功能學(xué)實(shí)驗(yàn)家兔彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)

1、功能學(xué)實(shí)驗(yàn) 家兔實(shí)驗(yàn)性彌散性血管內(nèi)凝血 實(shí)驗(yàn)報(bào)告一實(shí)驗(yàn)?zāi)康膽?yīng)用靜脈注射兔腦浸液方法，復(fù)制家兔實(shí)驗(yàn)性 DIC。通過實(shí)驗(yàn)和幾項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)的測定及結(jié)果分析，了解實(shí)驗(yàn)室診斷 DIC 的常用方法。并且聯(lián)系理論知識加深理解 DIC 的病因及發(fā)病機(jī)理。二實(shí)驗(yàn)動物 未知性別家兔（實(shí)驗(yàn)室提供）一只。三實(shí)驗(yàn)過程1. 家兔于仰臥位固定，頸部剪毛，在頸部皮下注射局麻藥1%普魯卡因約5ml，行局部麻醉。 2. 用剪刀頸部切開皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露氣管后往外側(cè)拉開切口邊緣的皮膚及下方的肌肉組織，找到頸動脈并用玻璃分針分離，行頸動脈插管。 3. 第一次采集血標(biāo)本：預(yù)先向10ml離心管中注入0.5ml3.8枸櫞酸鈉溶液

2、。再打開血管夾，從頸動脈插管放血 4.5ml，立即反復(fù)顛倒混勻（切忌振蕩混勻），待離心。向動脈插管中回推生理鹽水，夾好血管夾。4. 復(fù)制 DIC 模型：抽取 2兔腦浸出液10ml于注射器中，經(jīng)耳緣靜脈緩慢推注，注入速度為每分鐘 2ml以下。同時(shí)密切觀察家兔反應(yīng)，如出現(xiàn)呼吸急促，煩動不安，當(dāng)即停止注射，迅速進(jìn)行第二次采血。若注射完后家兔未掙扎，則在注射后計(jì)時(shí)2min，2min后進(jìn)行第二次采血。采血方式與第一次采血相同。5. 將前后兩次所得的抗凝血，經(jīng) 3000rpm離心5min，將上層血漿清液分別吸至兩支清潔試管中，切忌吸入細(xì)胞成分，并作好標(biāo)記備用。其中一支試管吸入0.5ml血漿，另一只試管盡量

3、吸取剩下的血漿。6. 血漿魚精蛋白副凝固試驗(yàn)（3P實(shí)驗(yàn)）：向吸取0.5ml血漿的兩支試管中加入1%魚精蛋白溶液50l，輕輕搖勻后，在37水浴15min。取出試管，在燈光下對黑色背景一邊晃動試管一邊觀察，溶液清澈者為陰性，出現(xiàn)絮狀沉淀或膠凍狀物為陽性。7. KPTT, PT, TT, FIB實(shí)驗(yàn)：剩余兩支試管使用凝血儀測定KPTT, PT, TT和FIB，并記錄數(shù)據(jù)。四實(shí)驗(yàn)藥物及器材實(shí)驗(yàn)藥物：2兔腦浸出液（臨用前配，并在37保存），1普魯卡因溶液，3.8枸櫞酸鈉溶液。生理鹽水，1魚精蛋白溶液。實(shí)驗(yàn)器材：兔手術(shù)臺，手術(shù)器械，37電熱恒溫水浴箱，離心機(jī)，刻度離心管（2 支），試管（5支），移液器（1

4、00l，1000l），紗布。五實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象記錄家兔皮下注射局麻藥后，在皮下形成鼓包，經(jīng)按摩揉動數(shù)分鐘后，鼓包仍存在，局麻藥未完全吸收。經(jīng)家兔耳緣靜脈緩慢推注兔腦浸出液后，家兔表現(xiàn)較平靜。推注完成后計(jì)時(shí)2min27s時(shí)家兔出現(xiàn)呼吸急促，燥動不安，欲掙脫動作，此時(shí)進(jìn)行第二次采血，并離心，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測定。家兔在第二次采血后，又重新恢復(fù)平靜，呼吸正常。一小時(shí)后家兔仍未死亡。2、測量指標(biāo)記錄。組別KPTT(s)PT(s)TT(s)FIB(g/L)3P正常13.56.510.61.949陰性DIC18.27.012.92.09陰性六討論1. 靜脈注射兔腦浸液引起DIC的原因和機(jī)制兔腦浸液屬于組

5、織因子，大量的兔腦浸液靜脈注射后，可激活家兔的外源性凝血系統(tǒng)，啟動凝血過程，依次激活凝血因子FIX, FVIII, FX等，激活凝血酶，從而使血小板聚集和纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，促進(jìn)凝血。另外，凝血酶激活后反饋性激活FIX, FX, FXI, FXII等，擴(kuò)大凝血反應(yīng)。此即為高凝期，微循環(huán)易形成廣泛的微血栓。大量凝血酶的激活和微血栓形成，使血液中凝血因子和血小板被大量消耗，同時(shí)可能繼發(fā)性激活纖溶系統(tǒng)，導(dǎo)致凝血系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)不平衡，血液處于消耗性低凝期，此時(shí)機(jī)體有明顯出血癥狀。DIC時(shí)產(chǎn)生的大量凝血酶和FXIIa等激活纖溶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量纖溶酶，導(dǎo)致纖溶亢進(jìn)，大量纖維蛋白降解產(chǎn)物形成，具有明顯的抗

6、凝作用，稱繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)，此時(shí)機(jī)體出血十分明顯。2. KPTT、PT、TT、Fg和3P實(shí)驗(yàn)的原理、臨床意義以及在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)生變化的原因和機(jī)制。（1）KPTT實(shí)驗(yàn)是在血漿中加入KPTT試劑（包括接觸因子激活劑和部分磷脂）以及鈣離子，觀察血漿發(fā)生凝固的時(shí)間。由于在37時(shí)，以接觸因子激活劑可以激活凝血因XII和XI，從而激活內(nèi)源性凝血通路。另外，以部分凝血活酶腦磷脂懸液代替血小板提供凝血的催化表面，在Ca2+參與下，實(shí)現(xiàn)凝血。這樣消除了血小板對凝血的影響，最后凝血時(shí)間僅與內(nèi)源性凝血通路中的凝血因子活性有關(guān)，可以篩查內(nèi)源性凝血通路是否正常。實(shí)驗(yàn)中，由于家兔DIC時(shí)，外源性凝血通路激活的凝血酶可以反饋性

7、激活FXI, FXII，導(dǎo)致內(nèi)源性凝血通路中的凝血因子被消耗。因此KPTT延長。（2）PT是在血漿中加入過量的組織凝血活酶浸出液和鈣離子，使凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶，從而激活外源性凝血途徑，使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白即發(fā)生凝固；其凝固時(shí)間的長短是反映血漿中凝血酶原、外源性凝血因子V, VII, X以及纖維蛋白原的水平。實(shí)驗(yàn)中，由于家兔注入大量組織因子，外源性凝血通路激活，導(dǎo)致凝血酶原、外源性凝血因子以及纖維蛋白原均被消耗，因此PT時(shí)間延長。（3）TT實(shí)驗(yàn)是在血漿中加入標(biāo)準(zhǔn)化的凝血酶溶液，測定血漿凝固需要的時(shí)間，又稱為血漿凝血酶時(shí)間。由于凝血酶在血漿中主要使纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，促進(jìn)凝血。因此T

8、T主要與抗凝血物質(zhì)和纖維蛋白原含量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，外源性凝血通路激活后消耗大量纖維蛋白原形成血栓，而且繼發(fā)纖溶亢進(jìn)，因此血液中纖維蛋白原含量降低，抗凝物質(zhì)增多，造成TT延長。（4）FIB實(shí)驗(yàn)是在血漿中加入定量的凝血酶，使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，從而使血液凝固。通過測量血漿凝固的時(shí)間來計(jì)算纖維蛋白原含量。實(shí)驗(yàn)中，外源性凝血通路激活后消耗大量纖維蛋白原形成血栓，理論上血漿纖維蛋白原含量應(yīng)該降低。但實(shí)際上觀察到DIC后采血得到的血漿纖維蛋白原含量反而比實(shí)驗(yàn)前血漿要略高，可能與吸取DIC血漿樣本時(shí)，由于吸入少量細(xì)胞，在檢驗(yàn)時(shí)細(xì)胞破壞釋放蛋白質(zhì)，從而影響結(jié)果；或者由于血漿中含有異形球蛋白，影響了實(shí)驗(yàn)中血漿凝固。（5）3P實(shí)驗(yàn)用于測定血漿中纖維蛋白單體（sFM）含量。在DIC繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)期，由于纖溶系統(tǒng)激活，產(chǎn)生大量纖溶酶。纖溶酶大量降解纖維蛋白多聚體，產(chǎn)生大量FDP。FDP與sFM在血漿中可形成可溶性復(fù)合物，不會降解。加入魚精蛋白后，可溶性復(fù)合物解離，游離出的FM便會相互聚合形成不溶性的肉眼可見的顆粒狀、絮狀或膠凍狀沉淀，因此可觀察到陽性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中，由于DIC激活外源性凝血通路， 導(dǎo)致大量纖維蛋白原形成纖維蛋白單體及多聚體，因此3P實(shí)驗(yàn)應(yīng)該可見沉淀，呈陽性。到實(shí)際上未能觀察到陽性反應(yīng)，