DNA的提取與保存方法

1、1-20度凍存 1年是沒有問題的，當然越低越好。但是凍存后，用蛋白酶K 法，紅細胞不易裂解，必須采用特殊方法裂解。2建議裂解紅細胞后再凍存于 80 度。因為凍融后紅細胞會裂解，而且紅細胞會增加蛋白 污染，影響 DNA 抽提3我們實驗室加 ACD 抗凝血液， 保存 3 年了，抽提 DNA 沒問題（我們是先離心后分層 保 存，以便后續(xù)試驗） ！血 DNA 提取技術(shù)分離外周血白細胞提取方法：試驗步驟：1、取人肘靜脈血 5ml，EDTA 抗凝， 2500rpm 離心 10min 。2、小心吸取上層血漿，分裝到3 個 0.5ml 離心管中。3、在血細胞中加入 3 倍體積的溶血液，搖勻，冰浴 15min

2、。4、2500rpm 離心 10min ，棄上清。5、加入 10ml 溶血液，搖勻，冰浴 15min 。6、3000rpm 離心 10min ，棄上清。7、倒置離心管，去掉殘液。8、得白細胞， 80?C 凍存。試驗要求：血至分離白細胞之間隔時間在室溫下放置不超過2h, 4C放置不超過5h,以防白細胞自溶。氯仿法抽提外周血白細胞基因組 DNA ：試驗試劑：Ligsisbuffer ：133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml 最后加滅菌去離子水至 1000ml ，高壓滅菌。ACD抗凝劑：檸檬酸1.68g檸

3、檬酸鈉4.62g葡萄糖5.15g ;最后加滅菌去離子水至350ml,高壓滅菌。提取緩沖液( Extractionbuffer )：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0 .5%SDS10%SDS0.5ml ;最后加滅菌去離子水至100ml，高壓滅菌試驗步驟：1、 在500 抗凝血中加入 Iigsisbuffer1000 ，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心 5min。棄上清液。2、沉淀中加入Iigsisbuffer1500 ，充分勻漿。以 6000rpm，離心5min。3、

4、徹底棄去上清，加入extractionbuffer500(裂解細胞)，混勻置于37C，水溶1h。4、加入8 的蛋白酶K，顛混，37C過夜(或55C, 3h,但是37C效果要好些)。5、 每管加入450 飽和酚(取溶液下層)緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。6、 取上清，每管加入 250 飽和酚和250 氯仿異戊醇，搖勻10min，以5500rpm ,離心15min 。7、 取上清，每管加入 500 氯仿異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。8、取上清，每管加 50 的3M的NaAC + ,適量無水乙醇(預(yù)冷)至滿，搖勻放入 -20C保 存 2h 以上。9

5、、 以12000rpm，離心20min。去上清，加入 70%乙醇 500卩,1以12000rpm,離心 5min , 去上清，50 60 C干燥。10、加入50 滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。NaI 提取法提取外周血白細胞基因組：實驗步驟：1、 取外周抗凝血(全血)100ul 于 eppendorf 管中, 12000rpm 離心 12min。2、棄上清,加雙蒸水 200ul 溶解,搖勻 20s。3、混勻后加 6MNaI 溶液 200ul ，搖勻 20s。4、 加入氯仿/異戊醇(24： 1) 400ul，邊加邊搖，搖勻 20s, 12000rpm離心12min。5、 取上層液350ul，加入另一新

6、eppendof管中，加0.6倍體積異丙醇，搖勻 20s，室溫放置15min ,靜置后的反應(yīng)體系 15000rpm 離心 12min ,使沉淀緊貼 eppendorf 管壁。6、 棄異丙醇，力口 70%乙醇1ml (不振動)，以15000rpm離心12min。7、 棄乙醇，敞開 eppendof管蓋，烘干(37 C恒溫箱)后，力口 1xTE溶液30ul，溶解DNA > 12h以上，制成的 DNA液-20C冰箱保存 備用。從外周血提取 DNA 是一個經(jīng)常遇到的問題, 當然可以用試劑盒提取, 不過代價還是有點大, 并且不方便,定試劑總要等上幾天,如果血液標本不稀缺資源,不妨用一些簡便方法提取

7、。 方法一(1) 取抗凝血 5ml在沉淀中加入 15ml PBS，混勻，離心 2000r/min10min。(2) 將血漿轉(zhuǎn)至新的試管中，-70 C保存。 將血細胞轉(zhuǎn)入另一支試管中 (10ml或50ml)加入盡可能多的冷的蒸餾水混勻。(4) 將其插入冰內(nèi) 510min或放入-20C 15min。(5) 將上述混合液從冰中或 -20C取出放至室溫，離心2000r/min20min。棄上清,收集沉淀。(7)在沉淀中加入 15ml PBS，混勻，離心 2000r/min10min。此步驟重復(fù) 3 次至沉淀為淡紅色或白色。將沉淀轉(zhuǎn)入小管，加少量 PBS,每分鐘5000r/min離心5min，去上清。(

8、9)沉淀-70 C保存。常用的外周血白細胞基因提取方法：試驗原理：苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉 )將細胞膜裂解,在蛋白酶K、 EDTA 的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子,核蛋白變性降解,使 DNA 從核蛋白中游離出來。 DNA 易溶于水,不溶于有機溶劑。蛋白質(zhì) 分子表面帶有親水基團, 也容易進行水合作用, 并在表面形成一層水化層, 使蛋白質(zhì)分子能 順利地進入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。 當有機溶液存在時, 蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性 遭到破壞,變性沉淀。離心后有機溶劑在試管底層 (有機相 ), DNA 存在于上層水相中,蛋 白質(zhì)則

9、沉淀于兩相之間。酚 -氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白質(zhì)。氯仿的作用是有助于 水相與有機相分離和除去 DNA 溶液中的酚。抽提后的 DNA 溶液用 2倍體積的無水乙醇在 1/103mol/LNaCl 存在下沉淀 DNA ,回收 DNA 用 70%乙醇洗去 DNA 沉淀中的鹽, 真空干燥, 用 TE 緩沖液溶解 DNA 備用。試驗步驟：1、將 1mlEDTA 抗凝貯凍血液于室溫解凍后移入 5ml 離心管中，加入 1ml 磷酸緩沖鹽溶液(PBS),混勻，3500rpm離心15min,傾去含裂解紅細胞的上清。重復(fù)一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細胞沉淀，37 C水浴溫育1h。2、將上述DNA提取

10、液混懸白細胞，37C水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終 濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動混勻，液體變粘稠。50C水浴保溫3h,裂解細胞，消化蛋白。保溫過程中,應(yīng)不時上下轉(zhuǎn)動幾次,混勻反應(yīng)液。3、反應(yīng)液冷卻至室溫后,加入等體積的飽和酚溶液,溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5-10min ,直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000rpm離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。 重復(fù)酚抽提一次。 加等體積的氯仿： 異戊醇(24：1 ) ,上下轉(zhuǎn)動混勻, 5000rpm 離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)一次。4、加入 1/5

11、 體積的 3mol/LNaAc 及 2 倍體積的預(yù)冷的無水乙醇,室溫下慢慢搖動離心管, 即有乳白色云絮狀 DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一 1.5ml離心管中,加70%乙醇0.2ml，以5000rpm離心5min。洗滌DNA，棄上清，去除殘留的鹽。重復(fù)一次。 室溫揮發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加 TE液20ul溶解DNA,置于搖床平臺緩慢搖動，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20 C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｕ婧思毎?DNA 的制備一般真核細胞基因組 DNA 有 107-9bp ,可以從新鮮組織、培養(yǎng)細胞或低溫 保存的組織細胞 中提取，常是采用在 EDTA以

12、及SDS等試劑存在下用蛋白酶 K消化細胞，隨后用酚抽提而 實現(xiàn)的。這一方法獲得的 DNA不僅經(jīng)酶切后可用于 Southern分析，還可用于 PCR的模板、 文庫構(gòu)建等實驗。根據(jù)材料來源不同,采取不同的材料處理方法,而后的DNA 提取方法大體類似,但都應(yīng)考慮以下兩個原則：1、防止和抑制 DNase 對 DNA 的降解。2、盡量減少對溶液中 DNA 的機械剪切破壞。試劑準備：1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0) 。2、 TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。3、 裂解緩沖液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶 K

13、至100mg/ml。4、20%SDS5、2mg/ml 蛋白酶 K6、Tris飽和酚（pH8.0 ）、酚/氯仿（酚：氯仿=1 ： 1）、氯仿7、無水乙醇、 75%乙醇試驗步驟：材料處理：1 、新鮮或冰凍組織處理：1）取組織塊0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，轉(zhuǎn)移到勻漿器中勻漿。2）將勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中。3）加 20%SDS25ml ，蛋白酶 K（2mg/ml）25ml ，混勻。4）60 °C 水浴 1-3hr。2、培養(yǎng)細胞處理：1）將培養(yǎng)細胞懸浮后，用 TBS 洗滌一次。2）離心4000g >5min，去除上清液。3）加 1 0倍體積的裂解緩沖液。4）

14、50-55 C 水浴 1-2hr。DNA 提?。?、 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。2、 離心5000g >0min，取上層水相到另一 1.5ml離心管中。3、 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g >0min，取上層水相到另一管中。4、 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心 5000g >0min，取上層水相到另一管中。如水相仍不 澄清，可重復(fù)此步驟數(shù)次。5、 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g >10min，取上層水相到另一管中。6、加 1/10 體積的 3M 醋酸鈉（ pH5.2 ）和 2.5倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。7、待絮狀物

15、出現(xiàn)后，離心 5000g >min，棄上清液。8、沉淀用75%乙醇洗滌，離心 5000g >min，棄上清液。9、 室溫下?lián)]發(fā)乙醇，待沉淀將近透明后加50-100mlTE 溶解過夜。、 全血的采集 保存 和 DNA 的提取I. 用 含抗凝劑的采血管進行采血，抗凝劑一般有 EDTA 和肝素， EDTA 更好一些，不會影響下游的反應(yīng)，如果沒有采血管，也可以自己添加抗凝劑EDTA，提前準 備0.04M的EDTA溶液，每5ml的血液中加入 0.4ml配好的EDTA溶液，顛倒混勻即可。 保存于-20 C 至-80C, 一般2-3年內(nèi)均可以提取， 保存時間越短，提取的質(zhì)量越高，最好在2個月內(nèi)提

16、取。II. DNA 提取方法的選擇：全血提取試劑盒一般有離心柱和溶液型兩種（比如Qiagen、Promega、Bioteke ;摒棄酚氯仿手提的方法，時間長毒性大），原理及步驟基本相同。雖然各公司推出了 N 多型號，讓人不知如何去選擇，但從原理 和操作步驟看，基本就是離心柱和溶液型兩種。一般來說，離心柱（DP1801）的提取純度高一些， 但是處理量?。?.1-1ml）、 得率略低；溶液型 （DP2101或DP2201 ）的提取量大（1-10ml）得率也高于離心柱。醫(yī)院 的血液標本一般在 2ml 以上，一般選擇溶液型的方法提取 .在說到國產(chǎn)和 進口差別的時候， 很多人以為進口一定比國產(chǎn)的好， 我

17、們覺得沒有最好， 只有更好！ 在不斷的進行試驗優(yōu)化之 后，全血基因組 DNA 提取試劑盒 DP2101 或 DP2201 開創(chuàng)了第三代技術(shù)，不需要蛋白酶 K 消化，進口的都是要借助蛋白酶 K的?。?DP2101或DP2201減少了蛋白酶 K現(xiàn)配現(xiàn)用的麻 煩和消化的時 間，而且提取量和穩(wěn)定性更好。III. 非抗凝血（凝固血）能否提?。看鸢甘强隙ǖ?，而且一點都不麻煩，提取效果和抗凝 血沒有差別！在你找遍了進口的所有品牌都找不到后，回過頭來您才發(fā)現(xiàn)原來他就在身邊， 百泰克的凝固血基因組 DNA 提取試劑盒已經(jīng)有很多忠實的用戶。下在是網(wǎng)上找的一般保存 DNA 的方法DNA 在如下情況下穩(wěn)定：（ 1）中性 pH，（ 2）低溫，可以儲存于 -20 度冰箱， （3）暗處（避免紫外線），（ 4）合適的鹽濃度（比如 100mmol/LNaCl ）， （5）無物理剪切。在 DNA 操作中應(yīng)該降低 DNase 對于 DNA 的降解，大部分 DNase 降解 DNA 時 要有二價陽離子（如Mg2+ , Ca2+