微生物的大小及數(shù)量的測定

1、微生物試驗報告微生物的大小及數(shù)量的測定一、實驗目的1. 了解顯微鏡測定微生物大小與血球計數(shù)板測定微生物數(shù)量的原理。2. 學習并掌握顯微鏡下測定微生物細胞大小的技術，包括目鏡測微尺、鏡臺測 微尺的校正技術與測定細胞大小的技術。3. 了解血球計數(shù)板的結構，學習并掌握血球計數(shù)板計數(shù)微生物數(shù)量的技術，包 括樣品的點樣、菌數(shù)計數(shù)的方法與計算。二、實驗原理1 .微生物大小測定原理微生物細胞的大小，是微生物重要的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據之 一。由于菌體很小、只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細胞大小的工具有 目鏡測微尺和鏡臺測微尺。（1）目鏡測微尺（圖1）目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把 5

2、m求度亥ij成50等分，或把 10 mmfe度亥I成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上 （此處正好與物 鏡放大的中間像重疊）來測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡 組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡 測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定 放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。圖1目鏡測微尺圖2鏡臺測微尺（2）鏡臺測微尺（圖2）鏡臺測微尺是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長10 pm（即0.0lmm）,是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將 鏡臺測微尺放在載物臺上，由于

3、鏡臺測微尺與細胞標本是處于同一位置，都要 經過物鏡和目鏡的兩次放大成象進入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍 數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數(shù)就是細胞的真實大小，所以 用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測 微尺每格所代表的長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標本片，用校正好的 目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物大小。2 .血球計數(shù)板測定微生物數(shù)量的原理鏡檢計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質常不 易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計數(shù)板；一般細菌則采用彼得 羅夫霍澤（Petroff Hausser） 細菌計數(shù)板。兩種

4、計數(shù)板的原理和部件相同，只 是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故 細菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有 4條槽而構成3個平臺。中 間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網 （圖3）。每個方格網共分9大格，其中間的一大格（又稱為計數(shù)室）常被用作微生 物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又 分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即 每個大方格都由400個小方格組成（圖4）。每個大方格

5、邊長為1mm則每一大方格的面積為1mrh每個小方格的面積為 1/400mm蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為 0.1mm所以每個 計數(shù)室（大方格）的體積為0.1mm,每個小方格的體積為l /4000mim使用血球計 數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格（或中方格）中微生物的數(shù)量，再換算成每 毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。圖3血球計數(shù)扳的構造a.平面圖（中間平臺分為兩半，各半邊有一個方格網）b.側面圖（中間平臺與蓋玻片之間有高度為 0.1毫米的間隙）圖4血球計數(shù)板計數(shù)網的分區(qū)和分格三、實驗材料1 .儀器顯微鏡，目鏡測微尺，鏡臺測微尺，血球計數(shù)板、蓋玻片（22m忤22mm、吸水

6、紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙，酒精燈2 .材料酵母菌液，枯草芽抱桿菌斜面培養(yǎng)物3 .試劑美蘭染液，結晶紫，蒸儲水等四、實驗方法1. 目鏡測微尺的校正把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上， 把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看 清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行， 移 動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“ 0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩 尺第二個完全重合的刻度，計數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺測微尺 的格數(shù)。因為鏡臺測微尺的刻度每格長10 pm,所以由下列公式可以算出目鏡測 微尺每格所代表的長度

7、。目鏡測微尺每格長度（卜m）兩重合線間鏡臺測微尺的格數(shù) X 10兩重合線間目鏡測微尺的格數(shù)用此法分別校正在物鏡倍數(shù)為10X, 40X, 100X下目鏡測微尺每小格所代 表的長度。注意事項6由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定 的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進行，而且只能在特定的情況 下重復使用，當更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時， 必須重新校正目鏡測微尺每 一格所代表的長度。2. 細胞大小的測定A.酵母菌的大小測定1）取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。2）移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高 倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體

8、的長， 寬各占幾格（不足一格的部分估計 到小數(shù)點后一位數(shù)）。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。B.枯草芽抱桿菌的大小測定1）將載玻片洗凈晾干后，在其中央滴一滴蒸儲水，然后通過無菌操作用接種針 取少量枯草芽抱桿菌的斜面培養(yǎng)物于蒸儲水中，然后干燥2）單染色用結晶紫染液或美蘭染液對其進行單染色，染色一定時間后沖洗載玻片的背 面，將染液沖洗掉3）置于顯微鏡下鏡檢，用目鏡測微尺測量枯草芽抱桿菌的長和寬注意事項測量菌體大小時要在同一個標本片上測定 3個大小相近的菌體，求出平均值, 才能代表該菌的大小。而且一般是用對數(shù)生長期的菌體進行測定。3. 酯母菌菌懸液中酯母菌菌數(shù)的測定（1）取

9、潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)室上蓋上一塊蓋玻片。（2）將酵母菌菌懸液充分搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽 內沿蓋玻片的右上角滴入一小滴（不宜過多），使菌液沿兩玻片間自行滲入計數(shù)室， 勿使產生氣泡，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌液。（3）先在低倍鏡下找到計數(shù)室后，再轉換高倍鏡觀察計數(shù)。（4）計數(shù)時用16中格的計數(shù)板，要按對角線方位，取左上、左下、右上、右下的 4個中格（即100小格）的酵母菌數(shù)。如果是25中格計數(shù)板。除數(shù)上述四格外， 還需數(shù)中央1中格的酵母菌數(shù)（即80小格）。由于菌體在計數(shù)室中處于不同的空 間位置，要在不同的焦距下才能看到，因而觀察時必須不斷調節(jié)微調螺旋， 方能

10、 數(shù)到全部菌體，防止遺漏。如菌體位于中格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線， 數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。（5）凡酵母菌的芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復分數(shù)2-3次（每次數(shù)值不應招差過大，否則應重新操作），取其平均值，按下 述公式計算出每毫升菌液所含酵母菌細胞數(shù)（25中格）。%十及十為十Xi十范醒母H細胞數(shù)/mL= 上25（或ItT） 10 xlOOD x稀釋倍數(shù)5（6）血球計數(shù)板用后，在水龍頭上用水柱沖洗干凈，可以用去污粉洗凈，切勿用 硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或吹風機吹干。五、實驗結果1、目鏡測微尺的標定結果物鏡倍數(shù)（目鏡均為10倍）目鏡測

11、微尺的格數(shù)（小格）鏡臺測微尺的格數(shù)（小格）目鏡測微尺的每格的 長度（m m）10倍10051.85.1840倍10012.71.27100倍1005.10.512、酵母菌的大小測定結果（10X 100）菌號123平均值目鏡測微尺的格數(shù)（小格）長軸13121212.33短軸99109.33酵母大小平均值=6.29 （長軸）X 4.76 （短軸）m m23、枯草芽抱桿菌大小測定結果（10X100）菌號123平均值目鏡測微尺的格數(shù)長軸8787.67（小格）短軸1121.33枯草芽抱桿菌大小平均值=3.91 （長軸）x 0.68 （短軸）m m24、血細胞計數(shù)板對酵母菌懸液計數(shù)結果實驗次數(shù)各中格中菌數(shù)

12、總菌數(shù)稀釋倍數(shù)平均值菌數(shù)（個/mL）14748393230196539.24.90 X 107六、實驗分析在目鏡測微尺矯正的時候，不同的倍數(shù)需要分別矯正。但是也正是由于放大 的倍數(shù)不一樣，是使在矯正的時候鏡臺測微尺的刻度線不斷放大，也為最終的讀數(shù)帶來了一定的誤差。因為放大的倍數(shù)越高，測量的越精確。所以用100倍物鏡 測得的應該是最準確的。其中酵母菌大小的參考值為：1-5微米X 5-30微米；枯 草芽抱桿菌的大小的參考值為：細胞 0.7-0.8 微米X 2-3微米，芽抱0.6-0.9 微米X1.0-1.5微米。測得值均在參考值的范圍內。在對酵母菌菌懸液進行計數(shù)時，第一次我們觀察到每格中的菌數(shù)過多， 應該 控制在5-10/小格，所以我們將菌懸液稀釋 5倍后再用血球計數(shù)板進行技術， 所得每小格中的菌數(shù)在正好在做要求的范圍內，這樣對于計數(shù)既準備又方便。實驗過程中可能在操作方面出現(xiàn)失誤，如滴加菌懸液的時候和壓片的時候。但是總體來說，結果應該還是不錯的。七、實驗小結由于不同顯微鏡及附件的放大倍數(shù)不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定 的顯微鏡和附件（特定的