大黃靈仙膠囊對慢性肝損傷后膽結(jié)石形成的干預(yù)作用研究

1、大黃靈仙膠囊對慢性肝損傷后膽結(jié)石形成的干預(yù)作用研究                 作者：唐乾利，俞淵，黃名威，關(guān)中正，高善輝 【關(guān)鍵詞】   慢性肝損傷； 肝硬化； 大黃靈仙膠囊； 膽結(jié)石； 肝臟超微結(jié)構(gòu)Abstract：ObjectiveTo study the interference effect and its mechanism of Dahuanglinxian Capsules on gallstone for

2、mation after chronic liver injury of rabbits. Methods46 rabbits were randomly divided into 5 groups, respectively named by group A (normal control group), group B (chronic liver injury group), group C (liver cirrhosis group), group D (group fed with large dose Dahuanglinxian capsule) and group E (gr

3、oup fed with large dose Dahuanglinxian capsule). The chronic liver injured rabbits were induced by subcutaneous injection with CCl4 and each group was treated by different factors at the same time. The gallstone formation rate, liver function biochemical index, pathological changes in liver tissues,

4、 ultrastructural changes, and biliary component change were observed by the methods of biochemical and pathological technology. ResultsThe gallstone formation rate of group B and C were obviously higher than group A (P0.05 or P0.01). The gallstone formation rate of D and E were obviously lower than

5、group C (P0.05 or P0.01). There were abnormal ultrastructural changes to certain extent in models B and C. Compared with the model groups, the D and E groups improved the ultrastructural changes and pathological changes in liver tissues, especially D group. The level of AST，ALT，r-GT and indirect bil

6、irubin in serum of groups D and E were obviously lower than group C (P0.05 or P0.01). At the same time, the content of total bilirubin, indirect bilirubin, Ca2+ of groups D and E were obviously lower than group C (P0.01), the same of group D was lower than group E (P0.01). ConclusionThe Dahuanglinxi

7、an capsules have significant effect of preventing gallstone formation due to its protective effect to liver injury which is induced by CCl4, and its association with regulations to many factors participating in the gallstone formation on multiple levels and ways.Key words： Chronic liver injury； 

8、; Cirrhosis of liver；  Dahuanglinxian Capsule；  Gallstones；  Ultrastructure本實驗利用CCl4皮下注射誘發(fā)家兔慢性肝損傷，在此基礎(chǔ)上觀察膽囊結(jié)石形成率，并用大黃靈仙膠囊組方煎劑進行灌胃，通過觀察結(jié)石形成率，肝臟細胞超微結(jié)構(gòu)的病 改變，測定實驗動物肝功能及膽汁成分并進行膽汁培養(yǎng)，以探討大黃靈仙膠囊對家兔慢性肝損傷膽結(jié)石模型的干預(yù)治療作用。 1  材料與儀器 1.1  材料、儀器健康家兔，體質(zhì)量2.53.0 kg，雌雄不拘，普通級，廣西中院實驗動物中心提供，合格證號20060

9、820。各生化試劑盒分別購于上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司和伊利康生物技術(shù)有限公司。奧地利Biocell2010酶標儀、日立H-500透射電鏡、BX-50-32001奧林巴斯光學顯微鏡、HPIAS-1000P病理文分析系統(tǒng)等分別由廣西醫(yī)科大學中心實驗室、廣西中醫(yī)學院一附院病理實驗室提供。1.2  藥品造模用藥：CCl4 分析純（將CCl4與花生油以12.5比例混合，37加熱使充分溶解，制成40CCl4溶液，）、膽固醇分析純，均為上海國藥集團產(chǎn)品。受試用藥：大黃靈仙膠囊1 (生大黃150 g，威靈仙300 g，芒硝100 g，金錢草300 g，枳殼120 g，雞內(nèi)金100 g，澤蘭150

10、 g，柴胡120 g，郁金120 g，磁石120 g，黃芪300 g，甘草50 g)，以上共計1 930 g生藥，由廣西中醫(yī)學院第一附屬 醫(yī)院 制劑室提取965 ml濃縮藥液，并無菌密封瓶裝（生藥量為2 g /ml）。 2  方法 2.1  動物分組及處理方法健康家兔46只，體質(zhì)量2.53.0 kg，雌雄不拘，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為5組，即正常對照組10只、慢性肝損傷組8只、肝硬化組8只、大黃靈仙膠囊大劑量組10只（用藥量相當于成人用量的3倍）、大黃靈仙膠囊小劑量組10只（用藥量相當于成人用量）。正常對照組普食喂養(yǎng)，每日灌服生理鹽水4 ml/kg；慢性肝損傷組采用“慢性肝

11、損傷兔動物模型”的建立2，普食喂養(yǎng)10周后，每日灌服生理鹽水4 ml/kg；肝硬化模型組造模方法2：家兔稱重后以2 ml/kg體質(zhì)量，將40CCl4溶液頸后皮下注射，每4天1次，以形成皮下丘狀突起為宜3。造模后第10周開始每日灌服生理鹽水8 ml/kg；大黃靈仙膠囊大、小劑量組第10周起每日灌服膽通膠囊提取液8 ml/kg，4 ml/kg。普食喂養(yǎng)。2.2  檢測指標及方法2.3  學處理所有數(shù)據(jù)采用SPSS14.0統(tǒng)計進行分析，計量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗；兩組間率的比較采用卡方檢驗；P0.05認為有統(tǒng)計學意義。 3  結(jié)果 3.1

12、60; 家兔膽囊結(jié)石發(fā)生情況結(jié)果見表1。表1  膽石發(fā)生情況（略）3.2  家兔肝臟病理改變光鏡下觀察，慢性肝損傷組（見圖1，2）：纖維組織增生，肝細胞水腫，局部氣球樣變，膽管增生，少許淋巴細胞浸潤，匯管纖維間隔稍增寬。肝硬化組（見圖34）：見假小葉形成，小葉內(nèi)中央靜脈缺如，細胞排列紊亂，多數(shù)細胞水腫，局部氣球樣變，小膽管增生、伴有淋巴細胞浸潤。大黃靈仙大劑量組（見圖56）：細胞排列規(guī)則，少數(shù)肝細胞水腫，小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，無炎性細胞浸潤，未見小膽管增生。大黃靈仙小劑量組（見圖78）：肝細胞排列規(guī)則，中度水腫，局部氣球樣變，匯管區(qū)纖維增寬，膽管增生，少量淋巴細胞浸

13、潤。         3.3  家兔電鏡肝細胞超微結(jié)構(gòu)的改變電鏡觀察：大黃靈仙小劑量 治療 組（見圖912）：正常結(jié)構(gòu)可見，大量滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、大量膠原纖維。線粒體固縮，嵴可見。大黃靈仙大劑量治療組(見圖1316)：正常結(jié)構(gòu)可見，糖原多，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)少，大量膠原纖維。核模較完整，線粒體多正常。3.4  家兔血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(r-GT)含量分析結(jié)果見表2。表2  血清AST，ALT，-GT含量比較（略）3.5 

14、; 血清總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、間接膽紅素（IBIL）含量分析結(jié)果見表3。表3  血清TBIL，LDBI，LIBIL含量比較（略）3.6  家兔血清總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、磷脂（PL）含量分析結(jié)果見表4。表4  血清TC、TBA、PL含量比較（略）3.7  家兔膽汁總膽固醇（TC）、磷脂（PL）、鈣離子(Ca2+)含量分析結(jié)果見表5。表5  膽汁TC、PL、Ca2+含量比較（略）3.8  家兔膽汁總膽汁酸（TBA）、總膽紅素（TBIL）、間接膽紅素（IBIL）的含量分析結(jié)果見表6。表6 

15、膽汁TBA、TBIL 、IBIL含量比較（略） 4  討論膽結(jié)石的發(fā)病機制至今仍未完全闡明，既往研究表明，膽結(jié)石的形成是多種因素綜合作用的結(jié)果。因此研究慢性肝損傷與膽石癥發(fā)生之間的關(guān)系有重要意義。膽結(jié)石伴有肝臟的學改變，尤其是膽管結(jié)石。可能的主要機制是膽道內(nèi)壓力升高，通過膽道炎癥、膽道梗阻等原因，使膽囊內(nèi)壓力升高，繼發(fā)膽道壓力升高，從而造成肝內(nèi)膽汁淤滯，導致肝細胞損害4,5。有學者認為膽囊結(jié)石病伴隨的肝臟損害，很可能是膽囊結(jié)石的成因，它可能先于膽囊結(jié)石而存在，而膽囊結(jié)石病的反復(fù)發(fā)作可能反過來加重原發(fā)性肝損害， Chignard N6進一步提出肝細胞合成分泌膽汁機制受損有可能是膽囊結(jié)石

16、患者所存在的一系列肝膽道病理狀態(tài)的啟動扳機。而肝臟的損害首先就表現(xiàn)在肝細胞的超微結(jié)構(gòu)的改變上，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的減少和代償性增生表明催化膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的7羥化酶數(shù)量和活力有可能受到影響，以致于膽汁酸合成減少，從而造成膽汁中膽固醇與膽汁酸比例增高，增加了成石的機率7。本次實驗發(fā)現(xiàn)各模型組家兔的肝臟超微結(jié)構(gòu)均伴有不同程度的改變，存在有不同程度的膜破裂，質(zhì)漿中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體水腫、變性，線粒體壞死，雙層模結(jié)構(gòu)消失，部分甚至有空泡樣變，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分斷裂，顆粒減少，溶酶體增加，肝細胞邊界模糊不清，細胞質(zhì) 電子 密度減少等各種相應(yīng)結(jié)構(gòu)改變。肝硬化組表現(xiàn)尤其明顯，AST較慢性肝損傷

17、組有著性差異（P0.01）；-GT較慢性肝損傷組有明顯差異（P0.05）。本實驗結(jié)果顯示，肝硬化家兔膽囊結(jié)石發(fā)生率為83.3，慢性肝損傷組膽囊結(jié)石發(fā)生率為63，而正常對照組為0。前兩者與正常對照組比較均有顯著差異（P0.05，P0.01）。肝硬化組與慢性肝損組比較，膽囊結(jié)石陽性檢出率沒有明顯差異，但肝硬化組膽囊膽汁可見有形成分較慢性肝損組明顯居多，且后者膽汁中以膽泥為主。目前已有實驗證明膽泥形成是膽石形成的必經(jīng)階段8，肝硬化的病程越長，合并膽囊結(jié)石的危險性越大，本次實驗結(jié)果更進一步證實了這一結(jié)論。本實驗光鏡、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：慢性肝損傷組與肝硬化組動物中形成的結(jié)石為棕綠色和黃褐色，膽石中存在較多的

18、是膽色素顆粒而僅有少量膽固醇結(jié)晶，不同于高膽固醇膳食組，這一結(jié)論提示：在慢性肝損傷狀態(tài)下膽石的成因機制中，膽色素類結(jié)石是其形成機制之一。實驗中發(fā)現(xiàn)慢性肝損傷組家兔膽囊?guī)缀蹙鶠獒樇鈽幽懮常S著造模時間的延長，肝硬化組家兔膽囊中出現(xiàn)1 mm左右大小的結(jié)石，光鏡觀察不同于高膽固醇膳食組的膽固醇結(jié)晶。結(jié)合對其膽汁成分的分析，我們發(fā)現(xiàn)膽固醇組膽汁中的膽固醇含量顯著高于正常對照組（P0.05），慢性肝損傷組與肝損傷膽固醇組與正常組沒有明顯差異，而肝硬化組膽固醇含量低于正常組。肝硬化組膽汁膽紅素高于其他各組（P0.05）。此結(jié)果提示：飲食中的膽固醇過量，可導致膽汁中形成膽固醇過飽和，隨后膽固醇結(jié)晶，結(jié)晶析

19、出逐漸形成結(jié)石。中認為肝膽互為表里，肝主疏泄，膽汁的排泄有賴于肝的疏泄功能，肝的疏泄功能直接控制和調(diào)節(jié)膽汁的排泄。肝失疏泄主要表現(xiàn)為氣機不暢、氣機郁結(jié)之病理變化，也稱“肝氣郁結(jié)”。情志不暢，飲食不潔、蟲積或痰濁瘀血內(nèi)結(jié)于肝膽等原因均可引起肝膽疏泄失常，導致肝膽氣郁，郁久化熱，濕濁內(nèi)生，濕熱內(nèi)盛，蘊結(jié)肝膽，濕熱熏蒸，煎熬膽汁而導致膽石。此病機正同西醫(yī)認為的“肝臟功能障礙，特別是肝細胞功能障礙而致病理性膽汁分泌和排膽功能障礙是膽結(jié)石形成的基礎(chǔ)” 之理論相一致。同時中醫(yī)認為膽汁排泄不暢，亦會影響肝之疏泄，即所謂的“膽病及肝”，這與西醫(yī)的“肝細胞功能損害與膽結(jié)石可能是互為因果”理論相一致。大黃靈仙膠囊

20、為治療膽石病的有效中藥制劑，方中大黃、芒硝攻下導滯、利膽排石；金錢草、郁金、柴胡、枳殼、澤蘭相伍，既有清熱利濕之功，又有理氣祛痰之效；雞內(nèi)金、金錢草、威靈仙為排石佳品；威靈仙、磁石為用藥；黃芪、甘草意在益氣補虛，保護胃氣。諸藥合用共奏疏肝利膽，攻下排石的功效1。其預(yù)防色素性結(jié)石的作用與其在保護肝細胞和膽囊組織，維持膽汁有形成分代謝的正?；约耙志咕榷嘀刈饔糜嘘P(guān)9。膽汁中膽汁酸含量降低，未結(jié)合膽紅素含量升高，可能是其形成結(jié)石的主要原因10。本次實驗發(fā)現(xiàn)，大黃靈仙膠囊對肝損傷家兔膽汁中的膽汁酸、鈣離子和膽固醇水平有影響，可以明顯增加肝損傷家兔膽汁中膽汁酸的含量，降低鈣離子的含量且大劑量組較小劑量組增加膽汁酸的作用為優(yōu)；中藥大黃靈仙膠囊對四氯化碳所致的肝損傷家兔的肝臟的損傷有一定的預(yù)防作用和對在肝損傷基礎(chǔ)上誘發(fā)的膽囊結(jié)石有明顯的干預(yù)作用。慢性肝損傷在是上較為常見的肝