總RNA提取實驗原理

1、總RNA提取實驗原理、步驟和問題解答Trizol試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性,裂解細胞并釋放出RNA,酸性條件使RNA與DNA分離,加入氯仿后離心,樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后,RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后,樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA,在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標(biāo)準(zhǔn)化RNA的產(chǎn)量十分有用。無論是人、動物、植物還是細菌組織,各種樣品最大使用量(1ml Trizol,動物組織( 50mg,植物組織(100 mg

2、,絲狀真菌( 100mg,動物細胞(5×1061×107,酵母(1×107 。TRIZOL試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如,從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色,可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶,(mRNA和hnRNA 成分兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于5 kb (28S和2 kb (18S,低分子量RNA介于0.1 和0.3 kb之間(tRNA, 5S。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值1.8 。實驗用品【實驗耗材】1、移液槍:1ml、200l、20l、10l、2l。酒精擦拭,頭部重點

3、,紫外線照射。2、吸頭:1ml、200l、20l3、勻漿管:5ml4、吸頭臺:放置1ml吸頭的一個,放置20l吸頭的一個5、EP管:1.5ml、0.2ml、100l6、試劑瓶:2個60ml的棕色廣口試劑瓶。青霉素小瓶(分裝無水乙醇,高壓的DEPC水,-20°C保存。7、量筒:50ml、250ml、500ml8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml9、試管架:5ml、1.5ml、20l10、鹽水瓶:250ml、500ml各2個備用,一個裝無水乙醇,另一個裝DEPC水11、鋁制飯盒:4個12、塑料小飯盒:1個13、大瓷缸:2個14、錫泊紙:一卷15、卷紙:2卷16、三角燒瓶:帶蓋

4、,稍大(融瓊脂糖【實驗儀器】天平、振蕩器、高速離心機、0.510ul、20200ul、1001000ul加樣器?！咀詡湓噭緿EPC(焦碳酸二乙酯,氯仿,異丙醇,無水乙醇,0.050.1%DEPC-H2O,75%乙醇,TE緩沖液,瓊脂糖。RNA抽提的準(zhǔn)備工作【試劑配制】1.DEPC水:1ml+1000ml雙蒸水=1 DEPC水,1000ml容量瓶中靜置4小時。2.75%乙醇:無水乙醇+DEPC水,-20保存(DEPC水需先高壓3.氯仿:棕色瓶4.異丙醇:棕色瓶【器具處理與準(zhǔn)備】1.塑料制品:(包括槍頭、EP管、勻漿管等先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中,將塑料制品逐個浸泡其中,小槍頭需打入DE

5、PC水,室溫過夜,高壓,烤干備用,實驗前將槍頭等放入吸頭臺,再高壓一次(EP管。膠塞同樣處理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘,用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。2.玻璃制品:泡酸過夜,沖洗干凈,1 DEPC過夜,蒙錫紙,150°C烘烤4h,180°C,2h?；蚺菟徇^夜,沖洗干凈后高溫烘烤,1 DEPC過夜,高壓。盛裝乙醇,DEPC水用。3.勻漿器:(包括剪刀、鑷子先洗凈后,再高壓(不需要泡DEPC實驗內(nèi)容和方法一、抽提(一組織抽提1.組織取材后用滅菌的錫箔紙包好保存于液氮。實驗時,在液氮中將組織研磨成粉末,趁液氮未揮發(fā)將粉末轉(zhuǎn)移到EP管,室溫5000rpm離

6、心去上清。每50-100mg組織,加入1ml Trizol。2.若是新鮮標(biāo)本經(jīng)勻漿后轉(zhuǎn)移離心管,加入1ml Trizol。3.若組織量(110 mg或細胞數(shù)很少(102104,在樣品中加入800 ul Trizol反復(fù)抽吸均勻,再加入糖原(終250ug/ml,劇烈振蕩或用勻漿器勻漿。4.在勻化后和加入氯仿之前,樣品可以在6070°C保存至少一個月。(二細胞抽提1.倒掉培養(yǎng)基,PBS洗,直接將1ml Trizol 注入培養(yǎng)瓶(5×106,反復(fù)抽吸均勻。2.或收集細胞后加入Trizol 反復(fù)抽吸均勻。二、分相4. 12000 rpm 15分鐘4°C,分相為三層。上層:

7、RNA(約為Trizol的60%;中間:DNA;下層:蛋白質(zhì)(酚-氯仿。5.小心吸取上清液,轉(zhuǎn)移到另一EP管中。1ml裂解物產(chǎn)生的上清液體積約為0.40.6 ml。有機相和中間層含有DNA和蛋白質(zhì),避免觸及。三、RNA沉淀7.離心12000rpm 10分鐘4°C。8. RNA沉淀將在離心底的側(cè)面形成。小心吸棄上清液,注意避免吸棄RNA沉淀。四、RNA清洗9.離心管加入1ml 預(yù)冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA,振蕩混均30秒,使沉淀振蕩起來,室溫12000rpm×12分鐘。(有文獻稱不超過7500g離心。盡可能吸棄上清液,防止RNA沉淀丟失。重復(fù)以

8、上清洗步驟一次。在75%乙醇中,RNA在4至少保存1周,-20至少保存1年。10.室溫選擇流動性小,倒置離心管于濾紙上,干燥RNA,但不能完全干燥(510分鐘。用DEPC水15l 溶解沉淀,55-60孵育1015分鐘。11.測量OD值后,樣品放置-70保存,一個月五、RNA、DNA濃度的計算取78l DEPC水加2l 第10步液體,則稀釋倍數(shù)為40倍?！綬NA】=A260 X 40 X n/1000g/l【DNA】=A260 X 50 X n/1000g/l(n為稀釋倍數(shù)分離RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值注意事項1. RNA

9、產(chǎn)量:每1 mg組織或1×106培養(yǎng)細胞預(yù)期的RNA產(chǎn)量(1肝和脾,610g(2腎,34g(3骨骼肌和腦組織,11.5g(4胎盤,1-4g(5上皮細胞(1×106 ,815g cultured cells(6纖維母細胞(1×106 ,57g cultured cells2.電泳檢測: 制備甲醛變性,1%瓊脂糖凝膠快速電泳,25ug/lane,65V,2.5h,檢測RNA分子完整性,觀察18S、28S條帶。3. RNA沉淀完全干燥,會極大地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值&1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶解RN

10、A,并在5560°C下孵育10分鐘,當(dāng)RNA以后要用于酶切反應(yīng)時,避免使用SDS。對于胰腺,腎等組織中RNase含量很高,沉淀用100%去離子甲酰胺溶解,70°C保存。4.分離RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0【分離膠范圍】<500bp 1.21.5%>10 kp 0.30.7%二者之間0.81.0%【分析和定量】紫外分光光度計測定A260及A280來定量分析RNA的純度及濃度。用什么稀釋的RNA,就用其調(diào)零。5.預(yù)防RNA酶污染6.在分相步驟吸取上清液過程中,和清洗步驟吸棄上清液過程中,都應(yīng)在不觸及其他相或沉淀的前提下吸取盡可能多的上清液。7.

11、臺式離心機最大能達到2,600×g的離心力,如果將離心時間延長到30-60分鐘可以滿足操作。8.當(dāng)TRIZOL用量少于2ml時建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。TRIZOL用量較大時,可以使用玻璃試管(Corex或聚丙材質(zhì)試管,事先檢驗以確保該試管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。離心前小心平衡試管。離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟?zāi)し饪?聚丙烯管必須蓋緊。9. 用TRIZOL抽提RNA時要戴手套和護眼罩。避免接觸皮膚和衣服。在化學(xué)通風(fēng)櫥完成操作。避免呼吸道吸入?！疽呻y解答】一、無RNA沉淀1. 勻漿不完全:勻漿不完

12、全時,基因組DNA分子仍然很大,溶液粘稠。變性的蛋白質(zhì)和基因組DNA一起形成絮狀凝集物容易包裹RNA,使之不能有效地釋放到溶液中。2.沉淀不完全:從小于2×105動/植物細胞、小于2mg動物組織、小于4mg植物組織或RNA含量低的動/植物組織中提取RNA時,勻漿體積太大,將造成RNA過分稀釋而不能沉淀下來。當(dāng)從這樣的樣品中提取RNA時,應(yīng)按比例減少抽提溶液。二、抽提率低1. 系統(tǒng)超負荷:如果過多增加單位體積內(nèi)的樣品量,將引起系統(tǒng)超負荷。系統(tǒng)超負荷常導(dǎo)致勻漿不完全、單位體積內(nèi)的DNA和蛋白質(zhì)所占比例增大,使RNA不能有效地釋放到上清中。系統(tǒng)超負荷還會導(dǎo)致相分離困難,降低RNA沉淀效率.

13、2.樣品均化或裂解不完全: 勻漿不完全時,RNA分子易被蛋白質(zhì)和基因組DNA復(fù)合物包裹,不能被有效釋放。3.終RNA不完全溶解:未溶解的RNA丟失。4.樣品未及時處理或細胞生長過度:樣品分離后短時間內(nèi)細胞內(nèi)RNA酶被激活,細胞生長過度同樣會激活細胞內(nèi)RNA酶,若不及時提取RNA,大部分RNA會被降解。若樣品暫時不作RNA提取,應(yīng)立即用液氮冷凍完全,置-80貯存。三、A260/A280 比率&1.651.在分光光度計測量前用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品。低離子強度和低pH溶液會增加280 nm 處的光吸收值。2.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。3.勻漿化后樣品沒有在室溫下放置5分鐘。4.分離的水樣層中污染有苯酚層。5.終RNA沒有完全溶解。四、RNA降解1.從動物體取下的組織沒有立即進行抽提或冰凍保存。2.用于抽提的樣品,或抽提的RNA樣品保存于520°C,而不是存放于70°C。3.細胞經(jīng)胰酶消化而分散。4.水溶液或試管污染有RNA酶。6. RNA在水溶液中呈酸性,易自發(fā)水解,應(yīng)溶于TE,-20以下保存。?五、DNA污染1.樣品勻漿化時所加的TRIZOL量太少。2.用于抽提的樣品包含有機溶媒(如乙醇,DMSO,強緩沖液或堿性溶液。六、蛋白多糖和多糖污染下述的對RNA沉淀方法