)10分鐘,冰預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞后裂解液(l.l%Triton X-100, 1.2 mM

36、EDTA, 167 mM NaCl, 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1, 0.01% SDS, protease inhibitors)裂解后離心。 50W、2分鐘超聲打斷基因組DNA。3 ) Protein G Agarose分離：應(yīng)用免疫沉淀級(jí)抗體(SP1)和Protein G Agarose分離，抗體-妥白-基因組DNA復(fù)合物用懸浮緩沖室溫懸浮(1% SDS, 0.1 M NaHCO3） 20 分鐘。3000-5000 g 離心 1 分鐘。3）純化基因組DNA:通過(guò)溶解（8p I 5M NaCk 65° C, 4-5 hours）和反交聯(lián) （0.5M EDTA,

37、 8p 1 IM Tris-HCk Ija 1 Proteinase K, 45° C, 1-2 hours.）釋放并用離心柱純化基因組DNA。4） PCR擴(kuò)增目的片斷：根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與IGF-1R啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 部位分別設(shè)計(jì)PCR引物，PCR法擴(kuò)增目的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，應(yīng)用2.5-4%瓊 脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物染色體免疫沉淀技術(shù)（Chip）:驗(yàn)證SP1與IGF-1R啟動(dòng)子 區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點(diǎn)。3.熒光素誨實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)Chip驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。（具體方法同上）笫五部分 回復(fù)實(shí)驗(yàn)探索ceRNA （IGF1R3，UTR序列）通過(guò)miR-7調(diào)控Spl進(jìn) 而影響IGF-1R表達(dá)形

38、成環(huán)路對(duì)胃痛細(xì)胞增殖、侵襲、遷移過(guò)程的影響；1 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）高表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7模擬物 提高miR-7的表達(dá)，檢測(cè)Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞惡性表型的影響。2 .在ceRNA （IGF-1R3PTR序列）低表達(dá)的胃癌細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-7的 siRNA,降低miR-7的表達(dá)，檢測(cè)Spl、IGF-1R的表達(dá)水平及對(duì)細(xì)胞惡性表 型的影響。第六部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IGF-1R3，UTR序列/miR7/Spl/IGFlR調(diào)控環(huán)路對(duì)胃 痛發(fā)生發(fā)展的作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)或聯(lián)合干預(yù)IGF-lR3，UTR/miR-7/Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路的關(guān)

39、鍵 位點(diǎn)，觀察腫瘤生長(zhǎng)變化。以胃癌細(xì)胞SGC7901皮下成瘤裸鼠模型為研究對(duì)象，隨即分空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、ceRNA （IGF-1R 3PTR）治療組、多點(diǎn)聯(lián)合干預(yù)組進(jìn)行治療，定期監(jiān)測(cè)SGC7901細(xì)胞在裸鼠皮下生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物取腫瘤組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。本課題組已成功建立SGC7901皮下成瘤裸鼠模型（圖3）圖3裸鼠皮下成瘤模型*可行性分析本課題是在國(guó)內(nèi)外研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合申請(qǐng)人課題組近年來(lái)在胃癌研究領(lǐng)域中的工作而 提出。前期研究表明：miR-7在胄癌中低表達(dá)：Spl為miR-7的靶點(diǎn)；生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn), ceRNA （IGF-1R3，UTR序列）與miR-7能特異性

40、結(jié)合；IGF-1R為Spl的下游信號(hào)分子。綜上所 述，考慮到ceRNA（IGF-IRS/UTR序列）、miR-7、Spl在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本課題“ceRNA 介導(dǎo)的miR刁SP1/IGF-1R調(diào)控環(huán)路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機(jī)制”理論上可行。本課題使用的的研究手段包括：細(xì)胞培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、Western Blot檢測(cè)、定量PCR、染色體免疫沉淀技術(shù)、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀、熒光素酶報(bào)告基因、細(xì)胞生物學(xué)行為評(píng)價(jià)、動(dòng)物模型制作等均為經(jīng)典方法，并有申請(qǐng)人課題組多年實(shí)踐基礎(chǔ)。使我們了解ceRNA在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用以及作為治療耙標(biāo)的可能 性。課題組成員結(jié)構(gòu)合理，其中大部分為具有一定的分子生物

41、學(xué)研究背景，并具有充足課題統(tǒng)籌經(jīng)驗(yàn)的教授作為總體指導(dǎo)。團(tuán)隊(duì)成員都具有豐富的胃癌研究經(jīng) 驗(yàn)，已完成多項(xiàng)相關(guān)課題并在國(guó)內(nèi)外雜志發(fā)表相關(guān)論文多篇。4.本項(xiàng)目的特色與創(chuàng)新之處* ceRNA是目前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，課題組整合了具有系統(tǒng)性的miRNA研 究與ceRNA研究?jī)煞矫妫状翁岢鯰 ceRNA介導(dǎo)的miR-7/SPl/IGF-lR調(diào)控環(huán) 路影響胃癌細(xì)胞惡性表型的研究機(jī)制，從單純研究胃癌中的miRNA的功能與耙 基因的驗(yàn)證，深入到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)環(huán)路和ceRNA的相應(yīng)功能的研究方面，深入解析 了 ceRNA對(duì)miRNA功能的相互關(guān)系以及對(duì)胃癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展的影響，立體 新穎，內(nèi)容翔實(shí)。*信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控

42、、競(jìng)爭(zhēng)性抑制是本課題的研究核心，包括構(gòu)建ceRNA（IGF-lR3' UTR） 序列以及熒光素酶報(bào)告基因等前沿技術(shù)的應(yīng)用到門癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中miR-77SPVlGF-lR調(diào) 控環(huán)路的研究中來(lái)，尋找機(jī)遇miR-7SPVlGF-lR調(diào)控環(huán)路及其相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的胃癌靶向 治療的新方案，以建立全新的臨床腫瘤診斷、治療、監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)體系5.年度研究計(jì)劃及預(yù)期研究結(jié)果（包括擬組織的重要學(xué)術(shù)交流活動(dòng)、國(guó)際合 作與交流計(jì)劃等）* *年度研究計(jì)劃* *完成第一部分中胃粘膜上皮組織及出癌組織中IGF-1R、miR-7、Spl的表達(dá)檢測(cè)；不同表 達(dá)狀態(tài)的胃癌細(xì)胞模型的構(gòu)建；IGF-1R3' UTR

43、、miR-7、Spl及IGF-1R對(duì)細(xì) 胞增殖、侵襲、遷移細(xì)胞生物學(xué)行為變化的影響。寫(xiě)出相關(guān)論文投稿。* *完成第二部分中miR-7對(duì)Spl的靶向調(diào)控驗(yàn)證及第四部分中Spl對(duì)IGF-1R調(diào)控關(guān)系驗(yàn)證。* *完成第三部分中IGF-1R3' UTR競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-7提升Spl細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的檢測(cè)。* *完成第五部分回復(fù)性驗(yàn)證，在ceRNA （IGF-1R3* UTR序歹/）不同表達(dá)狀態(tài)的的同癌細(xì)胞 模型中檢測(cè)miR-7、Spl、IGF-1R等表達(dá)變化，驗(yàn)證此調(diào)控環(huán)路。* *完成第六部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IGF-1R3' UTR/miR-7Spl/IGF-lR調(diào)控環(huán)路對(duì)竹癌腫瘤發(fā)生發(fā) 展

44、過(guò)程的影響。* *整理和分析數(shù)據(jù)，全面匯總實(shí)驗(yàn)結(jié)果。撰寫(xiě)論文國(guó)內(nèi)外投稿，提交成果鑒定，撰寫(xiě)結(jié)題 報(bào)告。針對(duì)課題中的興趣點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在課題進(jìn)行期間，隨時(shí)掌握本課題相關(guān)內(nèi)容的進(jìn)展，必要時(shí)對(duì)課題內(nèi)容進(jìn)行合理修改。*預(yù)期成果及技術(shù)目標(biāo)明確IGF-1R3，UTR區(qū)、miR-7及Spl在胃癌中的表達(dá)及對(duì)其表型的影響，探討三者之間的調(diào) 控環(huán)路關(guān)系，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)胃癌靶向治療新思路。本課題完成后提供成果鑒定。預(yù)期在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表研究論文2-4篇,其中SCI收錄1-2篇，培養(yǎng)研究生數(shù)名。（二）研究基礎(chǔ)及工作條件一、iniRNA相關(guān)研究：申請(qǐng)者課題組團(tuán)隊(duì)在miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的 作用及機(jī)制研究

45、中積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)：（1）我們發(fā)現(xiàn)，miR-135a/b能通過(guò)靶向 MCL1 （圖4）逆轉(zhuǎn)肺癌A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順?shù)N的耐藥性（圖5）; （2） miR-503 能夠通過(guò)耙向BCL2 （圖6）逆轉(zhuǎn)肺癌A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順?shù)N的耐藥性（圖7）;（3） miR-145、miR-133a/b 抑制 SGC7901、BCG823 和 MKN45 胃癌細(xì)胞株的惡 性表型。圖4MCL1為m退-135a/b的靶基因4XU al&ic*ti-ian az©Al務(wù)，iwie圖5轉(zhuǎn)染miR-135a/b后增加了 A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順?shù)N誘導(dǎo)凋亡的敏感性。圖6 Bcl2為miR-503

46、的耙基因meHNA rwmle oootrcM圖7轉(zhuǎn)染miR-503后增加了 A549/CDDP細(xì)胞對(duì)順?shù)N誘導(dǎo)凋亡的敏感性。圖 8miR-145、miR-133a/b 抑制 SGC7901、BCG823 和 MKN45 胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移。（三）本課題研究的前期工作關(guān)于miR7耙向調(diào)控Spl的研究：在胃癌細(xì)胞SGC7901中，上調(diào)miR-7的表達(dá)能顯著抑制Spl的蛋白水平;生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),Spl為miR-7潛在靶基因;我們通過(guò)熒光素醴報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，Spl為miR-7的直接靶基因（圖9）?？?miR-NC圖9 Westernblot及熒光素蹲報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)Spl為miR-7的兜基因。

47、關(guān)于IGF1R3，UTR逆轉(zhuǎn)miR-7對(duì)Spl的抑制作用的相關(guān)研究:在高表達(dá)miR-7 餓胃癌細(xì)胞SGC7901中，轉(zhuǎn)染IGF-1R3PTR序列升高其在細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn),Spl的蛋白水平有所回升（圖10）。圖1。轉(zhuǎn)染ceRNA（IGF-lR3，UTR序列）升高其在細(xì)胞中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Spl的蛋白水平有所回升。Spl與IGFUR表達(dá)相關(guān)性研究：在胃癌細(xì)胞SGC7901中，下調(diào)Spl的表達(dá),IGF-1R的表達(dá)水平亦下降（圖11）。圖11在SGC7901中，下調(diào)Spl的表達(dá)，IGF-1R的表達(dá)水平亦下降以上這些前期研究結(jié)果，為本課題的實(shí)施提供了扎實(shí)的理論依據(jù)，為本項(xiàng)目 的順利完成提供了最有力的實(shí)驗(yàn)保證。2 .工作條件（包括已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑, 包括利用國(guó)家實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室等研究基地的計(jì)劃與落 實(shí)情況）申請(qǐng)者及課題組所在科室為江蘇省醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（臨床生物學(xué)診斷和治 療實(shí)