病原菌感染宿主的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

1、病原菌感染宿主的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展    【關(guān)鍵詞】  感染   病原菌與宿主的相互作用，是構(gòu)成感染的基本因素?，F(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展推動病原菌與宿主相互作用研究進(jìn)入到了分子水平。應(yīng)用基因芯片轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)，可以對病原菌入侵宿主以及宿主的防御抵抗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。從病原菌全基因組水平以及感染宿主的基因水平闡述病原菌與宿主之間的相互關(guān)系。闡明病原菌入侵以及宿主抵抗病原菌的分子機(jī)制，本文將對病原菌在感染宿主過程中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。    1  病原菌與宿主的相互作用 

2、   細(xì)菌性感染的發(fā)生和發(fā)展是病原菌與宿主相互作用的結(jié)果。感染的本質(zhì)是病原性細(xì)菌為達(dá)到在宿主內(nèi)生存和繁殖的目的，與宿主的各種抵御因素發(fā)生相互作用。在此期間，既有病原菌為逃避宿主防御機(jī)制而進(jìn)行的適應(yīng)，也有宿主為清除病原菌而調(diào)動防御體系的努力。從細(xì)菌的角度講，由原寄生地侵襲到宿主時，環(huán)境中各種營養(yǎng)物質(zhì)的含量、種類、溫度、滲透壓與酸堿度等因素的改變，以及宿主對細(xì)菌的抵抗，必然對細(xì)菌的生存施加巨大壓力。為了生存，細(xì)菌能夠快速敏感地監(jiān)測環(huán)境中各種因素的變化，迅速地調(diào)節(jié)本身的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)其生理、生命行為，達(dá)到適應(yīng)新的環(huán)境，在宿主體內(nèi)寄生，感染宿主目的。對于宿主來說，真核生物有著極其完善的

3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，可以感知病原菌的侵入，啟動嚴(yán)密的防御系統(tǒng)來抵抗病原菌的入侵。有些宿主還可以分泌一些殺菌素樣的物質(zhì)，導(dǎo)致病原菌不能在其體內(nèi)生存，維持自身的正常生理狀態(tài)。病原菌與宿主相互作用研究一直是控制感染性疾病發(fā)生的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。    2  細(xì)菌的基因芯片轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究    隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展與成熟，使得大量微生物基因組的序列測定完成。標(biāo)志著基因組學(xué)的研究由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)進(jìn)入了功能基因組學(xué)時期。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是功能基因組學(xué)研究的一個重要手段。Velculescu和Kinzler等人于1997年首先提出轉(zhuǎn)錄組概念1。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是

4、從一個細(xì)胞中的基因組全部mRNA水平研究基因表達(dá)情況。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究作為一種宏觀的整體論方法改變了以往選定單個基因或少數(shù)幾個基因零打碎敲式的研究模式2，將基因組學(xué)研究帶入了一個全新的高速發(fā)展時代。    基因芯片轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是應(yīng)用全基因組芯片對不同條件下細(xì)菌的mRNA進(jìn)行平行分析，可以獲得細(xì)菌在不同條件下所發(fā)生的差異變化基因，從基因水平上揭示基因表達(dá)的差異。該技術(shù)的反應(yīng)原理是通過對不同來源的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而后分別用不同顏色的熒光素標(biāo)記成探針,探針混合后與芯片上的基因進(jìn)行雜交,再通過掃描儀掃描，獲得兩份樣品中RNA的相對豐度，結(jié)合已有生物信息學(xué)資源對數(shù)據(jù)進(jìn)行生物

5、學(xué)解讀。    基因芯片技術(shù)的發(fā)展，為研究病原菌與宿主相互作用提供了全新的研究機(jī)會。通過基因芯片轉(zhuǎn)錄譜分析細(xì)菌感染宿主表達(dá)譜的差異，可以在全基因組范圍獲得細(xì)菌為適應(yīng)在宿主體內(nèi)生長而表現(xiàn)的基因表達(dá)差異，通過對差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析可以篩選到病原體在體內(nèi)存活必需表達(dá)的基因，預(yù)測與致病性密切相關(guān)的毒力基因。從而有助于進(jìn)一步闡明致病菌的致病機(jī)制。芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)為大規(guī)模發(fā)現(xiàn)及鑒定病原菌致病基因提供了一個快速、有效的平臺。    3  病原菌與宿主相互作用體外轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展    應(yīng)用轉(zhuǎn)錄譜芯片進(jìn)行

6、病原菌與宿主相互作用研究經(jīng)歷了體外與體內(nèi)兩個階段。首先是應(yīng)用病原菌與感染宿主細(xì)胞在體外進(jìn)行相互作用，通過體外細(xì)胞來模擬病原菌感染宿主的微環(huán)境，獲得病原菌與宿主細(xì)胞之間的相互作用規(guī)律，從而間接反應(yīng)病原菌入侵宿主的轉(zhuǎn)錄特征與分子作用機(jī)理。    目前對多種病原菌與多種體外細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞接觸以及侵染多形核白細(xì)胞（PMNs）單核巨噬細(xì)胞過程中基因表達(dá)變化進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。通過以上研究，發(fā)現(xiàn)了大量微生物的毒力相關(guān)基因，存活必須基因，以及在感染過程中細(xì)菌重要的酶類和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因等。闡述了病原菌在入侵宿主過程中的相關(guān)分子機(jī)理，為進(jìn)一步控制感染的發(fā)生奠定了理

7、論基礎(chǔ)。    世界人口的一半以上感染有幽門螺桿菌。其中只有20%的感染者會表現(xiàn)出臨床癥狀。其原因可能在于感染不同類型的幽門螺桿菌以及感染宿主的不同反應(yīng)。在對幽門螺桿菌致病機(jī)理的研究中，芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)被廣泛應(yīng)用。這些研究當(dāng)中包括大量的幽門螺桿菌與胃上皮細(xì)胞共同作用后的轉(zhuǎn)錄譜研究36。例如Kim等通過對幽門螺桿菌與胃癌細(xì)胞AGS相互作用的研究結(jié)果表明7，在幽門螺桿菌與AGS細(xì)胞相互作用后，幽門螺桿菌毒力島相關(guān)基因，動力相關(guān)基因，外膜蛋白相關(guān)基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。而在轉(zhuǎn)錄下調(diào)的基因當(dāng)中包括壓力反應(yīng)蛋白基因與過氧化物分解相關(guān)基因。研究結(jié)果表明上述基因在幽門螺桿菌粘附

8、胃上皮細(xì)胞中發(fā)揮了重要作用，與其致病能力緊密相關(guān)。    2007年10月薛建江等：病原菌感染宿主的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展第5期2007年10月河北北方學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版）第5期細(xì)菌性腦膜炎是兒童最常見的死亡病因，腦膜炎奈瑟氏菌為腦膜炎的病原菌。Dietrich等對該細(xì)菌在侵入機(jī)體中所遇到的兩個主要階段進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜的研究8以獲得該病原菌在侵入機(jī)體以及適應(yīng)機(jī)體的改變。通過對腦膜炎奈瑟氏菌與上皮細(xì)胞（Hela細(xì)胞）與內(nèi)皮細(xì)胞（HBMEC人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞）相互作用而獲得該細(xì)菌和兩種細(xì)胞相互作用的轉(zhuǎn)錄譜，獲得了該細(xì)菌在感染不同階段所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄水平的不同變化，揭示了腦膜炎奈瑟菌在感

9、染不同階段的分子致病機(jī)理。Schubert等人也對該菌進(jìn)行了類似的轉(zhuǎn)錄譜研究9，表明在腦膜炎奈瑟菌與HBMEC相互作用中，該菌的莢膜起到了極為重要的作用。更進(jìn)一步揭示了腦膜炎奈瑟菌與宿主細(xì)胞在分子水平的相互作用。    4  病原菌與宿主相互作用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展    在病原菌與感染宿主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜研究中，困擾所有微生物學(xué)工作者的一個重要問題就是存在一些技術(shù)上的難題，這些技術(shù)上的難題限制了體內(nèi)進(jìn)行病原與宿主相互作用的轉(zhuǎn)錄譜研究。這些技術(shù)上的難題主要包括原核生物mRNA的穩(wěn)定性問題，宿主細(xì)胞RNA的干擾，以及宿主細(xì)胞與感染細(xì)

10、胞的難以分離?；蛐酒芯啃枰罅康膍RNA靶分子，大多數(shù)研究所用的mRNA是從大量細(xì)胞中提取出來的，然而，感染宿主組織中很難提供如此大量的感染細(xì)菌mRNA來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄譜的研究。    對于上述問題的存在，可以通過提高芯片檢測的靈敏度，開發(fā)可重復(fù)有效擴(kuò)增RNA靶分子的技術(shù)而使問題得到解決。目前有兩種方法在擴(kuò)增RNA靶分子方面顯示出一定優(yōu)勢。其一是利用PCR技術(shù)建立單細(xì)胞cDNA文庫，這種方法能夠有效且可重復(fù)的擴(kuò)增mRNA分子，但是往往不能保證所得到的DNA文庫中的拷貝數(shù)與其在細(xì)胞中的拷貝數(shù)一致。其應(yīng)用需通過應(yīng)用統(tǒng)計方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理10。另一種方法是應(yīng)用DNA

11、合成和模板指導(dǎo)下的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來完成的RNA體外線性擴(kuò)增11。通過體外擴(kuò)增RNA可以將微量的mRNA在體外進(jìn)行放大，從而可以滿足芯片檢測需要。與構(gòu)建文庫的方法相比，這種擴(kuò)增方法更具線性，更能反應(yīng)真實(shí)情況。該研究方法的出現(xiàn)，可以為解決在研究病原與宿主相互作用的轉(zhuǎn)錄譜研究中RNA量的問題。相信隨著該項(xiàng)技術(shù)的逐步完善，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的研究將會更為廣泛的開展。    Lathem等人應(yīng)用RNA線性擴(kuò)增技術(shù)對造成小鼠實(shí)驗(yàn)性肺鼠疫中感染48h的鼠疫菌進(jìn)行了擴(kuò)增12。該研究使用裂解液成功的將鼠疫細(xì)菌與肺組織細(xì)胞進(jìn)行了分離，對分離到的RNA進(jìn)行了擴(kuò)增，進(jìn)行了鼠疫菌造成肺鼠疫轉(zhuǎn)錄譜研究

12、。研究結(jié)果表明，與鼠疫菌致病相關(guān)的主要毒力因子在體內(nèi)感染多數(shù)表現(xiàn)為高表達(dá)。例如T3SS中的基因，鐵攝入以及鐵貯存的相關(guān)基因，通過芯片轉(zhuǎn)錄譜研究對鼠疫菌引起宿主感染的分子致病機(jī)理進(jìn)行了闡述。    霍亂是以嚴(yán)重腹瀉為主要癥狀的感染性疾病，其病原菌為霍亂弧菌。已經(jīng)完成該菌的全基因組序列表明，其全基因組包含大小兩個片段。大片段編碼了霍亂弧菌大部分的基因，而小片段的基因功能則很少了解。Xu等應(yīng)用芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)對分布于不同片段的基因進(jìn)行了感染家兔體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的研究13，一方面，通過研究了解該細(xì)菌在感染宿主體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄情況，另一方面的目的是揭示小片段的基因組在感染過程中的功能

13、。研究者通過創(chuàng)造性的將家兔小腸進(jìn)行結(jié)扎，從而形成小腸結(jié)扎環(huán)模型，將霍亂弧菌注入結(jié)扎環(huán)內(nèi)，感染一定時間后將細(xì)菌從結(jié)扎環(huán)內(nèi)進(jìn)行收集，收集RNA后與體外營養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)菌進(jìn)行比較，從而獲得了霍亂弧菌體內(nèi)感染的轉(zhuǎn)錄譜。研究結(jié)果表明，在發(fā)生轉(zhuǎn)錄明顯改變的基因中大部分為大片段染色體基因。揭示了在感染家兔小腸體內(nèi)該細(xì)菌的一些高轉(zhuǎn)錄基因包括與動力化學(xué)趨向性相關(guān)的一些基因，以及與腸內(nèi)定值相關(guān)的一些基因以及與毒素產(chǎn)生相關(guān)的基因。對霍亂弧菌的分子致病機(jī)理進(jìn)行了闡述。    空腸彎曲菌是引起腹瀉的主要病原菌。該菌在小腸內(nèi)成功的粘附與定植是構(gòu)成其致病力的關(guān)鍵因素。Stintzi等人同樣應(yīng)

14、用小腸結(jié)扎環(huán)的方法對空腸彎曲菌進(jìn)行了感染新西蘭白兔小腸的研究14。通過對該菌在小腸內(nèi)生存所進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄譜研究，獲得了大量與其在腸內(nèi)生存相關(guān)的基因，對其致病機(jī)理進(jìn)行了分子水平的研究。    Snyder等人應(yīng)用芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)對引起泌尿感染的致病性大腸埃希氏菌進(jìn)行了體內(nèi)轉(zhuǎn)錄譜的研究15。該研究將從感染小鼠的尿液中直接提取細(xì)菌RNA，得到了該細(xì)菌在感染宿主體內(nèi)的多個毒力與代謝因子。在與泌尿系感染相關(guān)的基因當(dāng)中，有這樣一些基因高表達(dá)。菌毛基因相關(guān)的莢膜形成，微生物素分泌，鐵攝入相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，表明這些基因與大腸桿菌的致病性密切相關(guān)。  

15、0; 在對感染細(xì)菌與宿主相互作用研究中，不同的研究者應(yīng)用了不同的方法進(jìn)行了研究。例如通過對無菌部位的液體標(biāo)本直接進(jìn)行分離來獲得研究所需要的細(xì)菌量，Orihuela對感染小鼠血液中細(xì)菌采用離心的方法進(jìn)行分離16，通過差速離心的方法將感染小鼠血液中的肺炎球菌與血細(xì)胞進(jìn)行了分離，進(jìn)行了肺炎球菌感染小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄譜研究，獲得了該細(xì)菌感染體內(nèi)的特征性轉(zhuǎn)錄譜，對其致病機(jī)理進(jìn)行了研究。Talaat等則應(yīng)用全基因組引物GDP對感染組織內(nèi)未進(jìn)行細(xì)菌與細(xì)胞分離的結(jié)核分枝桿菌直接進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄17，獲得了感染體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄譜，對結(jié)核分枝桿菌的分子致病機(jī)理進(jìn)行了研究。Merrell等應(yīng)用直接分離的方法對霍亂病人的

16、米泔樣糞便中的霍亂弧菌進(jìn)行了分離并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜研究18。Graham等應(yīng)用全基因組芯片對引起化膿性感染的A族鏈球菌M1株進(jìn)行了感染小鼠上皮組織的轉(zhuǎn)錄譜研究19，解釋了在形成化膿性感染過程中參與的主要基因功能類群，包括毒力基因、氧化壓力基因、氨基酸利用、二元調(diào)控系統(tǒng)等基因在皮膚軟組織感染中的作用。對A族鏈球菌引起的化膿性感染的分子機(jī)理進(jìn)行了闡述。Roos等人則通過收集患者尿液中大腸埃希菌83792株直接與體外培養(yǎng)的相同細(xì)菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄譜研究20。指出在該菌株致病過程中NO代謝相關(guān)基因具有非常重要的意義。同樣是對尿液中的大腸埃希菌83792株，Hancock等人則進(jìn)行了該菌在體內(nèi)與生物膜形成的相關(guān)分

17、子機(jī)制研究21，揭示了該菌在形成致病中生物膜所起的作用以及與生物膜形成的相關(guān)基因。更進(jìn)一步的闡述了大腸埃希菌83792株導(dǎo)致泌尿系感染的分子致病機(jī)理。    5  結(jié)論    基因芯片轉(zhuǎn)錄譜技術(shù)在研究細(xì)菌與宿主相互作用中展示了其應(yīng)用優(yōu)勢,極大地推動了相關(guān)研究的發(fā)展。結(jié)合原核生物基因組序列資料，通過芯片轉(zhuǎn)錄譜研究可以在基因水平描繪細(xì)菌如何適應(yīng)宿主環(huán)境，以及為適應(yīng)宿主環(huán)境所作出的基因改變。揭示細(xì)菌與環(huán)境相互作用的代謝途徑、細(xì)菌的致病毒力因子以及病原菌的分子致病機(jī)制。從而為進(jìn)一步控制細(xì)菌性感染的發(fā)生奠定理論基礎(chǔ)。【參考文獻(xiàn)】

18、60; 1 Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcriptomeJ. Cell, 1997, 88:243?2512 Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJ. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissuesJ. Science, 1993, 259:686?6883 Bach S, Makristathis A, Rotter M, e

19、t al. Gene expression profiling in AGS cells stimulated with Helicobacter pylori isogenic strains (cagA positive or cagA negative)J. Infect Immun, 2002, 70:988?9924 Cox JM, Clayton CL, Tomita T, et al. cDNA array analysis of cag pathogenicity island?associated Helicobacter pylori epithelial cell res

20、ponse genesJ. Infect Immun, 2001, 69:6970?69805 Maeda S, Otsuka M, Hirata Y, et al. cDNA microarray analysis of Helicobacter pylori?mediated alteration of gene expression in gastric cancer cellsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284:443?4496 Sepulveda AR, Tao H, Carloni E, et al. Screening of gene

21、 expression profiles in gastric epithelial cells induced by Helicobacter pylori using microarray analysisJ. Aliment Pharmacol Ther, 2002, 16(2):145?1577 Kim N, Marcus EA, Wen Y, et al. Genes of Helicobacter pylori regulated by attachment to AGS cellsJ. Infect Immun, 72:2358?23688 Dietrich G, Kurz S,

22、 Hubner C, et al. Transcriptome analysis of Neisseria meningitidis during infectionJ. J Bacteriol, 2003, 185:155?1649 Schubert?Unkmeir A, Sokolova O, Panzner U, et al. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidisJ. Infect Immun, 2007, 75:899?91410Han

23、dfield M. Levesque RC: Strategies for isolation of in vivo expressed genes from bacteriaJ. FEMS Microbiol Rev, 1999, 23:69?9111Zhao H, Hastie T, Whitfield ML, et al. Optimization and evaluation of T7 based RNA linear amplification protocols for cDNA microarray analysisJ. BMC Genomics, 2002, 3:3112La

24、them WW, Crosby SD, Miller VL, et al. Progression of primary pneumonic plague: a mouse model of infection, pathology, and bacterial transcriptional activityJ. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102:17786?1779113Xu Q, Dziejman M, Mekalanos JJ. Determination of the transcriptome of Vibrio cholerae during

25、 intraintestinal growth and midexponential phase in vitroJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100:1286?129114Stintzi A, Marlow D, Palyada K, et al.Use of genome?wide expression profiling and mutagenesis to study the intestinal lifestyle of Campylobacter jejuniJ. Infect Immun, 2005, 73:1797?181015Snyder JA, Haugen BJ, Buckles EL, et al. Transcriptome of uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infectionJ. Infect Immun, 2004, 72:6373?638116Orihuela CJ, Radin JN, Sublett JE, et al. Microarray analysis of pneumococcal gene expres