梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

1、梅毒實(shí)驗(yàn)室檢查的進(jìn)展張國(guó)軍（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷中心）寫(xiě)在課前的話(huà)梅毒是一種慢性、系統(tǒng)性疾病。學(xué)員通過(guò)本課件的學(xué)習(xí)，要熟悉梅毒的定義、傳播途 徑及臨床分期；掌握不同時(shí)期梅毒的治療方法；掌握梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法和梅毒免疫學(xué)反 應(yīng)；掌握梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)的原理、特點(diǎn)及各自?xún)?yōu)缺點(diǎn)；掌握先天性梅毒和神經(jīng)梅毒的診斷 方法。.梅毒概況及臨床分期梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病。人體受感染后，螺旋 體很快播散到全身，可侵犯全身各組織與器官，臨床表現(xiàn)多樣，且時(shí)隱時(shí)顯，病程較 長(zhǎng)。梅毒早期主要侵犯皮膚及粘膜，晚期除侵犯皮膚、粘膜外，還可侵犯心臟血管系 統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等全身各個(gè)系統(tǒng)；

2、另一方面，梅毒又可多年無(wú)癥狀而呈潛伏狀態(tài)。主要傳播途徑：性接觸傳染是最主要的傳播方式；其次是垂直傳播。隨著梅毒在人 群中流行率升高，母嬰垂直傳播發(fā)生率日益上升，并伴隨著包括診斷、治療、阻斷等 在內(nèi)的一系列問(wèn)題；第三，輸血傳播。輸血傳播曾經(jīng)是梅毒重要的傳播方式。但隨著 血液篩查的廣泛開(kāi)展及輸血的減少，梅毒經(jīng)輸血傳播已很少發(fā)生。但近年來(lái)，由于艾 滋病的流行，梅毒仍然是輸血安全的威脅。臨床分期：一期梅毒：主要表現(xiàn)為單個(gè)、無(wú)痛性的硬下疳，通常在感染梅毒螺旋 體后3 -4 周出現(xiàn)；二期梅毒：一期梅毒不經(jīng)治療，梅毒螺旋體在幾周到幾個(gè)月后會(huì) 播散到血液中，引起二期梅毒。二期梅毒的臨床表現(xiàn)多樣，常見(jiàn)發(fā)熱、淋巴

3、結(jié)病、彌 漫性皮疹、生殖道或會(huì)陰濕疣等。一、二期梅毒統(tǒng)稱(chēng)為早期梅毒；三期或晚期梅毒：在最初感染的數(shù)年至十?dāng)?shù)年后發(fā)生，可累及任何器官，常見(jiàn)梅 毒瘤性梅毒、心血管梅毒以及神經(jīng)梅毒。隱性梅毒：無(wú)癥狀但梅毒血清學(xué)試驗(yàn)呈陽(yáng)性。 分為早期隱性梅毒（病程一般在一年以?xún)?nèi)）和晚期隱性梅毒（病程一般在一年以上）二.梅毒的治療非口服途徑的青霉素可用于各期梅毒的治療。早期梅毒的治療首選240萬(wàn)單位節(jié)星青霉素 G單次肌肉注射。對(duì)青霉素過(guò)敏者，替代治療方案有強(qiáng)力霉素，口服，每次 100 mg,每日2次，持續(xù)2周，或四環(huán)素，口服，每次500 mg,每日4次，持續(xù)2周。早期隱性梅毒的治療方案與早期梅毒相同。晚期隱性梅毒的首選

4、治療方案為每周一次肌肉注射240萬(wàn)單位節(jié)星青霉素 G,持續(xù)3周；對(duì)青霉素過(guò)敏者，替代治療方案有強(qiáng)力霉素，口服，每次 100 mg,每日2次，持續(xù)4周，或四環(huán)素，口服，每次 500 mg,每日4次，持續(xù)4周。合并HIV感染、梅毒瘤性梅毒、心血管梅毒的治療方案同晚期隱性梅毒相同。神經(jīng)梅毒治療只能采用青霉素，靜脈注射水溶性青霉素G,每4小時(shí)300 - 400萬(wàn)單位，持續(xù)10 -14天，或肌肉注射普魯卡因青霉素G,每天240萬(wàn)單位，持續(xù)10 -14天，同時(shí)口服丙磺舒，每日 500 mg,每日4次，持續(xù)10 - 14 天。孕婦的治療只能采用青霉素，青霉素過(guò)敏者需經(jīng)脫敏后再治療。思考* >早期梅毒應(yīng)

5、如何治療?三.實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)暗視野顯微鏡檢查法：是主要的梅毒病原學(xué)診斷方法，是最特異的一期梅毒檢測(cè)方 法。取材部位以硬下疳為主，也可從宮頸、陰道、淋巴結(jié)等處取材。陽(yáng)性可確診，陰 性不能排除梅毒（需在3周內(nèi)不同的3天采樣檢測(cè)，才能得出陰性結(jié)果）。暗視野顯微 鏡法診斷的準(zhǔn)確性受操作者的經(jīng)驗(yàn)、病灶中活螺旋體的數(shù)量以及口腔、肛門(mén)破損處存 在的非致病性螺旋體等因素的影響。鍍銀染色法：與暗視野檢查法的臨床意義基本相同。該法利用梅毒螺旋體具有親 銀性，可被銀溶液染成棕黑色，再通過(guò)普通高倍顯微鏡進(jìn)行觀察。直接免疫熒光法（DFA：是目前國(guó)外采用較多的方法，其特異性及敏感性均優(yōu)于 暗視野顯微鏡檢查法。將特異性的抗梅毒

6、螺旋體單克隆抗體用熒光素標(biāo)記，如果標(biāo)本 中存在梅毒螺旋體，則通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)到發(fā)蘋(píng)果綠色 的梅毒螺旋體。此法可區(qū)分梅毒螺旋體和其他非致病性或條件致病性螺旋體。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR:能對(duì)生殖器潰瘍進(jìn)行早期鑒別診斷，區(qū)分梅毒、生殖器皰 疹和軟下疳。它又可分為 PCR和RT-PCR PCR的設(shè)計(jì)主要針對(duì)編碼梅毒螺旋特異性抗 原和TpN47勺DNAFF放編碼區(qū)，常見(jiàn)的引物有 K03A、K04、47-1、47-2、47-3、47-4等。 由于在PCR中會(huì)偶然出現(xiàn)非特異的 PCR產(chǎn)物而干擾結(jié)果，因此必須用特異性DNA探針進(jìn)彳T DNA-DN跺交來(lái)提高PCR的特異性及敏感性。 此外

7、，由于TpN47勺保守性，雅司螺 旋體可產(chǎn)生類(lèi)似的 PCR產(chǎn)物，所以這種設(shè)計(jì)的 PCR不能區(qū)分梅毒和雅司；但可以區(qū)分 梅毒螺旋體和引博氏疏螺旋體，這就可以解決梅毒與萊姆病之間血清診斷中的免疫交叉的問(wèn)題。另外一種是 RT-PCR常見(jiàn)的設(shè)計(jì)是針又撲!毒螺旋體的16s rRNA 366bp片段，這種方法污染少，特異性敏感性都比較高，但價(jià)格也較高。PCR在梅毒持續(xù)感染中的診斷價(jià)值目前還沒(méi)有一致的意見(jiàn)，理論上講PCR可以查出死亡的TP,所以?B療后 PCR陽(yáng)性并不意味著治療失敗，但死亡的TP從機(jī)體內(nèi)清除比較快（15-30天），而存活的TP從機(jī)體內(nèi)清除至少需120天，所以治療數(shù)周后 PCR陽(yáng)性意味著持續(xù)感

8、染的可能。此外也有將 PCRffi于產(chǎn)前診斷和神經(jīng)梅毒診斷的報(bào)道。四.免疫學(xué)反應(yīng)精選人類(lèi)對(duì)梅毒沒(méi)有先天免疫性，尚無(wú)疫苗接種進(jìn)行人工免疫,只能在受感染后產(chǎn)生感染性免疫。已完全治愈的早期梅毒患者仍可再感染。感染梅毒后，首先產(chǎn)生 IgM型抗梅毒螺旋體抗體，感染 2周后可檢出，早期梅毒治 療3 - 9個(gè)月或晚期梅毒治療2年后，大部分病人IgM可轉(zhuǎn)陰，再感染時(shí)又出現(xiàn)陽(yáng)性， 所以IgM型抗體的存在是活動(dòng)性梅毒的表現(xiàn)。通常感染梅毒4周左右產(chǎn)生IgG型抗梅毒螺旋體抗體，即使經(jīng)足量抗梅治療，梅毒螺旋體抗原消失后很長(zhǎng)時(shí)間，IgG抗體仍可通過(guò)記憶細(xì)胞的作用繼續(xù)產(chǎn)生，甚至終生在血液中可檢到。另一種具有抗體性質(zhì)的物質(zhì)叫

9、反應(yīng)素，是梅毒螺旋體破壞人體組織過(guò)程中釋放出的一種抗原性心磷脂刺激機(jī)體所產(chǎn)生的抗體。反應(yīng)素一般在感染后5 - 7 周，或下疳出現(xiàn)后2-3 周產(chǎn)生，經(jīng)正規(guī)治療后可以逐漸消失。胎兒在宮內(nèi)感染梅毒螺旋體后， 胚胎的晚期6 - 9個(gè)月時(shí)，已能合成IgM型抗體，出生后第3個(gè)月開(kāi)始形成IgG型抗體; IgM抗體不能通過(guò)胎盤(pán)， 而IgG型抗體能通過(guò)胎盤(pán)， 如果在患兒血清中檢出 IgM是診斷 先天性梅毒的有力的證據(jù)，但I(xiàn)gM陰性并不能排除先天性梅毒。五.梅毒血清學(xué)試驗(yàn)（一）非特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)是以心磷脂、卵磷脂以及膽固醇作為抗原檢查血清中 的反應(yīng)素，用于初篩試驗(yàn)及療效觀察。有以下四種

10、試驗(yàn)，原理基本相同：性病研究 實(shí)驗(yàn)室玻片試驗(yàn)（VDRL。試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，并且要在顯微鏡下觀察結(jié)果，故國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn) 室很少采用。但 VDR提診斷神經(jīng)性梅毒最特異的血清學(xué)方法。不加熱血清反應(yīng)素試 驗(yàn)（USR。試劑不需要現(xiàn)配現(xiàn)用，但仍然要在顯微鏡下觀察結(jié)果，現(xiàn)在已很少使用?？焖傺獫{反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR。在特制的紙片上進(jìn)行，加入一定量特制炭粉，可使抗原抗體出現(xiàn)凝集，用肉眼可觀察結(jié)果。甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST。在試劑中以紅色的甲苯胺紅顆粒代替黑色的炭粉顆粒，使結(jié)果更容易觀察。本試驗(yàn)的缺點(diǎn)：特異性。在多種疾病，如急性病毒性感染、自身免疫性疾病、結(jié) 締組織病、腫瘤、靜脈吸毒者、老年人以及孕婦中均

11、可出現(xiàn)反應(yīng)素，所以此類(lèi)試驗(yàn)有 時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；敏感性。感染梅毒后反應(yīng)素的出現(xiàn)時(shí)間晚于特異性梅毒螺旋體抗體， 因此非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)對(duì)一期梅毒的漏檢率比較高。RPR TRUS侑時(shí)出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性結(jié)果，而臨床的二期梅毒檢測(cè)需將患者血清稀釋后做定量的試驗(yàn)，如果再 出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，則為抗體過(guò)量引起的“鉤狀效應(yīng)”，大約1%-2%勺二期梅毒病人可出現(xiàn)假陰性。另外，晚期梅毒反應(yīng)素轉(zhuǎn)陰率較高，此類(lèi)試驗(yàn)對(duì)隱性梅毒不太敏感，因此此 類(lèi)試驗(yàn)漏檢較多。本試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)：陽(yáng)性患者往往是梅毒現(xiàn)癥感染者，臨床上即可開(kāi)展治療；該試驗(yàn) 表現(xiàn)為滴度隨成功的治療而逐漸下降，可作為療效觀察的指標(biāo)；價(jià)格低廉。測(cè)定非梅毒螺旋體抗原血清試

12、驗(yàn)的滴度進(jìn)行療效觀察：治療成功：早期梅毒患者在治療后6個(gè)月內(nèi)癥狀消失，并且非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)滴度有至少4倍下降。晚期或隱性梅毒患者在治療后12 - 24 個(gè)月內(nèi)非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)滴度有至少 4倍下降，說(shuō)明治療較成功。治療失敗：治療后癥狀持續(xù)或重新出現(xiàn)；治療后非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)滴 度反而上升4倍或以上；本試驗(yàn)初始滴度比較高（1:32或以上），但在六個(gè)月內(nèi)沒(méi)有達(dá) 到4倍下降?？姑范局委熓〉牟∪藨?yīng)考慮是否有合并HIV感染及神經(jīng)梅毒可能性。血清固定。經(jīng)正規(guī)治療后，梅毒患者非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)一般都會(huì)轉(zhuǎn)為 陰性，但是有約1% - 3%的病人即使經(jīng)足量抗梅治療，非梅毒螺旋體抗原血清

13、試驗(yàn)滴 度仍然可持續(xù)呈低滴度陽(yáng)性，此現(xiàn)象稱(chēng)為血清固定，原因尚不清楚。血清固定患者的 滴度重又上升則提示再次感染梅毒。（二）特異性梅毒血清學(xué)試驗(yàn)梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)是用梅毒螺旋體作為抗原檢測(cè)血清當(dāng)中的抗螺旋體的IgM或者IgG抗體，其敏感性和特異性均高于非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，但不能用作療效觀察的指標(biāo)。常用五種方法：熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)；梅毒螺旋體血球凝 集試驗(yàn)；梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)；梅毒螺旋體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；梅毒螺旋體快速1. 熒光梅毒螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）:是所有螺旋體試驗(yàn)中最敏感的方法，特異性高，通常被認(rèn)為是檢測(cè)梅毒的“金標(biāo)準(zhǔn)”。且該試驗(yàn)可分開(kāi)檢測(cè)IgM和Ig

14、G。但 是該法在技術(shù)操作上最困難，試驗(yàn)操作及結(jié)果判讀都必須核實(shí)。試驗(yàn)可靠性的關(guān)鍵是標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)果判斷、高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體及適當(dāng)?shù)南♂尪?。由于?shí)驗(yàn)室操作繁瑣及主觀判斷經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的結(jié)果，因此增加標(biāo)記熒光標(biāo)記染料的復(fù)染可以減低標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程中的錯(cuò)誤，并增加其可讀性及重復(fù)性。由于該試驗(yàn)需 要優(yōu)質(zhì)的熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員，所以通常不被臨床實(shí)驗(yàn)室作為常規(guī)方法 進(jìn)行開(kāi)展。2. 梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA） ：原理是用超聲裂解的梅毒螺旋體作為抗原，致敏經(jīng)醛化、鞣化的羊或禽類(lèi)紅細(xì)胞，此致敏紅細(xì)胞與人血清或血漿中的梅毒螺旋體 抗體結(jié)合，可產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。TPHA的優(yōu)點(diǎn)：該法比 FTA-ABS

15、容易操作且穩(wěn)定性好，敏感性除早期梅毒外與 FTA-ABS相似，對(duì)大樣本進(jìn)行批量檢測(cè)時(shí)，操作也較容易。不足：由于紅細(xì)胞具有生物活性，可能產(chǎn)生非特異性凝集，且保存的時(shí)間較短，批間差較大，所以在實(shí)際使用當(dāng) 中也存在一些問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)使用的商品化TPHA試劑盒均沒(méi)有通過(guò)國(guó)家批批檢。3. 梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA：原理與TPHA的原理基本相同，但它以人工 合成的惰性明月顆粒代替TPHA中的紅細(xì)胞作為載體，是TPHA勺升級(jí)產(chǎn)品。優(yōu)點(diǎn)：試劑穩(wěn)定，批間差小；結(jié)果判讀更為清晰明確；敏感性和特異性較TPHA®一步提高；通過(guò)了國(guó)家的批批檢。不足：結(jié)果判定主觀，較難實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。4. 梅毒螺旋體酶聯(lián)免

16、疫吸附試驗(yàn)（ TP-ELISA） ： 原理是以梅毒螺旋體抗原包被聚丙乙烯板， 再加入待檢血清及酶標(biāo)記抗原，形成雙抗原夾心，同時(shí)檢測(cè)IgG 和 IgM 抗體。少數(shù)試劑采用間接法，使用酶標(biāo)記的抗人IgG或IgM,可分開(kāi)檢測(cè)IgG和IgM。優(yōu)點(diǎn)：敏感性和特異性較高；價(jià)格低廉，適合大量樣品篩查；可實(shí)現(xiàn)操作自動(dòng)化、客觀化。缺點(diǎn)：ELISA 試劑盒品牌眾多，各家采用的抗原和工藝不同，使敏感性和特異性產(chǎn)生較大差異，臨床實(shí)驗(yàn)室在選用ELISA試劑前要認(rèn)真評(píng)估。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)梅毒螺旋體IgM 抗體。原理：ELISA 間接法或捕獲法，以捕獲法的敏感性和特異性為最佳。由于血液中IgG 的量遠(yuǎn)高于IgM ， 為

17、避免交叉反應(yīng)引起假陽(yáng)性，需對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理，事先去除其中的IgG ,然后再測(cè)定IgMo分離去除 IgG 的常用方法為柱層析法或免疫沉淀法，沉淀劑通常采用抗人IgG 等。 用途： 先天性梅毒的診斷；活動(dòng)性梅毒的診斷及療效觀察；梅毒再感染的診斷。結(jié)果解釋?zhuān)篒gM陽(yáng)性是先天性梅毒或活動(dòng)性梅毒重要的證據(jù)，但是陰性結(jié)果并不能排除感染的可能性。5. 梅毒螺旋體快速檢測(cè)試驗(yàn)（TP-RT） ：原理是雙抗原夾心免疫層析試驗(yàn)或間接法免疫滲濾試驗(yàn)，大多采用膠體金標(biāo)記，可同時(shí)檢測(cè)IgG、 IgM 抗體（雙抗原夾心法），或單獨(dú)檢測(cè)IgG 抗體（間接法）。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快速，不需要特殊儀器；適合單人份操作，可用于較緊急和實(shí)

18、驗(yàn)室條件差的場(chǎng)合。缺點(diǎn)：臨床評(píng)估資料不多，敏感性、特異性有待考查；無(wú)法實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，結(jié)果判讀主觀；測(cè)定結(jié)果受溫度和時(shí)間影響較大；沒(méi) 有通過(guò)國(guó)家的批批檢；價(jià)格較高。（三）免疫印跡試驗(yàn)梅毒免疫印跡試驗(yàn)（Western blot ）與作為HIV 抗體確認(rèn)的免疫印跡試驗(yàn)采用相同的原理和技術(shù)。既可檢測(cè) IgG抗體，也可以檢測(cè)IgM抗體。目前已經(jīng)有商品化的試 劑盒供應(yīng)，但價(jià)格高昂。檢測(cè)特異性的梅毒抗體條帶，分子量分別為15.5、17、45.5和47 kdo梅毒IgG免疫印跡試驗(yàn)的敏感性和特異性均可以達(dá)到甚至超過(guò)免疫熒光吸附 的水平。有文獻(xiàn)報(bào)道，梅毒IgM免疫印跡試驗(yàn)對(duì)先天性梅毒的診斷可能很有意義，其特異 性

19、至少達(dá)到90%而敏感性可達(dá)83%以上，高于這個(gè)熒光免疫吸附試驗(yàn)19S IgM 73%的水平。（四）關(guān)于梅毒血清學(xué)試驗(yàn)程序的探討先以非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（RPR或TRUST等）進(jìn)行初篩，再以梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)（TPPA TPHA ELISA等）進(jìn)行確認(rèn)。該方案優(yōu)點(diǎn)是非梅毒螺旋體抗原 血清試驗(yàn)價(jià)格低廉，使梅毒檢測(cè)成本較低；缺點(diǎn)是非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)敏感性 比較差，容易出現(xiàn)漏檢。同時(shí)進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)和非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)上 的最佳方案，缺點(diǎn)是人力和試劑成本較高。第三個(gè)方案是先進(jìn)行梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，陽(yáng)性時(shí)再進(jìn)行非梅毒螺旋體抗原 血清試驗(yàn)。梅毒血清學(xué)試驗(yàn)程序可

20、以如何安排？各有哪些優(yōu)缺點(diǎn)?六.先天性梅毒的診斷先天性梅毒的診斷要結(jié)合臨床表現(xiàn)、物理檢查、影像檢查、血清學(xué)檢查和直接顯 微鏡檢查進(jìn)行綜合判斷。先天性梅毒的癥狀有：鼻音、肝脾腫大、皮膚損傷、骨軟骨炎等，50%的梅毒患兒出生時(shí)沒(méi)有異常表現(xiàn)，多數(shù)在 3周至的月時(shí)出現(xiàn)上述癥狀中的一項(xiàng)或幾項(xiàng)，可能更 晚出現(xiàn)（出生2年以后），特征有畸型、耳聾、失明、弱智等。由于母體的螺旋體直接 進(jìn)入胎兒的血循環(huán)，因此先天性梅毒均直接表現(xiàn)為二期梅毒。從臍帶、胎盤(pán)、新生兒 皮損處采樣，在顯微鏡下直接檢查到梅毒螺旋體可以確診先天性梅毒。新生兒梅毒抗體滴度如果高于母親，也可以診斷為先天性梅毒，這種情況約占先天性梅毒診斷的22%但相反的情況則不能排除是先天性梅毒。新生兒梅毒特異性IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性可診斷為先天性梅毒，但陰性不能夠排除。從母體被動(dòng)獲得的梅毒 IgG抗體在新生兒體內(nèi)代謝、清除需要 12 -