膜色譜技術(shù)在生物大分子分離與純化中的應用

1、第21卷第5期2001年10月膜科學與技術(shù)MEMBRAN E SCIENCE AND TECHNOLO GY Vo1. 21No. 5Oct. 2001文章編號:1007-8924(2001 05-0066-07膜色譜技術(shù)在生物大分子分離與純化中的應用陳灝陳歡林3(浙江大學材料與化工學院摘要:, 具有選擇性高、分離速度快、能耗低. 本文論述, 并介紹了親和、疏水、離子交換、多級等四種膜色譜在.關(guān)鍵詞; 蛋白質(zhì)純化; 親和分離; 離子交換; 疏水作用中圖分類號:TQ028. 8文獻標識碼:A近十年來, 隨著生命科學、生物技術(shù)和制藥工業(yè)的迅速發(fā)展, 對于多肽、蛋白質(zhì)、酶等活性生物大分子的分離與純化

2、要求日益提高. 這類分子通常來自天然產(chǎn)物或發(fā)酵液中, 其初始濃度一般較低, 而且對溫度、p H 值、剪切力、有機溶劑等非常敏感, 易于失活或降解. 對于這類分子的高效分離與提純, 是生物工程下游技術(shù)的關(guān)鍵性問題之一.傳統(tǒng)的液相色譜所用吸附介質(zhì)多為顆粒狀吸附劑, 其存在以下四個方面的問題:介質(zhì)剛性不夠、易被壓縮, 難以獲得較高的處理速度, 也不易進行線性放大; 床層內(nèi)易產(chǎn)生溝流, 傳質(zhì)效果較差; 配基價格昂貴卻不能充分利用, 只有1%2%的配基能確實與蛋白質(zhì)結(jié)合1; 吸附柱易堵塞和污染, 往往只適用于間歇操作, 處理量相對較低, 操作時間較長.另一方面, 傳統(tǒng)的膜分離技術(shù)雖然有分離速度快、操作壓

3、力低、無相變、能耗低、易于放大和連續(xù)操作、基質(zhì)來源廣泛且價格相對較低等優(yōu)點, 但由于其靠篩分機理分離, 對目標產(chǎn)物與雜質(zhì)大小相近的混合物分離顯得無能為力2.膜色譜技術(shù)是液相色譜和膜分離相結(jié)合的一種新技術(shù), 融合了二者之長, 具有快速、高效、高選擇性、易于放大等特點, 能滿足生物大分子高效分離與純化的需要, 在生物大分子的分離與純化中已日益受到人們的重視, 必將得到廣泛的應用.收稿日期:2000-10-08; 修改稿收到日期:2000-12-04基金項目:國家自然科學基金資助項目(29676038 作者簡介:陳灝(1977 , 男, 遼寧省沈陽市人, 碩士生, 研究方向:生物化工. 3通訊聯(lián)系人

4、1膜色譜的原理和特點根據(jù)配基與目標蛋白的相互作用方式, 膜色譜可分為四類:親和膜色譜(Affinity Membrane Chro 2matography , AMC , 離子交換膜色譜(Ion -ex 2change Membrane Chromatography , IMC , 疏水作用膜色譜(Hydrophobic Interaction Membrane Chro 2matography , HIMC , 多級膜色譜(Multistage Mem 2brane Chromatography , MMC .膜色譜采用具有一定孔徑的膜作為介質(zhì), 連接配基, 利用膜配基與蛋白質(zhì)之間的相互作用

5、進行分離純化. 當料液以一定流速流過膜的時候, 目標分子與膜介質(zhì)表面或膜孔內(nèi)基團特異性結(jié)合, 而雜質(zhì)則透過膜孔流出, 待處理結(jié)束后再通過洗脫液將目標分子洗脫下來, 其純化倍數(shù)可達數(shù)百乃至上千倍.膜色譜是目前生物大分子分離中最為有效的方法之一, 其特點為:(1 色譜填料柱中的每一片膜都相當于一個短而粗的吸附床層, 膜厚相當于床層高度, 當床層體積一定時, 這種結(jié)構(gòu)有利于在相同壓降下獲得更高的流速, 從而提高了分離速度和處理量;(2 膜表面的配基與液流主體間的擴散路徑很短, 膜介質(zhì)只受表面液膜擴散及吸附動力學的影響3, 消除了傳統(tǒng)色譜中占主要地位的孔擴散阻第5期陳灝等:膜色譜技術(shù)在生物大分子分離與

6、純化中的應用67力, 大大改善了傳質(zhì)效果, 提高了配基的利用率和總的分離速度, 縮短了分離時間, 一次循環(huán)操作時間一般只是普通填料柱的十分之一, 提高了生產(chǎn)效率, 并有利于保持配基和目標蛋白的生物活性;(3 采用了膜介質(zhì), 整個床層的壓降大為降低, 一般只用低壓蠕動泵即可滿足分離要求, 這樣既降低了設(shè)備投資和運行費用, 也避免了液流與泵體直接接觸, 便于無菌操作和防止蛋白質(zhì)失活;(4 當, , (5 , 壓力, .目前, 關(guān)于膜色譜的機理、數(shù)學模型及其與HPLC 等方法比較的報道逐漸增加4. 模型中考慮的因素主要有對流、擴散、吸附、脫附等, 進一步的研究表明, 孔隙率、膜厚、軸向擴散、配基密度

7、等對分離效果也有很大影響. 對于吸附階段, 可以采用Lang 2muir 單層或多層模型進行近似計算, 效果較好.良的成膜性能及良好的機械和熱穩(wěn)定性, 經(jīng)活化處理后其性質(zhì)變化也不大, 非常適合作為膜介質(zhì). 聚砜膜活化后可偶聯(lián)三嗪染料或金屬離子等配基. 尼龍微孔膜孔徑分布較窄且機械穩(wěn)定性較好, 但存在非特異性吸附, . 對尼龍膜進行酸水解后, , 并使其具有, , 可減7,86.-丙烯酸接枝共聚物、聚醚砜(PES -聚乙烯氧化物(PEO -羥基乙基纖維素(HEC 等, 若以一定孔徑的惰性基質(zhì)為底膜, 在其上覆蓋這類共聚物膜, 可作為配基的支撐膜. Char 2cosset 等9研制了PES -P

8、EO -HEC 復合膜, 此種膜以PES 和PEO 的混合物為骨架以增加物理強度, 膜的外表面則共價連接HEC , 以增加親水性基團并便于配基的偶聯(lián), 其對蛋白質(zhì)非特異性吸附很小. Tennikova 等10在GMA -EDMA (甲基丙烯酸縮甘油基酯-乙烯基二甲基丙烯酸酯 共聚膜上進行寡聚GMA 的接枝改性, 增加了原來膜的機械強度, 并減少了膜的非特異性吸附. Suto 等11以HCl 為催化劑、戊二醛為交聯(lián)劑、醋酸為溶劑, 制備了殼聚糖-羥丙基纖維素交聯(lián)膜.近幾年來, Zusman 12研究的 凝膠玻璃纖維(GF G 受到越來越多的重視, 這種新型材料由于對蛋白質(zhì)的非特異性吸附較小, 非

9、常適于作為親和膜色譜的基質(zhì), 它在室溫干燥的條件下可保存幾個月.2膜色譜介質(zhì)材料膜介質(zhì)的選擇是影響膜色譜分離效果的重要因素之一, 理想的膜介質(zhì)具有以下的性質(zhì):有大量適當大小的孔及較窄的孔徑分布, 以便偶聯(lián)盡可能多的配基, 并為配基與目標蛋白的相互作用提供場所; 對雜蛋白等的吸附應盡可能小, 以提高產(chǎn)品純度; 膜介質(zhì)上應具有羥基、環(huán)氧基等可活化的基團, 以便與配基進行偶合; 具有一定的物理與化學穩(wěn)定性, 能承受液流穿過膜孔時的剪切力, 可進行反復的吸附、洗脫、再生、滅菌過程; 所選膜材料還應易于成膜, 且來源廣泛、成本較低.目前, 常用作膜色譜介質(zhì)的材料可分為天然高分子材料、人工合成高分子材料、

10、復合膜等三類.天然高分子材料有纖維素、殼聚糖等, 這些材料與配基的結(jié)合較為方便, 且具有較好的化學穩(wěn)定性. Guo 等5研制了一種改性纖維素膜作為親和膜色譜的基質(zhì), 其孔隙率更高、孔徑更大(12m , 但結(jié)構(gòu)均一性較差. 為加強機械和化學穩(wěn)定性, 可在偶聯(lián)配基前先交聯(lián)環(huán)氧氯丙烷6. 甲殼素/殼聚糖及衍生物形成的多孔膜, 可采用有機硅、過渡金屬、酶對其進行改性, 改性后可制成特殊功能膜材料. 脫乙酰度會影響殼聚糖類膜的酸穩(wěn)定性和熱、機械性能.人工合成高分子材料如聚砜、聚酰胺等, 具有優(yōu)3膜色譜的制備盡管以膜為基質(zhì)的膜色譜有多種形式, 但其制備過程差別不大, 為此本文以親和膜色譜的制備為例進行介紹

11、, 其過程也可供其它膜色譜制備參考.在膜材料選定以后, 常采用以下兩種路線制備成膜色譜柱:(1 膜材料成膜活化配基偶聯(lián), 這條路線主要是利用現(xiàn)有的商品膜, 通過對其進行偶聯(lián)改性來獲得所需膜色譜柱;(2 膜材料活化配基偶聯(lián)成膜, 這條路線是從最簡單的膜材料入手, 先制備功能化的膜材料, 再使之成膜.配基一般是指能夠與目標產(chǎn)物進行可逆的和特異性結(jié)合的分子或基團, 按其來源可分為天然配基(凝集素、肝素、核苷酸、蛋白A 、蛋白G 等 和人工68膜科學與技術(shù)第21卷合成配基(活性染料、過渡金屬離子、人工合成肽段、烷基等 兩類. 天然配基的性能優(yōu)于人工合成配基, 但其制取和提純較困難, 價格昂貴且使用條件

12、苛刻, 故實際應用中應結(jié)合分離目標慎重考慮. 按作用對象, 配基又可分為特異性配基和通用性配基. 特異性配基能夠與目標分子高度特異性結(jié)合, 基本上是一一對應的關(guān)系, 如單克隆抗體-抗原間的結(jié)合, 這類配基較為昂貴且不易保持穩(wěn)定性; 通用性配基則能凝集素-糖蛋白間的結(jié)合., 親和介質(zhì). , 一種是先將普通載體的表面進行活化, 再將配基偶聯(lián)上去; 另一種方法則是先將配基偶聯(lián)到載體原料上, 再利用偶聯(lián)后的原料制備親和載體. 一般來說, 前一種方法(先活化再偶聯(lián) 配基用量較少、利用率較高, 故應用較廣. 關(guān)于配基偶聯(lián)方法的報道有很多4,8, 大多是在HPLC 、親和層析等方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的, 較為

13、常用的有溴化氰法、環(huán)氧乙烷法、三嗪法、羰基二咪唑活化法、高碘酸鹽氧化法、硼氫化鈉還原法、磺酰氯法、碳二亞胺法、混合酸酐法和氟甲基吡啶鹽法等, 其中, 前四種方法目前應用最為普遍和有效. 對于金屬離子螯合膜色譜則還需在配體上螯合金屬離子13. 在分離中金屬離子起橋梁作用, 一側(cè)與載體膜相連, 另一側(cè)與生物分子配位結(jié)合. 在兩側(cè)的結(jié)合過程中, 配位鍵都起到了一定作用. 在螯合金屬離子時, 注意金屬離子的配位點既要保證能與螯合劑形成穩(wěn)定的化合物, 又要保證有剩余的位點留給生物配體. 這種方法制得的配體穩(wěn)定, 蛋白質(zhì)吸附量大, 吸-脫附條件溫和, 成本低, 但要注意金屬離子的泄漏問題.配基可以直接固定

14、在載體上, 但是由于采用這種方法偶聯(lián)的配基與目標分子的結(jié)合存在著一定的空間位阻, 故偶聯(lián)后配基與目標分子的結(jié)合常數(shù)一般要降低數(shù)倍至數(shù)十倍. 這種變化對結(jié)合力較弱的親和體系有非常大的影響. 為消除這種現(xiàn)象, 可在配基與載體之間引入間隔臂(spacer , 以增加配基與載體之間的距離, 減少空間位阻的影響. 通常, 配基與載體之間應插入46個亞甲基橋14. 如果配基本身是直鏈大分子, 或親和分離的目標物質(zhì)為生物小分子, 則可以不使用間隔臂7. 也有研究者認為, 采用親水性強的間隔臂能極大地降低非生物特異性吸附作用.4膜色譜的應用411親和膜色譜(AMC蛋白質(zhì)親和分離中常用的作用體系有抗原-單克隆抗

15、體, 激素-受體蛋白, 核酸-核酸結(jié)合蛋白, 酶-底物/抑制劑/輔酶, -蛋白A/G , -/采用低溫氧或氨等離子體法烯中空纖維微孔膜, 使膜表面產(chǎn)生了-OH 、-COOH 和C =O 等極性基團, 制備了Fe 3+、Ni 2+、Cu 2+、Zn 2+等金屬離子螯合親和膜, 用于溶菌酶的分離, 結(jié)果表明,Ni 2+、Cu 2+螯合膜對溶菌酶有較高的吸附量, 在20min 和68W 的最佳條件下, 制成的Cu 2+膜對溶菌酶的平衡吸附量為8g/cm 2. 螯合過程中采用氯化物鹽溶液制得的膜比采用硫酸鹽溶液制得的膜平衡吸附量要高. 吸-脫附量衰減的問題可采用補充螯合離子的方法解決.Hagedorn

16、 等15以GMA -EDMA 為基質(zhì), 偶聯(lián)免疫球蛋白抗體, 可以快速(99% 和產(chǎn)量(50mg/100g 均較高. 他們還以對氨基苯( PAB 為配基, 分離胰島素及類胰島素酶(尿激酶、血漿酶原活化劑、絲氨酸蛋白酶等 18.PAB 是一種胰島素抑制劑, 其成本大大低于其它抑制劑. 利用琥珀酸作為連接臂, 將PAB 偶聯(lián)到甲殼素膜上, 可獲得較高的配基密度(217mmol/g , 對胰島素的最大吸附容量可達(7814412 mg/g.Amatschek 等19以聚甲基丙烯酸酯膜為基質(zhì), 及能與因子特異性結(jié)合的人工合成肽段為配基, 來分離因子. 為了尋找相應的肽段序列, 他們采用了雙重定位掃描策

17、略, 從近5000種可能序列中找第5期陳灝等:膜色譜技術(shù)在生物大分子分離與純化中的應用69到了一種匹配序列, 并以此合成了作為配基的肽段.Zusman 12以凝膠玻璃纖維膜為基質(zhì), 包埋p53-Ig G 配基, 從結(jié)腸癌病人的血清中分離p53抗原,柱進行了比較, 充分證明了HIMC 的高效性. 另外,他們還利用苯基HIMC 對牛肝過氧化氫酶(BLC 進行了分離, 使得產(chǎn)品比活性比粗品提高了1118倍, 回收率接近100%.29, 、甲基、戊烷, 40mol/g , 以十二烷基甲基丙烯酸酯-EDMA 共聚物(體積比153550 為基質(zhì), 經(jīng)011mL/L 磺酸在80條件下處理5h , 獲得了疏水

18、膜介質(zhì), 用于分離肌球素、核酸酶、溶菌酶和胰凝乳蛋白酶. 由于采用了梯度洗脫, 減少了分離時間和移動相的用量, 從而降低了分離過程的成本, 特別適用于制備級酶的分離, 表2列出了近幾年來應用研究較為成功的一些疏水膜色譜體系.表2疏水膜色譜的應用研究實例目標蛋白牛肝過氧化氫酶牛血清白蛋白熱原膜介質(zhì)纖維素膜纖維素膜纖維素膜配基苯基苯基己二胺文獻282929303132分離出的蛋白質(zhì)濃度達到5mg/mL , 是近年來腫瘤相關(guān)抗原(TAA 分離的較高水平.Castilho 等20在尼龍微孔膜表面交聯(lián)葡聚糖(M r 6000和40000 和聚乙烯醇(M r 72000 , 獲得了具有足夠活化位點和較低的

19、蛋白質(zhì)非特異性吸附的膜基質(zhì), . 上偶聯(lián)蛋白A Ig G. , , 而且對蛋白質(zhì), 在交聯(lián)親水性的葡聚糖和PVA 后, 膜性能有了較大提高, 表1為近年來研究較為成功的一些實例.表1親和膜色譜的應用研究實例目標蛋白胰島素TAA免疫球蛋白抗體小麥細菌凝集素因子人IgG 溶菌酶人IgG 人IgG (從血漿或血清中 過氧化氫酶內(nèi)毒素膜基質(zhì)甲殼素GFGGMA -EDMA 共聚物配基PABp53-IgG 肽段甲殼素殘基人工肽段文獻41216171920甲殼素聚甲基丙烯酸酯尼龍-葡聚糖-蛋白APVA聚丙烯微孔膜改性聚己內(nèi)酰胺聚二乙烯醇纖維素復合膜尼龍66Ni2+2+十二烷基甲基丙肌球素、核酸酶、溶菌烯酸酯

20、-GMA -十二烷基酶和胰凝乳蛋白酶EDMA 共聚物牛血清白蛋白人腫瘤壞死因子聚乙烯膜Quick Disk苯基丁基、苯基21,22、Cu重組蛋白A/G 23L -組氨酸242526413離子交換膜色譜(IMC離子交換膜色譜主要是利用膜介質(zhì)表面的離子交換基團與目標蛋白之間的離子交換作用進行分離的. 根據(jù)離子交換基團的性質(zhì), 可分為強陽離子型、弱陽離子型 、強陰離子型、弱陰離子型. 由商用膜改性制得的膜介質(zhì), 其成本相對較低5. 在流速較慢的情況下, IMC 還可通過梯度洗脫分離蛋白質(zhì)的混合物. 離子交換膜色譜由于操作條件較溫和, 可以有效地保持蛋白質(zhì)的活性, 并可延長膜的使用壽命, 其缺點是選擇

21、性較差.Podgornik 等33等進行了IMC 純化質(zhì)粒DNA 和肽鏈等生物分子的研究, 還比較了不同洗脫方式下的分離效果. 采用GMA -DEMA 為基質(zhì), 二乙氨乙基(DEAE 為離子交換基團, 在5mL/min 的流速下有效地分離了四種寡聚核苷酸(長度分別為8, 10,12和14個核苷酸 . 還在同樣的基質(zhì)接上-SO 3-基團后, 用于肽鏈的分離.螯合銅離子組氨酸412疏水膜色譜(HIMC由于疏水配基結(jié)構(gòu)簡單, 通用性好且成本較低, 故疏水色譜已成為蛋白質(zhì)分離純化的常用技術(shù)之一. 但是, 目前常用的疏水色譜大多采用瓊脂糖凝膠、葡聚糖等“軟”基質(zhì), 分離速度不夠理想, 且不易放大, 疏水

22、膜色譜就是在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的.疏水膜色譜上的配基, 常用的有甲基、丁基、苯基、辛基、己二胺、聚乙二醇等, 通過目標物質(zhì)與這些配基之間疏水作用的不同而實現(xiàn)分離. 影響疏水膜色譜操作情況的主要因素有:鹽離子的種類, 離子強度,p H 和柱溫等27.楊利等28以纖維素膜為介質(zhì), 辛基為配基, 分離牛血清白蛋白(BSA , 并將實驗結(jié)果與傳統(tǒng)凝膠70膜科學與技術(shù)第21卷Dosio 等34利用陽離子IMC 從免疫毒素中分離出了未反應的單克隆抗體. 與羥磷灰石HPLC 相比, 雖然分離純度差不多, 但分離步驟卻大為簡化. 盡管染料親和層析也廣泛用于免疫毒素的分離, 但是染料配基與核糖體抑活蛋白(RIP

23、之間的相互作用不夠穩(wěn)定, 而且受離子強度和p H 的影響較大. 另外, 至少對-絲林霉素和滅疊球菌素來說, 親和結(jié)合并不完全(65%90% . 因此, 在內(nèi)毒素的分離中, 采用IMC 更為理想.Sasagawa 等35膜, 酸鈉接入, , 制成離子交換膜介質(zhì), , 膜的蛋白質(zhì)平衡容量可達到0142g/g , 以NaHCO 3-NaOH 緩沖液為洗脫液, 在p H 為910時洗脫率達到100%.由于膜上螯合了Mg 2+, 使得膜的透過速率也有較大增加.楊利等29以QAE 型IMC 分離純化人尿激肽釋放酶, 由于采用了徑向色譜技術(shù), 省去了傳統(tǒng)的鹽析和高速冷凍離心等步驟, 大大節(jié)省了時間.Sun

24、等36采用纖維素膜共價連接DEAE 的徑向IMC , 從血漿的分離物(Nitschmann fraction 中分離人凝血酶原, 樣品的通過速率為2030mL/min , 在不降低分離效率的前提下, 洗脫速率達到40mL/min. 這種膜還可用于DNA 、多肽和其它蛋白質(zhì)的分離.Zeng 等37在甲殼素膜上偶聯(lián)乙烯基乙二醇二縮水甘油醚(EG DE , 獲得了非常穩(wěn)定的離子交換膜, 可在酸或堿溶液中保持強度. 他們采用三種低p I 值的蛋白質(zhì)(卵白蛋白、人血清白蛋白、胰島素抑制劑 和兩種高p I 的蛋白質(zhì)(溶菌酶、細胞色素C 作為目標蛋白, 分離兩組中任意兩對蛋白質(zhì)的混合物, 獲得了很高純度的產(chǎn)

25、物(99% . 這種膜非常適于從重組蛋白質(zhì)中分離帶有較高負電荷的內(nèi)毒素和核酸等物質(zhì). 表3為近幾年來應用研究較為成功的一些IMC 例子. 414多級膜色譜(MMC為了獲得更高的純化效果, 近年來還出現(xiàn)了多級膜色譜, 即將不同類型的膜介質(zhì)組合在一起形成新的色譜柱進行分離. 這里的技術(shù)關(guān)鍵是根據(jù)目標產(chǎn)物選擇適當?shù)哪そ橘|(zhì)排列順序和緩沖液條件, 以便使上一層洗脫下來的目標蛋白能夠被下一層吸附. 如果安排合理, 多級膜色譜可以大大縮短混合產(chǎn)品的分離時間, 有效地節(jié)省設(shè)備投資, 表4為近幾年來多級膜色譜的幾個應用研究實例.表3離子交換膜色譜的應用研究實例目標分子人尿激肽釋放酶人腫瘤壞死因子膜介質(zhì)纖維素膜G

26、MA配基N (CH 3 3SO 3H -MgDEAE EG DE文獻29323334353637、人血清白蛋白、胰島素抑甲殼素膜制劑BSA乳清蛋白交聯(lián)改性纖維素交聯(lián)改性纖維素磺酸基38磺酸基、季胺基39表4多級膜色譜的應用研究實例目標蛋白甲酸脫氫酶膜介質(zhì)Sartobind 膜(S ,Q ,Red 作用種類1. 陽離子交換2. 親和作用3. 陰離子交換文獻40BSA ,IgG改性纖維素和合1. 陽離子交換成共聚物2. 陰離子交換41414142改性纖維素和合1. 陰離子交換重組抗栓酶成共聚物2. 親和作用尿激酶纖維素-丙烯酸1. 陽離子交換復合膜2. 親和作用1. 親和作用2. 陰離子交換重組抗

27、栓酶Sartobind 膜5展望現(xiàn)代生物工程技術(shù)的發(fā)展對生物大分子的分離與純化提出了越來越高的要求, 目前的發(fā)展趨勢是開發(fā)集成化的新型分離技術(shù). 膜色譜作為一種新型的生化分離方法, 雖然尚未廣泛應用于工業(yè)化生產(chǎn), 而且缺少理論模型和大量實驗數(shù)據(jù)的支持, 但是, 相信隨著制膜技術(shù)、配基偶聯(lián)技術(shù)、自動化控制技術(shù)的發(fā)展, 膜色譜分離技術(shù)在生物大分子的分離純化過程中必將發(fā)揮越來越大的作用. 致謝:浙江大學生物工程研究所甘宏宇博士后對部分內(nèi)容提出了修改意見, 在此表示感謝.參考文獻1Dong G Q. Application of Eudragit S100in protein purifi 2cati

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