激活素a和卵泡抑素對凍融人胎兒卵巢雌二醇分泌的阻礙

1、池海虹，周穎，祝懷平，金暢，葉碧綠【關(guān)鍵詞】激活素a；卵泡抑素；胎兒；卵巢；雌二醇abstract:objective:toinvestigatetheeffectofactivina-follistatinonsteroidogenesisoffrozen-thawedhumanfetalovaryinvitro.methods:thefrozen-thawedfetalovariantissuewasculturedindividuallyinminimalessentialmedium(mem)for8days.undertheexperimentalconditions,themedi

2、umwassupplementedwitheitheractivin-a(actagroup)orfollistatin(fsgroup)orthecombinationsofactivin-aandfollistatin(a+fgroup).theconcentrationofe2inculturedmediumwasdetectedwithimmunoluminescencemethod.results:thelevelsofe2at4thday,6thdayand8thdaywerehigherthanthatat2ndday(p,thesecretionofe2increasedatf

3、irst,thendecreasedwiththehighestlevelat6thday.thelevelofe2ofactagroupwassignificantlygreaterthanthatofthecontrolgroup,fsgroupanda+fgroup(p.conclusion:frozen-thawedhumanfetalovarycanexcreteestrodiolundertheconditionoftissueculture.actacanincreasetheexcretionofestrodiolincultivatedovariantissue,andthe

4、effectionofactacanbesuppressedbyfs.keywords:activina;follistatin;fetal;ovariantissue;estrodiol最近幾年來發(fā)覺的一組性腺起源的細胞因子-激活素（activins），對卵泡發(fā)育有著重要的局部調(diào)劑作用，尤其是激活素a（activina，acta）。盡管有較多的研究說明了激活素對不同動物卵泡發(fā)育的阻礙1-3，但對人胎兒卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育的阻礙尚未見報導。本研究以胎兒卵巢為研究對象，比較acta和卵泡抑素（fs）在體外組織培育條件下對凍融人胎兒卵巢e2分泌的阻礙，探討其在人卵泡發(fā)生進程中可能的調(diào)劑作用。1材料和方式

5、標本卵巢組織取自因打算生育或醫(yī)療緣故需行藥物引產(chǎn)（利凡諾米菲司酮）的32周胎兒（溫州醫(yī)學院教學醫(yī)院臨盆室提供）共3例，于引產(chǎn)后2h內(nèi)無菌條件下取材，置于預冷的leiboviz-15（l-15，美國sigma公司產(chǎn)品）基礎培育液中待用。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準。試劑和儀器基礎培育液為mem培育液（購自gibco公司），含5%小牛血清，100u/ml的fsh,100iu/ml青霉素和100iu/ml鏈霉素，1/100its（胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-ft,insulin-transferrin-selenium）,ph。acta、fsh、fs均為sigma公司產(chǎn)品。e2測定采納美國貝克曼庫而特公司bxi

6、800儀器及試劑。實驗方式冷凍及蘇醒:將胎兒卵巢組織去除髓質(zhì)及周圍結(jié)締組織后，切成5mrrX5mmX1mm大小，放入裝有冷凍愛惜劑mol/l丙二醇（proh）的冷凍管中，依照oktay4提出的慢凍速融法處置。體外培育及分組:凍融卵巢皮質(zhì)塊切成2mmx2mmx1mm大小，隨機放入加有ml培育液的24孔培育板內(nèi)，37、5%co2培育箱內(nèi)培育，隔天半量換液，共培育8d。實驗共分四組：mem組（minimumessentialmedium，基礎培育液）即對照組、acta組（基礎培育液+100ng/mlacta）、fs組（基礎培育液+100ng/mlfs）和a+f組（基礎培育液+100ng/mlacta

7、+100ng/mlfs）；每組4塊組織。所有實驗重復3次。e2的測定:搜集培育2d、4d、6d、8d的培育液，采納免疫發(fā)光法，按美國貝克曼庫而特公司bxi800儀器及試劑說明測定e2的含量。質(zhì)控符合要求,批內(nèi)變異系數(shù)10%，批間變異系數(shù)15%。統(tǒng)計學處置方式采納重復測量資料方差分析進行比較，采納dunnet進行兩兩比較。2結(jié)果所有培育組的卵巢組織，培育4d、6d、8d分泌的e2值均高于2d值，不同有顯著性（均p）,整體呈先增加后減少改變，在培育后6d可達較高水平；acta組e2分泌量明顯高于對照組、fs組和a+f組，不同有顯著性(均p),詳見表1。3討論胎兒卵巢組織體外培育條件下能分泌e2本實

8、驗結(jié)果顯示，胎兒卵巢組織在體外培育條件下能產(chǎn)生e2。目前，國內(nèi)外對卵巢組織體外培育的最正確時刻尚無定論，除鼠卵巢組織外，其他哺乳動物的卵巢組織即便體外培育20d,組織內(nèi)的低級卵泡也不能發(fā)育到次級卵泡時期5。本研究中e2分泌量隨培育時刻延長先增加后減少，在培育后6d可達較高水平，這是不是提示人胎兒卵巢組織的體外最正確培育時刻為6d尚有待進一步研究。acta和fs對卵巢組織e2分泌的阻礙acta是最先在性腺發(fā)覺的糖蛋白激素，屬于轉(zhuǎn)化生長因子(transforminggrowthfactor,tgf)超家族成員。1986年第一次從豬的卵泡液中分離、純化，依照其具有特異性地增進垂體細胞分泌、合成卵泡刺

9、激素(folliclestimulatinghormone，fsh)的生物學活性而得名6，要緊以旁分泌和自分泌途徑發(fā)揮生物活性。目前的研究以為，acta是一種調(diào)劑組織細胞功能的大體介質(zhì)，具有普遍的生物學活性，參與調(diào)劑顆粒細胞的增殖和分化、類固醇激素的產(chǎn)生7，支持卵泡生長并抑制卵泡閉鎖8。最近幾年來，在人卵泡顆粒細胞上也發(fā)覺了acta的受體9。本研究結(jié)果顯示，acta對卵巢組織類固醇激素的分泌有增進作用，acta處置組的e2分泌量較對照組明顯增加。其增進e2分泌的機制可能為，acta誘導卵泡顆粒細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，并通過增加顆粒細胞上fsh的受體水平及結(jié)合位點，使fsh的生理作用增強10，后者能刺激芳

10、香化酶活性，增加e2的生成。fs是一種要緊由多種垂體細胞和卵巢顆粒細胞分泌的單聚體糖蛋白，1987年第一次從牛卵泡液中提掏出來，能抑制fsh分泌。在本實驗中，fs組與對照組相較，e2分泌量無明顯不同，說明fs單獨利用未對卵巢e2的分泌產(chǎn)生阻礙。fs在結(jié)構(gòu)上與acta無關(guān)聯(lián)，但可通過與acta的不可逆結(jié)合，間接抑制顆粒細胞芳香化酶的活性、抑制垂體fsh分泌并下調(diào)未分化顆粒細胞fsh受體的表達，拮抗acta對卵泡的作用11。在對羊fs表達的研究中發(fā)覺，fs蛋白存在于羊原始卵泡的卵母細胞和低級、次級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞中，但mrna僅在次級卵泡的顆粒細胞中檢測到，因為fs結(jié)歸并中和了act12，

11、這說明在初期卵泡發(fā)育中，fs可能調(diào)控了acta的生物活性。本實驗結(jié)果顯示，a+f組e2分泌量明顯低于acta組，提示fs可能拮抗了acta對卵巢e2分泌的增進作用。朱輝等13在對離體大鼠卵泡體外培育實驗中，也觀看到相同的效應?！緟⒖嘉墨I】1vanderhydenbc,macdonaldea,nagyovae,etal.evaluationofmembersofthetgf-betasuperfamilyascandidatesfortheoocytefactorsthatcontrolmousecumulusexpansionandsuppl,2003,61(1):55-70.2 calpmk

12、,matsumotoja,vanderkraakg.activinandtrans-forminggrowthfactor-betaaslocalregulatorsofovariansteroidogenesisinthegoldfishj.gencompendocrinol,2003,132(1):142-150.3 shidaifatf,khamasm,hailatn.activin-adifferentiallyregu-latessteroidogenesisbysheepgranulosacellsj.resvetsci,2001,71(1):23-25.4 oktayk,newt

13、onh,aubardy,etal.cryopreservationofimmaturehumanoocytesandovariantissue:anemergingtechnologyj.fertilsteril,1998,69(1):1-7.5 fortuneje,kitos,wandjisa,etal.activationofbovineandbaboonprimordialfolliclesinvitroj.theriogenology,1998,49(2):441-449.6 valew,rivierj,vaughanj,etal.purificationandcharacter-iz

14、ationofanfshreleasingproteinfromporcineovarianfollicularfluidj.nature,1986,321(6072):776-779.7 juengeljl,mcnattykp.theroleofproteinsofthetransforminggrowthfactor-Bsuperfamilyintheintraovarianregu-lationoffolliculardevelopmentj.humanreprodupdate,2005,11(2):144-161.8 matinsj,baynera,cambrayn,etal.expr

15、essionofactivinsubunitsandreceptorsinthedevelopinghumanovary:activinapromotesgermcellsurvivalandproliferationbeforeprimor-dialfollicleformation.j.devbiol,2004,266(2):334-345.9 silvajr,tharasanitt,tavernema,etal.theactivin-follistatinsystemandinvitroearlyfollicledevelopmentingoatsj.jendocrinol,2006,189(1):113-125.10 zhangyq,kanzakim,mashimah,etre-versestheeffectsofactivinaondnasynthesisandapoptosisinculturedrathepatocytesj.hepatology,1996,23(2):288-293.11linsy,morrisonjr,phillipsdj,etal.regulationofova-rianfunctionbythetgf-betasuperfamilyandfollistatinj.reproduction,