色譜分析（中國藥科大學(xué)）第5章現(xiàn)代色譜技術(shù)簡介

1、精品文檔第五章 現(xiàn)代色譜技術(shù)簡介第一節(jié) 高效毛細(xì)管電泳分析法high performance capillary electrophoresis, HPCE一、 概述1、 開展1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳第一次的自由溶液電泳。1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速開展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的別離分析技術(shù)高效毛細(xì)管電泳分析法。2、 特點(diǎn) 儀器簡單、易自動化 分析速度快、別離效率高 操作方便、消耗少 應(yīng)用范圍極廣二、 高

2、效毛細(xì)管電泳理論根底1、 高效毛細(xì)管電泳(HPCE)根本原理電泳：帶電離子在電場中的定向移動，不同離子具有不同的遷移速度。當(dāng)帶電離子以速度在電場中移動時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場推動力和平動摩擦阻力的作用。電場力：阻力：故：-離子所帶的有效電荷；-電場強(qiáng)度；-離子在電場中的遷移速度；-平動摩擦系數(shù) ( 對于球形離子：,-離子的表觀液態(tài)動力學(xué)半徑；-介質(zhì)的粘度)。所以，遷移速度：淌度mobility ：單位電場強(qiáng)度下的平均電泳速度。淌度不同是電泳別離的根底。2、 電滲現(xiàn)象與電滲流(1) 電滲流現(xiàn)象當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會發(fā)生液體相對于固體外表的移動，這種液體相對于固體外表的移動的現(xiàn)象叫電滲

3、現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動著的液體叫電滲流electroosmotic flow ，簡稱EOF。 (2) HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度V電滲流表示，取決于電滲淌度和電場強(qiáng)度。電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)外表電荷的性質(zhì)： 內(nèi)外表帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極； 內(nèi)外表帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；(3) HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動譜帶展寬很?。灰合嗌V中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍引起譜帶展寬較大。(4) HPCE中電滲流

4、的作用 可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的別離； 改變電滲流的大小和方向可改變別離效率和選擇性； 電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性。3、 HPCE中影響電滲流的因素(1) 電場強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。(2) 毛細(xì)管材料的影響 不同材料毛細(xì)管的外表電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；(3) 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響對于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，外表電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大，pH=7，到達(dá)最大；pH<3，完全被氫離子中和，外表電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加

5、，電滲流下降。(4) 溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。(5) 添加劑的影響 參加濃度較大的中性鹽如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減?。?參加外表活性劑，可改變電滲流的大小和方向，如參加陰離子外表活性劑，如十二烷基硫酸鈉SDS，電滲流增大； 參加有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。三、 HPCE中的參數(shù)1、 遷移時(shí)間保存時(shí)間2、 別離效率塔板數(shù)3、 別離度 四、 影響別離效率的因素區(qū)帶展寬(1) 縱向擴(kuò)散的影響在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬。由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的別離效率大分子生物試樣別離的依據(jù)。(2)

6、進(jìn)樣的影響當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散，別離效率明顯下降。(3) 焦耳熱與溫度梯度的影響 散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度中心溫度高，破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：減小毛細(xì)管內(nèi)徑；控制散熱。(4) 溶質(zhì)與管壁間的相互作用 存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬。細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比外表積大，又增加了溶質(zhì)吸附的時(shí)機(jī)。改善方法：參加兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時(shí)，抑制對蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對電滲流影響不大。(5) 其他影響因素 電分散作用及“層流現(xiàn)象。五、

7、高效毛細(xì)管電泳的別離模式1、 毛細(xì)管區(qū)帶電泳capillary zone electrophoresis ，CZE最根本、應(yīng)用廣的別離模式電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反；V電滲流 >V電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類別離,同種類離子由于差速遷移被相互別離。2、 膠束電動毛細(xì)管色譜(micellar electrokinetic capillary chromatography，MECC)緩沖溶液中參加離子型外表活性劑，其濃

8、度到達(dá)臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場力的作用下，膠束在柱中移動。電泳流和電滲流的方向相反，且V電滲流 >V電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動；中性分子在膠束相和溶液水相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長；色譜與電泳別離模式的結(jié)合。3、 其它別離模式 毛細(xì)管凝膠電泳capillary gel electrophoresis ，CGE 毛細(xì)管等電聚焦capillary isoelectric focusing，CIEF 毛細(xì)管等速電泳capillary isotachophoresis ，CITP 毛細(xì)管電滲色譜capillary electroosmo

9、stic chromatography ，CEC六、 應(yīng)用 離子分析 藥物分析 手性化合物分析 氨基酸分析 毛細(xì)管等電聚焦(CIEF) 核酸分析及DNA測序七、 進(jìn)展 微型化 聯(lián)用儀器 CE-MS 陣列毛細(xì)管凝膠電泳第二節(jié) 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)一、 概述開展：Horning、20世紀(jì)70年代。特點(diǎn)：集液相色譜的高別離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)鑒定能力于一體，對研究對象不僅有足夠的靈敏度、選擇性，同時(shí)還能夠給出一定的結(jié)構(gòu)信息，分析快速而且方便，具有其他分析方法所不能比擬的優(yōu)點(diǎn)。地位：隨著接口技術(shù)的不斷開展，液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)聯(lián)用技術(shù)在藥物分析等領(lǐng)域的地位越來越重要,分析范圍更廣。二、 LC-MS的

10、根本組成LC-MS聯(lián)用儀的根本組成包括HPLC裝置、接口裝置與離子源、質(zhì)量分析器。1、 接口技術(shù)(1) 接口的作用 將洗脫劑及樣品分子氣化； 別離除去大量的洗脫劑分子； 完成對樣品分子的離解； 在樣品分子已經(jīng)電離的情況下，最好能進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離CID。(2) 接口的種類LC-MS采用過的接口：直接液體導(dǎo)入接口(DLI)、傳送帶接口(MBI)、粒子束接口(PBI)、熱噴霧接口(TSI)、大氣壓離子化接口(API)、電噴霧接口(ESI)、音噴離子化接口(SSI)、動態(tài)快原子轟擊接口(FAB)、等離子體噴霧接口(PSP)、基質(zhì)輔助激光解吸離子化接口(MALDI)等。大氣壓離子化(API)接口的應(yīng)用,

11、徹底改變了LC/MS的面貌。使其迅速成為體內(nèi)藥物分析中應(yīng)用最廣的分析儀器。三、 大氣壓離子化接口技術(shù)API1、 分類 電噴霧離子化(electrospray ionization, ESI) 氣動輔助電噴霧離子化(pneumatically assisted electrospray ionization) 大氣壓化學(xué)離子化(atmospheric pressure chemical ionization, APCI) 它們的共同點(diǎn)是樣品的離子化在處于大氣壓下的離子化室內(nèi)完成，離子化效率高，大大增強(qiáng)了分析的靈敏度和穩(wěn)定性。2、 電噴霧離子化ESI(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖樣品溶液通過毛細(xì)管導(dǎo)

12、入大氣壓電離源內(nèi)，在氣化氣的幫助下和源內(nèi)毛細(xì)管終端與反電極之間強(qiáng)電場的作用下，樣品溶液形成帶電荷的霧，即電噴霧。這些霧滴在熱氮?dú)饬飨抡舭l(fā)，半徑逐漸縮小，霧滴外表的電場不斷增強(qiáng)到某一臨界點(diǎn)時(shí)發(fā)生離子的場發(fā)射，或溶劑完全蒸發(fā)。生成的樣品氣相離子經(jīng)質(zhì)量分析器分析，測得它們的質(zhì)荷比。ESI過程： 靜電噴霧 去溶劑 離子蒸發(fā)。(1) 特點(diǎn) 高的離子化效率； 多種離子模式供選擇； “軟離子化方式使熱不穩(wěn)定化合物得以分析并產(chǎn)生高豐度的準(zhǔn)分子離子峰；(2) 應(yīng)用 小分子藥物及其各種體液內(nèi)代謝物的測定 農(nóng)藥及化工產(chǎn)品的中間體和雜質(zhì)鑒定 大分子的蛋白質(zhì)和肽類的分子測定 氨基酸測序及結(jié)構(gòu)研究 分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用3

13、、 大氣壓化學(xué)離子化APCI(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖在大氣壓條件下采用電暈放電方式使流動相離子化，然后流動相作為化學(xué)離子化反響氣氣相試劑使樣品離子化。樣品分子的離子化通過質(zhì)子化或電荷轉(zhuǎn)移來實(shí)現(xiàn)。此外，還可通過去質(zhì)子樣品為酸，電子捕獲鹵素、芳香化合物及形成加合物如、的方式來實(shí)現(xiàn)。(2) 特點(diǎn) 軟電離接口技術(shù)； 電離過程只產(chǎn)生單電荷峰，非常適合弱極性小分子化合物的測定； APCI還與高流量的梯度洗脫和上下水溶液變換的流動相兼容，通過調(diào)解離子源電壓，可以得到不同斷裂程度的質(zhì)譜圖。 四、 質(zhì)量分析器1、 四極桿質(zhì)譜儀quadrupole mass spectrometer(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意

14、圖離子從一端進(jìn)入四極桿，沿z方向恒速前進(jìn)，由于在四極桿上加了直流電壓和射頻磁場Vrf,離子在x軸和y軸方向進(jìn)行復(fù)雜振蕩。有一個(gè)穩(wěn)定的振蕩能是特定的離子從四極桿的一端飛到另一端而沒有碰到電極上。這一振蕩取決于一個(gè)離子的質(zhì)荷比。因此在一定條件下，僅一個(gè)質(zhì)荷比的離子通過四極桿，其它離子由于不穩(wěn)定的振蕩將會碰到四極桿上而喪失。(2) 特點(diǎn) 在較低的真空度下工作； 掃描速度較快，有利于色譜儀聯(lián)用； 四極質(zhì)譜儀為低分辨率儀器； 掃描時(shí)間短<100ms,特別適合色譜峰的實(shí)時(shí)掃描； 缺點(diǎn)：四極質(zhì)譜儀還有質(zhì)量歧視效應(yīng)。 2、 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀time-of-flight mass spectrometer,

15、 TOF MS(1) 工作原理及結(jié)構(gòu)示意圖其中由103104V的電場脈沖將離子源產(chǎn)生的樣品離子加速到無場的飛行管內(nèi)。所有離子進(jìn)入到飛行管內(nèi)時(shí)具有相同的動能，但他們的飛行速度與它們的質(zhì)量成反比，輕的離子較重的離子早飛行到達(dá)檢測器，典型的飛行時(shí)間時(shí)130µm。(2) 特點(diǎn) 靈敏、分辨率高、快速； 理論上質(zhì)量范圍無限； 可以得到化合物的精確質(zhì)量數(shù)； 結(jié)構(gòu)簡單。3、 其它質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)譜儀ion trap mass spectrometer, ITMS 傅立葉變換質(zhì)譜儀Fourier transform mass spectrometer, FTMS 扇形磁場質(zhì)譜儀magnetic sector mass spectrometer4、 串聯(lián)質(zhì)譜三級四極桿質(zhì)量分析器trilple-quadrupole analyzer空間串聯(lián)質(zhì)譜法由三個(gè)順序連接的四極桿