DNA濃度的檢測(cè)(共11頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上可以。DNA的堿基在260nm處有吸收。用紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm處DNA分子的OD值，就能通過(guò)朗伯-比爾定律OD=lc換算出濃度。式子里l是吸收光路的長(zhǎng)度；c是濃度，單位一般用g/ml；是吸光系數(shù)，雙鏈DNA一般取0.02ml/(gcm)，單鏈DNA因?yàn)樵錾?yīng)，要大一些，取0.05ml/(gcm)。如果知道一個(gè)DNA片段的堿基數(shù)，還可以換算出DNA片段的物質(zhì)的量濃度。取1DNA，用ddH2O水稀釋到1ml，以1ml ddH2O為對(duì)照，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260，OD280，OD260/OD280(都在 1.8左右之間，說(shuō)明 DNA樣品純度較高),concent

2、ration。 另，基因組DNA1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均呈現(xiàn)完整清晰條帶沒有拖尾，說(shuō)明 DNA 樣品的完整性好，也可通過(guò)DNA marker 推算出DNA濃度。目的： 了解紫外吸收檢測(cè)DNA濃度與純度的原理，掌握測(cè)定方法。原理： 核酸的最大吸收波長(zhǎng)為260nm，蛋白質(zhì)為280nm，在波長(zhǎng)260nm時(shí)，1OD值相當(dāng)于雙鏈DNA濃度為50g/ml，單鏈寡核苷酸的含量為30g/ml，可以據(jù)此來(lái)計(jì)算核酸樣品的濃度,還可通過(guò)測(cè)定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估計(jì)核酸的純度。純凈DNA的比值為1.8, RNA為2.0。若比值高于1.8說(shuō)明DNA樣品中的RNA尚未除盡，若

3、樣品中含有酚和蛋白質(zhì)將導(dǎo)致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干擾。 紫外分光光度法只能用于測(cè)定濃度大于0.25g/ml的核酸溶液，對(duì)濃度更小的樣品，可采用熒光分光光度法。試劑與儀器： 提取的質(zhì)粒DNA，紫外分光光度儀。操作步驟：1) 分光光度計(jì)先用水在260nm和280nm兩個(gè)波長(zhǎng)下校零。2) 取質(zhì)粒DNA樣品2l，用水稀釋100倍，轉(zhuǎn)入分光光度計(jì)的石英比色杯中。3) 在260nm和280nm分別讀出樣品光密度值。如果樣品濃度單位為g/l，則樣品DNA濃度為OD 值的10倍，即如OD260=0.1，則樣品濃度即為1g/l。4) 若OD260/OD280大于1.8，說(shuō)明仍有RNA，可以考慮

4、用RNA酶處理樣品，若小于1.8，說(shuō)明樣品中含有蛋白質(zhì)或酚，應(yīng)再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀純化DNA?！?od=0.05ug/ul”這個(gè)說(shuō)法很不嚴(yán)謹(jǐn)。按照我的理解，這句話的意思是：在光程為1cm的吸收池內(nèi)，測(cè)得雙鏈DNA的OD值為1時(shí)，DNA溶液的濃度為0.05g/L。因?yàn)镺D=lc，這里OD=1，光程l通常都是1cm，雙鏈DNA的吸收系數(shù)=0.02mL/(gcm)，那么濃度c=OD/(l)=1/0.02mL/(gcm)*1cm=50g/mL=0.05g/L。樓主的測(cè)定在類似條件下，所以l=1cm，=0.02mL/(gcm)，而OD=0.45，所以濃度c=OD/(l)=0.45/0.02mL/

5、(gcm)*1cm=22.5g/mL=0.0225g/L。實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作：1 所用離心管、槍頭要洗凈、烘干（最好滅菌）。2 試劑配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0): 稱取Tris-Base 121g, 加入約800 ml 水在磁力攪拌器上攪拌，使其充分溶解后加入濃鹽酸調(diào)整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 滅菌后于室溫保存。0.5 M EDTA (pH 8.0): 稱取EDTA-Na2鹽 187 g 加入約 800 ml水，在磁力攪拌器上邊攪拌邊加入固體NaOH，當(dāng)EDTA和NaOH均完全溶解，溶液變清時(shí)其pH值剛好達(dá)到8.0左右，再用pH試紙略加調(diào)整即可, 滅菌后于室溫保存

6、。5.0 M NaCl: 稱取NaCl 300 g, 加入蒸餾水約800 ml 于磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢瑁s5分鐘后停止攪拌，靜止23分鐘，倒出上清液，再加入100 ml蒸餾水重復(fù)前面的步驟，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 滅菌后于室溫保存。酚：氯仿：異戍醇（25：24：1）的配制：可參考分子克隆亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸餾水50 ml，8-羥基喹嚀0.05g 加入500 ml玻璃燒杯于磁力攪拌器上邊加熱邊攪拌，待酚達(dá)到水飽和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：異戌醇（24：1），攪拌1020分鐘，靜止約10

7、分鐘，除去上層水相后，裝入棕色瓶，最后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保護(hù)液于4保存。DNA Buffer的配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml0.5 M EDTA (pH 8.0):100 ml5.0 M NaCl:300 mlH2O500 ml滅菌后于室溫下保存3個(gè)月左右，用時(shí)按1.5%往Buffer中加入CTAB，在電爐上燒開；在通風(fēng)櫥里加入1%的巰基乙醇( 現(xiàn)配現(xiàn)用)。DNA的提取：1 取25 g葉片或愈傷組織，加入適量液氮研碎，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管，加入20 ml DNA提取緩沖液充分搖勻，于65水浴6090 min，中途輕輕搖勻兩次。2 加入

8、15 ml 氯仿：異戍醇（24：1）輕輕搖勻10分鐘，于BECKMAN離心機(jī)中4000 rpm離心15分鐘。3 取上清液于另一50 ml離心管加入10 ml 氯仿：異戍醇（24：1）重復(fù)步驟2。4 吸上清液于一干凈的50 ml 離心管，加入15 ml 冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于-20冷凍半小時(shí)，4000 rpm離心10分鐘。棄上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或過(guò)夜），中途換乙醇2-3次。5 棄乙醇風(fēng)干沉淀約半小時(shí)，加入3.0 ml TE緩沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA , pH 8.0），20 l RNase A（

9、10 mg/ml），37溫浴過(guò)夜。6 溶液轉(zhuǎn)入一10 ml離心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）充分顛倒混勻，4000 rpm離心15 min，吸上清液于另一10 ml的離心管中，（可重復(fù)一次）。7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水飽和乙醚，充分混勻，4000 rpm離心5 min。8 棄乙醚，用20 l槍頭擋住離心管管口內(nèi)側(cè)，用力下壓槍頭，使槍頭與管壁間形成一狹縫，讓下清液從縫中流入另一10 ml離心管。9 加入5 ml冷凍的異丙醇，輕輕搖勻后于-20冷凍半小時(shí)，4000 rpm離心10分鐘。棄上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡46 h（或過(guò)夜），

10、中途換乙醇2-3次。風(fēng)干乙醇，加入500 l TE溶解，或浸在乙醇中長(zhǎng)期保存。DNA檢測(cè)1 取DNA原液15 l稀釋至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。高質(zhì)量的DNA要求：A260/A2302.0； 1.7A260/A28012或pH3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液中的NaOH濃度為0.2mol/L,加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的PH就高達(dá)12.6,因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性. SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。

11、（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。 3溶液-3MOL/L NaAc(pH4.8)溶液 NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8,必須加入大量的冰醋酸.所以該溶液實(shí)際上是NaAc-Hac的緩沖液.用PH4.8的NaAc溶液是為了反pH12.6的抽提液,調(diào)回PH至中性,使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性,并能穩(wěn)定存在.而高鹽的3MOL/L NaAc有利于變性的大分子染色體DNA,RNA,以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀

12、之.前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?減少相斥力而互相聚合,后者是因?yàn)殁c鹽與SDS-蛋白復(fù)合物作用后,能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物,使沉淀更完全.4. 為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA? 用無(wú)水乙醇沉淀DNA,這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法.乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶,乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng),對(duì)DNA很安全,因此是理想的沉淀劑. DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在,當(dāng)加入乙醇時(shí),乙醇會(huì)奪DNA周圍的水分子,使DNA失水而易于聚合.一般實(shí)驗(yàn)中,是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合,其乙醇的最終含量占67%左右.因而也可改用95%乙醇來(lái)替代懈水乙醇(因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95%乙醇昂貴).但

13、是加95%的乙醇使總體積增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA損失也增大,尤其用多次乙醇沉淀時(shí),就會(huì)影響收得率.折中的做法初次沉淀DNA時(shí)可用95%乙醇代替無(wú)水乙醇,最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇.也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA.一般在室溫下放置15-30分鐘即可. 5.在用無(wú)水乙醇沉淀DNA時(shí)，為什么一定要加NaAC或NaCL至最終濃度達(dá)0.10.25MOL/L? 在Ph為8左右的DNA溶液中,DNA分子是帶負(fù)電荷的,加一定濃度的NaAC或NaCL,使Na2+中和DNA分子上的負(fù)電荷,減少DNA分子之間的同性電荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀,當(dāng)加入的鹽溶液

14、濃度太低時(shí),只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合,這樣就造成DNA沉淀不完全,當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí),其效果也不好.在沉淀的DNA中,由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在,影響DNA的酶切等反應(yīng),必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀. 6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,為什么再要用SDS與Kac來(lái)處理? 加進(jìn)去的Rnaese本身是一種蛋白質(zhì),為了純化DNA,又必須去除之,加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀,再加Kac使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物,使沉淀更加完全.也可用飽和酚，氯仿抽提再沉淀，去除Rnese。在溶液中，有人以Kac代替NaAc，也可以收到較好的效果。 7為什么在保存或抽提

15、DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液？ 在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa=7.2）和硼酸系統(tǒng)(pKa=9.24)等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍,可作DNA的保存液,但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí),磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2+產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀;在DNA反應(yīng)時(shí),不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同,有的要求高離子濃度,有的則要求低鹽濃度,采用Tris-HCL(pKa=8.0)的緩沖系統(tǒng),由于緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子的干擾作用,故在提取或保存DNA時(shí),大都采用Tris-HCL系統(tǒng),而TE緩沖液中的ED

16、TA更能穩(wěn)定DNA的活性. 8.如何選擇聚乙二醇(6000)的濃度來(lái)沉淀DNA? 采用PEG(6000)沉淀DNA,大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同,PEG的濃度低,選擇性沉淀DNA分子量大,大分子所需PEG的濃度只需1%左右,小分子所需PEG濃度高達(dá)20%.本實(shí)驗(yàn)選擇性沉淀4.3Kb的pBR322質(zhì)粒DNA,每毫升加入0.4毫升的30%PEG,其最終PEG濃度為12%.PEG選擇性沉淀DNA的分辯率大約100bp. 9.抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí),怎樣使用酚與氯仿較好? 酚與氯仿是非極性分子,水是極性分子,當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí),蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去使蛋白失去

17、水合狀態(tài)而變性.經(jīng)過(guò)離心,變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大,因而與水相分離,沉淀在水相下面,從而與溶解在水相中的DNA分開.而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大,保留在最下層. 作為表面變性的酚與氯仿,在去除蛋白質(zhì)的作用中,各有利弊,酚的變性作用大,但酚與水想有一定程度的互溶,大約10%15%的水溶解在酚相中,因而損失了這部分水相中的DNA,而氯仿的變性作用不如酚效果好,但氯仿與水不相混溶,不會(huì)帶走DNA.所以在抽提過(guò)程中,混合使用酚與氯仿效果最好.經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚,由于酚與氯仿是互溶的,可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì),此時(shí)一起將酚帶走.也可以在第二次抽提時(shí),將酚與氯仿混合(1:1)使用. 1

18、0.為什么用酚與氯仿抽提DNA時(shí),還要加少量的異戌醇? 在抽提DNA時(shí),為了混合均勻,必須劇烈振蕩容光煥發(fā)器數(shù)次,這時(shí)在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)阻止相互間的充分作用.加入異戌醇能降低分子表面張力,所以能減少抽提過(guò)程中的泡沫產(chǎn)生.一般采用氯仿與異戌醇為24:1之比.也可以采用酚,氯仿與異戌醇之比為25:24:1(不必先配制,可在臨用前把一份酚加入一份24:1的氯仿互異戌醇即成,)節(jié)同時(shí)異戌醇有助于分相,使離必后的上層水相,中層變性蛋白相以及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定. 11.為什么要用pH8的Tris水溶液飽和酚?呈粉紅色的酚可否使用?如何保存酚不被空氣氧化? 因?yàn)榉优c水有一定的互溶.苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過(guò)程中,不致吸收樣品中含有DNA的水分,減少DNA的損失.用Tris調(diào)節(jié)至PH為8是因?yàn)镈NA在此條件下比較穩(wěn)定.在中性或堿性條件下(PH57),RNA比DNA更容易游離到水相,所以可獲得