哺乳動(dòng)物組織基因組DNA提取(綜合性實(shí)驗(yàn))

1、0本科學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào)： % 姓名： 學(xué)院： 生命科學(xué)學(xué)院 專業(yè)、班級(jí)： 11應(yīng)用生物教育A班 實(shí)驗(yàn)課程名稱： 哺乳動(dòng)物組織基因組DNA提取 教 師： 張 玲 開 課 學(xué) 期： 2013 至 2014 學(xué)年 上 學(xué)期 填 報(bào) 時(shí) 間： 2013 年 10 月 19 日云南師范大學(xué)教務(wù)處編印一實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案實(shí)驗(yàn)序號(hào)及名稱：綜合性實(shí)驗(yàn): 哺乳動(dòng)物組織基因組DNA提取（Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue）實(shí)驗(yàn)時(shí)間第5、7、8周實(shí)驗(yàn)室睿智樓3幢422（生物綜合實(shí)驗(yàn)室1）（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?Experimental Purpose)：1.掌握動(dòng)物基因組DN

2、A提取的操作方法；2.掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作的方法。After the experiment is finished, students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue, and to run an agarose gel. （二）實(shí)驗(yàn)原理(Experimental Principle)：本實(shí)驗(yàn)利用去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉)是為了使蛋白變性并溶解細(xì)胞膜中的脂質(zhì)從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解，而細(xì)胞裂解物又常用蛋白酶K進(jìn)行水解處理。 隨后用酚：氯仿進(jìn)行抽提，以去除殘留的蛋白質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)將進(jìn)入有機(jī)相，或者假如己變性的話將呈

3、現(xiàn)在有機(jī)相與水相之間。乙醇沉淀處理則可以濃縮DNA，同時(shí)去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。 為了進(jìn)一步保護(hù)DNA樣品的完整性，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，這樣將會(huì)減少脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因?yàn)樵撁副仨氃谟蠱g2+存在時(shí)才會(huì)起作用。 本實(shí)驗(yàn)方法分離得到的染色體DNA長度為100-150kb，適用于構(gòu)建基因組文庫和Southern雜交分析。如果要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟。 In the procedure described here, the detergents SDS ( sodium dodecyl su

4、lfate) are added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis . The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins. This is generally followed by phenol of phenol: chloroform extraction to remove the remaining proteins, which will either en

5、ter the organic phase or, if denatured, appear at the interphase . Chloroform treatment is used to remove the phenol, and alcohol precipitation concentrates the DNA while removing nucleotides, amino acids, and low - molecular- weight oligonucleotides and peptides. As a further precaution, ethylene d

6、iamine tetraace-tic acid (EDTA) is include-ed in the buffers to chelate Mg2+. This will reduce deoxyribonuclease (DNase) activity because of the Mg2+ requirement of these enzymes. The protocol described here result in DNA that is easily cut with restriction enzymes and, therefore, is useful for Sout

7、hern Hybridization studies. If the DNA is to be used to construct a clone bank, higher molecular weight DNA is desirable, so the vortex step should be eliminated.（三）試劑與器材（Reagents and apparatus）： . InstrumentsHigh speed refrigerated centrifuge（高速冷凍離心機(jī)）、 Glass homogenizer （玻璃勻漿器） 、 Electrophoresis Sy

8、stem （電泳系統(tǒng)） 、 Ultraviolet transilluminator （紫外透射儀） 、 Ultra cold storage freezer （超低溫冰箱） 、Autoclave （高壓滅菌鍋） 、 Pipettes （微量加樣器） 、Electronic balance （電子天平） 、 Acidometer （酸度計(jì)）。. MaterialLiver of mice . ReagentsTris、SDS、EDTA、 HCl、 NaOH 、 Sodium acetate、 Acetic acid、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TE

9、buffer 、Protease K、RNase A、Agarose 、DNA molecular weight markers 、Boric acid、Sugar、 Bromophenol blue、 Fluorescent dye (Gelview)。(四)、實(shí)驗(yàn)步驟(Experimental Procedures)：核酸分離純化的一般步驟：破碎細(xì)胞去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子沉淀核酸去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)純化干燥溶解。核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點(diǎn)而定。對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)

10、量均高的核酸分子。（一）儲(chǔ)備液的制備1、5mol/L Nacl：溶解14.6g氯化鈉于足量的水中，定容至50ml。 21 molL Tris緩沖液（Tris·HCl buffer）：將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調(diào)整終體積至1L。 3 0.5 mol/L乙二胺四乙酸EDTA pH8.0：配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽?；蚍Q取9.31g的Na2EDTA·2H2O和1g的NaOH，pH調(diào)至8.0，并溶于約40ml水中，定容至50ml 。4ddd

11、 H0。540%氫氧化鈉（NaOH）：溶解40g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），氫氧化鈉完全溶解后用水定容至100ml 。61mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。7組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml ：100mmolL NaCl：0.2ml（5M NaCl），25 mmolL EDTA(pH8.0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8.0)，l0mmolL Tris· HCIpH 8.0)：0.1ml（1M Tris· HCIpH 8.0)，加三蒸水: 9.2ml。8、3 mol/L NaAc pH5.2

12、：溶解20.4g的三水乙酸鈉于約40ml水中，用冰乙酸調(diào)溶液的pH至5.2，再加水定容到50ml 。9生理鹽水（0.85% NaCl）。10 10%十二烷基硫酸鈉SDS：稱取5gSDS慢慢轉(zhuǎn)移到約含40ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至50ml 。11 5TBE（電泳緩沖液）100mL：5.4gTris，2.75g硼酸，2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)，加蒸餾水到100mL pH8.0。1210 mg/ mL 蛋白酶K（proteinase K） -20保存：將200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，輕輕搖動(dòng)，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容

13、到10ml，然后分裝成小份貯存于-20。1310mg/mL無DNA酶的RNA酶-20保存：溶解10mg的胰蛋白R(shí)NA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的TrisHCl調(diào)pH至7.5，于-20貯存。（配制過程中要戴手套）。 146 凝膠加樣緩沖液：0.25溴酚藍(lán)：取60ml雙蒸水，將250mg溴酚藍(lán)溶解于其中，40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖。15酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml：200mmolL NaCl：0.04ml （5M NaCl），50mmolL EDTA(pH 8.0)：0

14、.1ml （0.5M EDTA pH8.0) ，20mmolL Tris·HCl(pH 8.0)：0.02ml（1M Tris· HCIpH 8.0)，1SDS：0.1ml（10 SDS），200gmL蛋白酶K：0.02ml（10mgmL），加三蒸水： 0.72ml。16提取液1 ：平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇（25：24：1）即配即用每管加500ul。平衡酚(pH8.0)：250ul；氯仿:240ul;異戊醇：10ul17提取液2：氯仿：異戊醇（24：1）即配即用：每支試管加 500 ul，氯仿：480ul，異戊醇：20ul。18TE緩沖液5ml：10mmolL ；

15、Tris· HCl(pH 8.0)：0.05ml（1M L Tris·HCI pH 8.0)；1mmolL EDTA(PH80)： 0.01m（ 0.5MEDTA pH8.0)；加三蒸水至4.94mL。（二）破碎、酶解細(xì)胞（過夜）冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器 冰冷的生理鹽水清洗（3次）配制工作液 處死小鼠 取出肝臟（0.2g） 組織勻漿液 酶解液2ml勻漿液 組織細(xì)胞液 45000rmin3060s 玻璃勻漿器勻漿 移至1.5ml離心管 離心 棄上清液，加400ul 吹散 加400ul 無菌水 酶解液 水浴處理（55、1218h）（三）抽提DNA 、乙醇沉淀純化DNA加入20

16、ul的RNase 等量分裝在兩支離心管內(nèi) 37水浴1h 加入等體積提取液(翻轉(zhuǎn)混勻) 4 10min酶解樣品配制 待抽提的樣品 抽提 靜置 離心 TE緩沖液 加等體積提取液500ul10000rmin離心10min 4 10min 移出水相 至離心管 抽提 靜置 10000rmin離心10min 加1/10 加2倍 放入離心 移出水相 NaAc 無水乙醇 -20 1-2h 12000rmin離心15min 加入超低溫冰箱 融化、離心 棄上清液 洗滌 12000rmin離心15min 干燥 混勻75%冷乙醇 離心 棄上清液 加TE50ul （存放）（四）瓊脂糖凝膠電泳檢測DNAAgarose G

17、el Electrophoresis ： Preparation of the gel 制備0.3瓊脂糖凝膠 Loading DNA samples DNA samples 16µl + Loading buffer4µl Gel 電壓120V Gel photography1.制備 0.3 瓊脂糖凝膠。稱取 0.06 g 瓊脂糖，放人錐形瓶中，加入 20 mL的 0.5×TBE 緩沖液，放入微波爐加熱至完全溶化，則為 0.3 瓊脂糖凝膠液。（由于蒸發(fā)作用，溶解前在容量瓶上作一個(gè)記號(hào)，溶解后用三蒸水補(bǔ)足）。2.制膠器的安裝。3.將熔化的瓊脂糖凝膠液轉(zhuǎn)入Gelvie

18、w專用的三角瓶中，然后加入Gelview 2µl。4. 將冷到60左右，緩緩倒入制膠器(注意不要形成氣泡)。5. 待膠凝固后（80min），輕輕拔掉梳子，將凝膠盤從制膠槽中取出，放入電泳槽內(nèi)。6. 加入電泳緩沖液(0.5×)至電泳槽中。 通過紫外透射儀檢測凝膠，然后獲取圖片。并將產(chǎn)物條帶與已知分子量的標(biāo)淮條帶進(jìn)行比較，便可以對(duì)合適分子量大小的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。Illuminate the gel with UV light and then take pictures. By comparing product bands with bands from the known m

19、olecular-weight markers, you should be able to identify any product fragments which are of the appropriate molecular weight.（五）、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：分離核酸的一般原則 因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。 1）、核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則： 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子的污染。 2）、核酸的純度要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子

20、的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。 3）、核酸分離純化的注意事項(xiàng) 為保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意： 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞； 減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH410條件下進(jìn)行； 防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣

21、品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素； 減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。 高溫：如長時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為04以降低核酸酶的活性從而減少對(duì)核酸的生物降解。機(jī)械剪切力：包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；細(xì)胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。操作過程中注意：、移液槍的正確使用，取量時(shí)才能取得準(zhǔn)確；、

22、各個(gè)步驟中的振蕩，需根據(jù)其原理不同程度進(jìn)行振蕩；、在移出水相的過程中，需特別注意移液槍的正確使用，準(zhǔn)確記錄移出水相的體積；、離心時(shí)兩個(gè)相對(duì)的離心管的體積應(yīng)基本一致；、在電泳等操作中應(yīng)注意帶手套，保證安全。（六）、參考文獻(xiàn)1、Andy Bates等，分子生物學(xué)（導(dǎo)讀版），科學(xué)出版社，2009.8；2、李鈞敏，分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，浙江大學(xué)出版社，2010.6；3、劉維全等，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，化學(xué)工業(yè)出版社，2009.4；4、魏春紅等，現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，高等教育出版社，2012.2；5、李衛(wèi)芳等，生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，中國科技大學(xué)出版社，2012.1。二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與結(jié)果（）、

23、冰冷的生理鹽水清洗肝臟后肝臟會(huì)泛白，洗滌液不再呈現(xiàn)血紅色；（）、玻璃勻漿器勻漿后肝臟被磨碎，呈現(xiàn)血紅色；（）、離心后離心管底部出現(xiàn)沉淀，上層為淡黃色液體；（）、加入和提取液離心后都會(huì)分成有機(jī)相和水相，二者明顯分層；（）、放入超低溫冰箱 1到2小時(shí)后取出來時(shí)看到液體凝結(jié)；（）、加入75%冷乙醇離心后看到離心管底部有沉淀；（）、隨著電泳的開始，電泳槽內(nèi)，出現(xiàn)水瀑布現(xiàn)象；（）、隨著瀑布的形成，點(diǎn)樣孔里面材料也慢慢在電極的作用下滲入到瓊脂糖凝膠里面；（）、電泳后，在紫外燈下可以看到呈現(xiàn)出淡黃色的熒光物質(zhì)；（）、酚抽提除去蛋白質(zhì)時(shí)，試液分層：上層為水相，下層為酚相。（）、電泳后在紫外光下觀察時(shí)看到明亮的

24、條帶，同時(shí)還有一些條帶不太鮮亮，有拖尾現(xiàn)象。此次實(shí)驗(yàn)所得紫外透射儀檢測凝膠照片如圖所示：小白鼠基因組DNA的電泳條帶圖2對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析及其結(jié)論：1）、玻璃勻漿器勻漿后，溶液呈現(xiàn)血紅色，因?yàn)榧?xì)胞破裂釋放出了血紅蛋白；2）、離心后的上清液含一些細(xì)胞碎片等廢棄物；3）、加入提取液離心后，溶液分層，上層為水相，下層為有機(jī)相：水相含有我們所需要的DNA等物質(zhì)，有機(jī)相為提取液酚類等物質(zhì)；4）、多次離心，移出水相，目的在于提取出DA；5）、之后的分別加入NaAc、無水乙醇、冰乙醇目的在于沉淀DNA，并純化，因?yàn)楹怂崤c鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機(jī)溶劑中不溶，也不會(huì)變性。因此，離心后，溶液中出現(xiàn)沉淀，棄