2012CB517700-G慢性腎臟病進(jìn)展的機(jī)制研究侯凡凡_修正版

1、修正版依托部門:廣東省科技廳項目名稱:慢性腎臟病進(jìn)展的機(jī)制研究首席科學(xué)家:侯凡凡南方醫(yī)科大學(xué)起止年限:2012.1-2016.8修正版、關(guān)鍵科學(xué)問題及研究內(nèi)容1. 進(jìn)展性腎臟病和腎纖維化的遺傳因素及其致病機(jī)制利用已建立的人群樣本，對中國常見慢性腎臟病進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）；利用已建立的患者樣本和家系樣本，研究腎小球足細(xì)胞骨架蛋白基因突 變/多態(tài)性及其他基因突變與各種慢性腎臟病及其進(jìn)展的關(guān)聯(lián)，并針對易感位點(diǎn)進(jìn)行功能研究；利用已建立的中國患者群樣本，針對天然免疫補(bǔ)體系統(tǒng)和獲得性免疫淋 巴細(xì)胞激活分子，探討遺傳易感基因與免疫性腎臟病發(fā)生發(fā)展的關(guān)聯(lián)；研究營養(yǎng)因 素對基因組甲基化的影響及其在慢

2、性腎臟病進(jìn)展中的作用，以揭示中國人進(jìn)展性腎 臟病的高危人群和危險因素。2. 免疫性炎癥對慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的促進(jìn)作用及其機(jī)制禾用已建立的中國患者群樣本，以狼瘡性腎炎、ANCA相關(guān)性腎炎、抗 GBM腎病為切入點(diǎn)，探索腎組織免疫炎癥過程中關(guān)鍵的補(bǔ)體活化途徑和沉積機(jī)制；研究 補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白異常對補(bǔ)體系統(tǒng)功能的影響和導(dǎo)致免疫性炎癥的機(jī)制；研究已確定的 致病自身抗體（如 ANCA和抗GBM抗體）所針對的關(guān)鍵抗原決定簇，并尋找與抗 原決定簇擴(kuò)散有關(guān)的同源性蛋白或病原微生物，以揭示免疫性炎癥在慢性腎臟病進(jìn) 展中的促進(jìn)作用及其分子基礎(chǔ)。3. 代謝性炎癥對慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的促進(jìn)作用及其機(jī)制借助細(xì)胞模

3、型和模式動物，系統(tǒng)研究炎癥對腎臟細(xì)胞膽固醇重分布、腎臟泡沫 細(xì)胞形成和組織損傷的機(jī)制；研究蛋白質(zhì)氧化損傷對腎細(xì)胞的病理生物學(xué)活性、作 用機(jī)制及對腎臟炎癥和纖維化的影響；利用已建立的樣本人群，研究葉酸缺乏和 Heys血癥在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用及其分子機(jī)制。以闡明脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)代謝 和氨基酸代謝紊亂在代謝性炎癥及腎臟病變進(jìn)展中的作用和分子基礎(chǔ)。4. 腎臟內(nèi)分泌激素對腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控和機(jī)制利用髓樣細(xì)胞特異性 MR基因敲除小鼠，闡明髓樣細(xì)胞 MR在腎纖維化中的調(diào) 控作用及其機(jī)制；利用 VDR基因敲除小鼠，明確活性維生素 D對足細(xì)胞形態(tài)、功 能以及足細(xì)胞中間絲蛋白 Nest in表達(dá)的調(diào)

4、控作用；建立間質(zhì)細(xì)胞特異性P GIS基因敲除小鼠，揭示 COX2-PGIS-PGI2通路在腎間質(zhì)纖維化中的調(diào)控作用；利用 SIRT1 抑制劑分析 SIRT1對足細(xì)胞、髓樣細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞由VitD/VDR、醛固酮/MR、COX2-PGIS介導(dǎo)的下游生物學(xué)作用的影響，明確SIRT1是否通過MR、VDR參與腎臟炎癥和纖維化的調(diào)控。5. 腎纖維化的細(xì)胞內(nèi)信號分子及基因調(diào)控利用轉(zhuǎn)基因、基因敲除等技術(shù)系統(tǒng)，探討Wnt/ P -catenin信號通路在腎纖維化中的作用及其機(jī)制，利用化學(xué)文庫篩選并鑒定特異性抑制Wnt/ P -catenin信號的小分子抑制物，為研發(fā)干預(yù)腎纖維化的新藥提供依據(jù)；尋找并鑒定參與調(diào)

5、控腎纖維化 的、Smad3依賴的miRNAs并闡明其作用機(jī)制，探索針對關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因干預(yù)腎纖維 化的新途徑。6. 預(yù)警或評估腎纖維化的生物標(biāo)志物或靶標(biāo)在既往對慢性腎臟病病理生理和DNA芯片研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合上述研究發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物或關(guān)鍵靶標(biāo)，改進(jìn) PCR芯片構(gòu)建技術(shù)，確立最優(yōu)化的檢測方法；構(gòu)建 基于腎纖維化病理生理機(jī)制的靶向基因芯片；通過比較分析不同分期慢性腎臟病患 者及健康人尿液mRNA，確立進(jìn)展性腎臟病的生物標(biāo)志物。應(yīng)用靶向泛素化降解蛋白質(zhì)技術(shù)構(gòu)建與Smad3特異結(jié)合的Protacs,探討其防治 腎纖維化的作用。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)發(fā)現(xiàn)中國人群與進(jìn)展性腎臟病相關(guān)的易感基因及表觀遺傳因素

6、；揭示免疫性和 代謝性炎癥對慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制；確定腎臟內(nèi)分 泌激素對腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控作用及其機(jī)制；闡明腎纖維化的細(xì)胞內(nèi)關(guān) 鍵信號分子及基因調(diào)控；篩選預(yù)警或評估腎纖維化的生物標(biāo)志物。獲得一批原創(chuàng)性 成果；找到新的防止慢性腎臟病進(jìn)展的干預(yù)途徑；在腎臟病研究領(lǐng)域，培養(yǎng)一批臨 床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合、適應(yīng)一轉(zhuǎn)化性研究11的新型復(fù)合型人才。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 完成IgA腎病的GWAS分析；闡明腎小球足細(xì)胞骨架蛋白基因突變 /多態(tài)性及其他基因突變與各種慢性腎臟病進(jìn)展的關(guān)聯(lián)和易感位點(diǎn)的致病作用；發(fā)現(xiàn)中國人與進(jìn) 展性腎臟病相關(guān)的新易感基因；揭示天然免疫補(bǔ)體系統(tǒng)和獲得性免

7、疫淋巴細(xì)胞激活 分子的遺傳變異與免疫性腎臟病進(jìn)展的關(guān)聯(lián)；闡明Heys血癥對基因組甲基化的影響及其在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用，為中國人慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的預(yù)警和風(fēng)險評估提供理論依據(jù)。2. 發(fā)現(xiàn)與我國常見慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的主要免疫學(xué)因素；明確腎臟免疫炎癥過程中補(bǔ)體系統(tǒng)活化的關(guān)鍵途徑及其沉積機(jī)制；揭示補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白異常對補(bǔ)體系統(tǒng) 功能的影響和導(dǎo)致免疫性炎癥的機(jī)制；找到主要致病自身抗體的關(guān)鍵抗原決定簇和與抗原決定簇擴(kuò)散有關(guān)的同源性蛋白或病原微生物，為干預(yù)免疫性炎癥、防止慢性 腎臟病進(jìn)展和腎纖維化提供理論依據(jù)。3. 深入認(rèn)識代謝性炎癥在中國人慢性腎臟病發(fā)生發(fā)展中的作用。揭示炎癥對腎固有細(xì)胞膽固醇

8、重分布、腎臟泡沫細(xì)胞形成和組織損傷的機(jī)制；闡明蛋白質(zhì)氧化損傷導(dǎo)致腎臟炎癥和纖維化的機(jī)制；明確葉酸缺乏和Heys血癥在中國人慢性腎臟病進(jìn)展中 的作用及其機(jī)制。為干預(yù)代謝性炎癥、防止慢性腎臟疾病進(jìn)展和腎纖維化提供理論 依據(jù)。4. 闡明髓樣細(xì)胞MR在腎臟纖維化中的作用及其機(jī)制；明確活性維生素D對足細(xì)胞 功能及中間絲蛋白Nestin表達(dá)的調(diào)控及其機(jī)制；揭示C0X2-PGIS- PGI2通路在腎間 質(zhì)纖維化中的作用；明確 SIRT1是否通過MR、VDR參與腎纖維化。闡明腎臟神經(jīng) 激素對損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控及其機(jī)制。Wnt/ P -cateninWnt/ p -catenin5. 闡明進(jìn)展性腎臟病的共

9、同致病途徑一腎纖維化的分子機(jī)制。探討信號通路在腎纖維化中的作用及其分子基礎(chǔ)，篩選并鑒定特異性抑制 信號的小分子抑制物，為研發(fā)干預(yù)腎纖維化的新藥提供依據(jù)；尋找并鑒定參與調(diào)控 腎纖維化的、Smad3依賴的miRNAs并闡明其作用機(jī)制，為干預(yù)進(jìn)行性腎纖維化提 供理論依據(jù)。6. 根據(jù)腎纖維化機(jī)制和病理生理研究的發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建靶向性基因微陣列，通過高通量 分析尿液中mRNA，發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物，為最終實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、動態(tài)監(jiān)測腎纖維化進(jìn) 程奠定基礎(chǔ)。7. 在國際學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文 60篇以上，并在本領(lǐng)域排名第一和第二的學(xué)術(shù)期刊發(fā) 表高水平論文若干篇；申請國內(nèi)外發(fā)明專利若干項；開發(fā)相關(guān)的試劑盒，用于進(jìn)展 性腎臟病的早期

10、診斷和防治。8. 為國家制定慢性腎臟病防治的衛(wèi)生決策提供科學(xué)依據(jù)。9. 建立一支臨床和基礎(chǔ)緊密結(jié)合、多學(xué)科交叉的腎臟病研究隊伍；推進(jìn)臨床和基礎(chǔ) 研究成果的雙向轉(zhuǎn)化。三、研究方案（一）總體學(xué)術(shù)思路慢性腎臟病進(jìn)展所致的 ESR是危害人類健康、消耗大量衛(wèi)生資源的重大慢性病。慢性腎 臟病進(jìn)展及其進(jìn)展速度既與遺傳基因（內(nèi)因）有關(guān)，又與環(huán)境和營養(yǎng)等促進(jìn)因素（外因）相 關(guān)，腎臟病變進(jìn)展至 ESRI與個體對腎臟損傷的修復(fù)反應(yīng)（內(nèi)因+外因）密切相關(guān)。中國人遺傳背景和環(huán)境因素都與國外人群存在差異，慢性腎臟病的原發(fā)疾病譜也與西方國家明顯不同。免疫和代謝性炎癥是中國人進(jìn)展性慢性腎臟病的主要始動和促進(jìn)因素，由此而導(dǎo)致的

11、腎臟疤痕化重塑 （纖維化）是各種慢性腎臟病進(jìn)展至 ESRD的共同致病途徑。因此, 本項目的總體學(xué)術(shù)思路是： 針對中國人特點(diǎn)和常見慢性腎臟病，利用大樣本社區(qū)隨訪和慢性腎臟病人群樣本及臨床資源，揭示中國人慢性腎臟病向ESRD進(jìn)展的主要遺傳易感和促進(jìn)因素及其交互作用；以腎纖維化為主線，通過模式動物、細(xì)胞分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì) 組學(xué)、腎臟病理生理學(xué)等研究手段，揭示腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控機(jī)制，明確腎臟進(jìn)行性纖維化的細(xì)胞內(nèi)信號分子和基因調(diào)控；發(fā)現(xiàn)預(yù)警或評估慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化風(fēng)險為防治慢性腎臟病和制定的新生物標(biāo)志物，找到防止或延緩慢性腎臟病進(jìn)展的新干預(yù)靶標(biāo)， 相關(guān)衛(wèi)生決策提供科學(xué)依據(jù)。（二

12、）主要技術(shù)路線1. 遺傳因素在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用及其機(jī)制一期研究采用 lllumina s n=1,500 ）進(jìn)行全基因組 SNP1） 對中國人最常見的慢性腎臟病進(jìn)行全基因組SNP僉測以中國人最常見的原發(fā)性腎小球疾病-IgA腎病為研究對象。Human610芯片對IgA腎病患者（n=1,500 ）和正常對照人群（檢測，找出差異表達(dá)的SNP位點(diǎn)；二期驗(yàn)證選取前200個差異表達(dá)的SNPs位點(diǎn)，在另一患者群中（患者群 n=2,000 ;對照人群n=2,000 ）采用Sequenom s iPLEX assay 進(jìn)行基因分 型，驗(yàn)證差異表達(dá) SNP位點(diǎn)；結(jié)合患者的臨床資料和實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)，觀察差異表

13、達(dá)的SNP與臨床表型及臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)性。按上述方法對中國人常見的其他慢性腎臟病進(jìn)行全基因組SNP檢測。采用PCR擴(kuò)增外顯子-直接測序法進(jìn)行TaqMan探針法分析新發(fā)現(xiàn)的足細(xì)胞2）針對腎臟關(guān)鍵結(jié)構(gòu)損傷的遺傳關(guān)聯(lián)分析利用已有的激素耐藥的腎病綜合癥及其家系樣本， ACTN 4基因檢測，分析基因突變與表型的相關(guān)性；采用骨架蛋白（transgelin 、Arp2、Survivin 、Cytokaratin7 和 Vinculin ）編碼基因的多態(tài)性 及其與腎臟病理、腎臟病變進(jìn)展相關(guān)性；構(gòu)建基因變異體，觀察骨架蛋白基因變異對足細(xì)胞形態(tài)和功能的影響；并進(jìn)一步觀察骨架蛋白分子參與腎損傷的分子通路和干預(yù)的可能靶

14、點(diǎn)。研究編碼PKD1/2基因突變在遺傳性多囊腎發(fā)病學(xué)中的作用。3）針對腎臟病關(guān)鍵致病途徑的遺傳關(guān)聯(lián)分析以中國人最常見的原發(fā)或繼發(fā)性慢性腎臟病為重點(diǎn)研究對象。例如:IgA腎?。╪=2, 000）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（n=1,000 ）、抗腎小球基底膜?。╪=100）、ANCA相關(guān)性小血管炎（n=200）, 以正常人群（n=2,000 ）為對照；參考 HapMap和 GWA數(shù)據(jù)，以補(bǔ)體系統(tǒng)和淋巴細(xì)胞異常激 活作為候選致病途徑；采用TaqMan探針法進(jìn)行SNP基因分型，采用Real-time PCR, Paralog Ratio Test進(jìn)行基因拷貝數(shù)定量；利用前期開發(fā)的相關(guān)數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行基因-基因交互

15、分析；相應(yīng)陽性結(jié)論通過病例內(nèi)表型關(guān)聯(lián)分析和獨(dú)立人群驗(yàn)證；確證的遺傳學(xué)結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)的功能驗(yàn)證和相關(guān)機(jī)制探討。DNA甲基化的影響及其與慢性腎臟病進(jìn)展的 提取組織基DNA進(jìn)行富集，運(yùn)用lllumi na 深度測序法檢測上述 發(fā)現(xiàn)具有顯著變化的甲基化位點(diǎn)及其調(diào)控基因；觀DNA甲基化水平及調(diào)控基因表達(dá)的影響；4）營養(yǎng)因素影響腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的表觀遺傳學(xué)機(jī)制 重點(diǎn)研究葉酸缺乏所致同型半胱氨酸血癥對利用已建立關(guān)系。給予正?；蚵阅I臟病模型動物富含蛋氨酸飲食誘導(dǎo)同型半胱氨酸血癥， 因組DNA采用MedIP的方法對甲基化 組織內(nèi)DNA甲基化并與正常組織相比較， 察補(bǔ)充葉酸對腎臟病變發(fā)展的影響和對 的慢

16、性腎臟病患者腎組織和血標(biāo)本庫，驗(yàn)證上述結(jié)果，并分析其與腎臟病進(jìn)展的相關(guān)性。2. 免疫性炎癥對慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的促進(jìn)作用及其機(jī)制1）補(bǔ)體系統(tǒng)活化在腎臟免疫性炎癥中的作用本課題以ANCA相關(guān)性腎炎、抗GBM病和狼瘡性腎炎為切入點(diǎn)，研究與腎臟病進(jìn)展相關(guān)的 補(bǔ)體活化途徑、補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白變化及其對補(bǔ)體系統(tǒng)功能的影響。利用免疫組化和/或免疫熒光技術(shù)對抗 GBM病患者腎組織中沉積的補(bǔ)體分子進(jìn)行檢測。利用激光共聚焦技術(shù)，觀察補(bǔ)體分子C4d, MBL的共定位以及Ficolin 和C4d的共定位；分析補(bǔ)體激活的途徑及其與抗 GBMW臨床病理表現(xiàn)的關(guān)系。檢測狼瘡性腎炎患者血清 CFH和C4BP水平；分析血清C

17、FH和C4BP水平與狼瘡性腎炎病 情活動、病理類型和腎臟預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用ELISA法檢測抗mCR自身抗體對 mCRP與其結(jié)合力的影響和抗 C1q自身抗體對C1q 與其結(jié)合力的影響； 應(yīng)用表面等離子共振技術(shù)（SPR進(jìn)一步檢測抗 mCRP和抗C1q自身抗體對C1q與CRP C4BP和CFH因子之間相互結(jié)合能力的影響。以mCRP和 C1q作為調(diào)理分子，應(yīng)用雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測抗mCRP和抗C1q自身抗體對吞噬細(xì)胞清除凋亡細(xì)胞的影響。2）自身抗體識別的靶抗原及其在腎臟病進(jìn)展和腎纖維化中的作用機(jī)體產(chǎn)生針對腎臟某種成分的自身抗體及其與組織靶抗原的相互作用是形成免疫復(fù)合 物、啟動免疫性炎癥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題

18、以ANCA相關(guān)性腎炎和抗 GBM病為切入點(diǎn)，應(yīng)用蛋白質(zhì)重組和短肽合成技術(shù)，采用抗GBMW患者的血清篩選抗 MPO抗體和抗GBMI身抗體的初 始線性抗原決定簇，并利用蛋白質(zhì)分子信息學(xué)技術(shù)、根據(jù)分子模擬理論尋找同源性蛋白質(zhì)及 可能的致病微生物。3. 代謝性炎癥對慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的促進(jìn)作用及其機(jī)制1）膽固醇代謝紊亂促進(jìn)慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的分子機(jī)制本課題擬在細(xì)胞模型、模式動物和人群水平全面探討SCA P-SREB Ps-LDL途徑對膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)的影響及其在腎臟泡沫細(xì)胞形成中的作用，從全新的角度詮釋脂代謝紊亂和代謝性炎癥介導(dǎo)腎損傷的分子機(jī)制。包括：利用腎臟系膜細(xì)胞和腎小管細(xì)胞系，通過RN

19、Ai和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立 SCAP基因沉默或過表達(dá)模型，在細(xì)胞水平明確炎癥應(yīng)激時腎臟固有細(xì)胞內(nèi)SCA P的移位；利用生化法觀察在炎癥因子刺激下腎細(xì)胞內(nèi)膽固醇分布和轉(zhuǎn)運(yùn)的變化；用熒光雙標(biāo)記法觀察SCAP在腎細(xì)胞內(nèi)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的動態(tài)轉(zhuǎn)移；分離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，檢測細(xì)胞器內(nèi)SCA P的含量；通過檢測高爾基體酶的活性及胰蛋白酶裂解等實(shí)驗(yàn)，探討炎癥對SCAP蛋白質(zhì)翻譯，翻譯后修飾（糖基化）及分子構(gòu)像的影響，并分析其與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)聚集的關(guān)系。建立SCAP腎臟特異基因敲除和 SCAP基因過表達(dá)小鼠，在普通和高脂肪兩種飲食下，通 過皮下注射10%酪蛋白或鼠皰疹病毒-68的方法，建立全身性低度慢性炎癥模型，利

20、用氫質(zhì)子磁共振波譜，在整體水平研究炎癥應(yīng)激對腎細(xì)胞攝取膽固醇和SCAP作用的影響以及 SCAP與腎臟脂質(zhì)聚集、形態(tài)學(xué)改變、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的關(guān)系。利用各種慢性腎臟病血清和腎活檢樣本，探討SCAP表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)定位與腎臟疾病表型的相關(guān)性。2）蛋白質(zhì)代謝紊亂促進(jìn)慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的作用及機(jī)制采用前期研究中已建立的方法體外制備次氯酸修飾的同種白蛋白氧化產(chǎn)物（AOPP或晚期氧化糖化終產(chǎn)物（AGE修飾的白蛋白和脂蛋白，在體外與足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞株共 同培養(yǎng)，運(yùn)用 western blot 、real time PCR 、免疫熒光等方法在體外觀察蛋白質(zhì)氧化損傷 對足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)

21、胞EMT細(xì)胞外基質(zhì)積聚、細(xì)胞表達(dá)生長因子和促炎癥因子的影響及其作用的受體和信號機(jī)制；給正常或慢性腎臟病大鼠模型慢性AOPP或 AGE負(fù)荷，在整體水平觀察上述氧化損傷蛋白對腎細(xì)胞EMT腎組織表達(dá)炎癥因子和細(xì)胞外基質(zhì)積聚的影響。3）氨基酸代謝紊亂促進(jìn)慢性腎臟病進(jìn)展和腎纖維化的作用及機(jī)制在已建立的長期隨訪（隨訪時間超過5年）社區(qū)人群樣本（n=50,000）中，分析葉酸缺乏、Hcys血癥、和 MTHFR基因型與腎功能減退（eGFR下降）的相關(guān)關(guān)系；在已建立的大樣本（n=20,000 ）社區(qū)高血壓人群中，通過隨機(jī)對照研究，比較補(bǔ)充葉酸加ACE抑制劑和單純ACE抑制劑治療對腎損傷進(jìn)展和腎功能的影響；以明確

22、葉酸缺乏和蛋氨酸代謝紊亂在慢性腎臟疾病進(jìn)展中的作用。采用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)，檢測高水平Heys對腎臟足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等增殖、凋亡、活化、EMT等的影響，以闡明 Heys血癥加速慢性腎臟疾病進(jìn)展的機(jī)制。4. 腎臟內(nèi)分泌激素對腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控作用和機(jī)制1）醛固酮/ MR對腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控作用采用髓樣細(xì)胞M基因敲除（MRKO和野生型小鼠制備腎間質(zhì)纖維化（UUO或糖尿病腎病（STZ模型。觀察MRK對纖維化指標(biāo)和腎功能的影響；分離單核細(xì)胞，觀察MRK對其遷移力的影響；分析循環(huán)中促使單核細(xì)胞遷移的相關(guān)因子（Angn、MCP-等）變化；利用流式細(xì)

23、胞儀分析腎臟巨噬細(xì)胞亞群，探討MRK對巨噬細(xì)胞亞群形成的影響；用CHiP法分析MR!否對單核細(xì)胞遷移和巨噬細(xì)胞極化相關(guān)基因有直接調(diào)控作用；比較MRKO、鼠和WTJ、鼠巨噬細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平，通過CHiP分析 M調(diào)控基因與SIRT1的關(guān)系；采用SIRT1抑制劑，評價抑制SIRT1 是否通過髓樣細(xì)胞M導(dǎo)致腎纖維化。2）維生素D/VDR寸腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控作用構(gòu)建病毒載體上調(diào)或下調(diào) Nest in和VDF基因并用嘌呤霉素（PAN誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，觀察 足細(xì)胞形態(tài)、Nest in及細(xì)胞骨架蛋白acti n/tublin等表達(dá)和分布、以及Nephrin等裂隙膜蛋PANa、白的改變；用VDRi

24、因敲除（VDR-KO小鼠制備PAN莫型，分為野生型組、野生型加野生型加PAr和 VitD治療組、VDR-KOa、VDR-KO加PAN組及VDR-KO加PAt和 VitD治療組，觀察 活性維生素DM PAN莫型動物足細(xì)胞Nest in表達(dá)及腎小球纖維化的影響；克隆野生型Nestin以及VDR吉合位點(diǎn)突變的啟動子，通過檢測luciferase 的活性分析Nestin基因轉(zhuǎn)錄情況。明確活性維生素D是否通過VDR-VDR直接調(diào)控Nestin基因表達(dá)。3）前列腺素對腎臟損傷修復(fù)和腎纖維化的調(diào)控作用將已構(gòu)建的Floxed COX2、Floxed PGIS轉(zhuǎn)基因小鼠與與間質(zhì)細(xì)胞特異性Cre （ FSP 1C

25、re,TNCCre）轉(zhuǎn)基因小鼠交配，建立條件性腎間質(zhì)細(xì)胞 COX2和 PGIS基因敲除小鼠。觀察在正常 及疾病情況（UUO糖尿病腎病、5/6NX）下野生型和腎間質(zhì)細(xì)胞COX2或 PGIS基因缺失小鼠腎臟形態(tài)、功能、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及腎間質(zhì)纖維化的變化，觀察炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、纖維 化相關(guān)信號通路等變化。5. 腎纖維化細(xì)胞內(nèi)信號分子和調(diào)控機(jī)制研究1）Smad3調(diào)控的miRNAs及其在腎纖維化中的作用利用慢性腎臟病患者腎組織活檢標(biāo)本，用免疫組化法檢測 TGF- /Smads信號通路激活和組織纖維化指標(biāo)，用原位雜交法檢測miR-21和miR-29表達(dá)。分析 miR-21和miR-29表達(dá)與TGF- /

26、Smads信號通路活化程度、腎纖維化及腎功能損傷程度的相關(guān)性。采用Smad3基因敲除、野生型成纖維細(xì)胞、穩(wěn)定的敲低smad3腎小管上皮細(xì)胞、Dox-誘導(dǎo)的Smad7過表達(dá)的腎小管上皮細(xì)胞，在有/無Angn受體阻斷劑或TGF-.中和抗體的情況下，Smad3用TGF-.1和Angn刺激上述細(xì)胞株，應(yīng)用miRNAmicroarray 和real-time PCR尋找調(diào)控的致纖維化性miRNAs利用Smad3基因敲除和野生型小鼠，分別構(gòu)建慢性腎臟病EMT（5/6NX ）、抗GBM病和馬蔸苓酸性腎病模型，在整體水平觀察miR-29表達(dá)、腎細(xì)胞腎纖維化及腎功能的變化。miRNA克隆TGF-./Smad3依

27、賴性野生型 miRNAs （如miR-29 ）以及Smad3結(jié)合位點(diǎn)突變的 啟動子，分別將其轉(zhuǎn)染至Smad3敲除或野生型系膜細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞；用熒光活性報告基因檢測啟動子活性；通過染色體免疫共沉淀（ChiP法）和ChiP-Seg法證實(shí)Smad3通過Smad結(jié)合位點(diǎn)與與致纖維化性miRNAs啟動子直接結(jié)合。將Pre-miR-29 （誘導(dǎo) miR-29過表達(dá)）或anti-miR-29 （抑制 miR-29表達(dá)）轉(zhuǎn)染Smad3敲 除或野生型成纖維細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞；觀察在TGF-.1和Angn刺激下，上述細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的變化；采用超聲微泡基因轉(zhuǎn)入技術(shù)將Pre-miR-29或an

28、ti-miR-29 轉(zhuǎn)入腎臟，之后分別建立5/6NX、抗GBM病和馬蔸苓酸性腎病模型，在整體水平觀察miR-29表達(dá)及其對腎纖維化進(jìn)展的影響。2）Beta-catenin 信號在腎纖維化中的作用在整體水平研究過表達(dá)Wnt1/4對腎纖維化的影響。通過尾靜脈快速注射法將 pcDNA-Wnt1/4導(dǎo)入體內(nèi)（前期研究已經(jīng)證明其中大部分將通過循環(huán)到達(dá)腎臟），之后構(gòu)建腎間質(zhì)纖維化模型（UUO、局灶節(jié)段硬化性腎炎模型（阿霉素模型）和急性腎損傷轉(zhuǎn)至慢性腎 臟病的模型（慢性葉酸負(fù)荷模型），檢測3 -catenin 下游靶基因snail、MMP-7 PAI-1、Fsp-1 的表達(dá)；觀察細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的變化、腎纖維

29、化程度和腎功能的變化。在細(xì)胞水平研究過表達(dá) Wnt1/4對細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響。（1）采用穩(wěn)定表達(dá) Wnt1/4的HKC細(xì)胞系，或在培養(yǎng)基中加入 Wnt刺激內(nèi)源性3 -catenin 表達(dá)，或用siRNA降低內(nèi)源性3 -catenin 表達(dá)；而后觀察3 -catenin 下游靶基因的表達(dá)；觀察細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)和EMT相關(guān)指標(biāo)變化。（2）用Affymetrix基因芯片尋找新的3 -catenin 下游靶基因，并用熒光活性報告基因檢測3 -catenin 對靶基因啟動子活性的調(diào)控；通過ChiP法證實(shí)3 -catenin 與其靶基因啟動子的直接相互作用。在整體水平研究3 -catenin 信號通路對

30、腎纖維化及腎功能的影響。分別構(gòu)建近端腎小 管、遠(yuǎn)端腎小管/集合管特異的3 -catenin基因敲除小鼠，構(gòu)建曼性葉酸腎病模型，觀察3-catenin 基因敲除對腎臟纖維化程度和腎功能的影響；尾靜脈注射3 -catenin信號通路的小分子抑制劑ICG-001，觀察抑制3 -catenin 對UUO阿霉素模型和慢性葉酸負(fù)荷模型腎纖 維化和腎功能的影響。6. 預(yù)警/干預(yù)進(jìn)展性腎臟病和腎纖維化的生物標(biāo)志物 /靶標(biāo)1 ）從尿液中篩選早期識別和動態(tài)評估腎纖維化的生物標(biāo)志物構(gòu)建基于固相PCR反應(yīng)的DNA芯片和多重PCR產(chǎn)物檢測的DNA芯片。提取患者和對照組 的尿液沉渣細(xì)胞 RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA分別進(jìn)行

31、固相 PCR或液相多重PCR反應(yīng)。將上述 兩種芯片檢測結(jié)果與real time PCR結(jié)果進(jìn)行比較，評價兩種芯片的可靠性、可重復(fù)性和敏 感性。建立完整的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、基因表達(dá)差異分析、確定最優(yōu)化的生物標(biāo)志物、評價目的標(biāo)志物的真/假陽性率、構(gòu)建受試者特征曲線ROC、和評價動態(tài)變化的生物標(biāo)志物對疾病發(fā)展的監(jiān)測作用等）。根據(jù)既往對腎纖維化機(jī)制的理解和本項目發(fā)現(xiàn)的纖維DNA芯片，檢測患者和正常人尿0.5的標(biāo)志物，通過回顧性縱向化相關(guān)分子，選取與早期病理生理改變密切相關(guān)的因子構(gòu)建 液mRNA找到有表達(dá)差異的指標(biāo)。對ROC曲線下面積大于研究和前瞻性隊列研究作進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。2）干預(yù)腎纖維化

32、的新生物靶標(biāo)CHIP的抗腎纖維化作用。CHIP的基礎(chǔ)表達(dá)；采用FLAG標(biāo)用分子生物學(xué)技術(shù)在體外研究系膜細(xì)胞和腎成纖維細(xì)胞記的PCDNA3-CHIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞上調(diào) CHIP表達(dá)或利用 RNA干擾技術(shù)下調(diào) CHIP表達(dá)，觀察其 對TGF-3 1誘導(dǎo)的纖維化相關(guān)分子表達(dá)的影響；將CHIP上調(diào)/下調(diào)的細(xì)胞與蛋白酶體抑制劑MG132共同作用，觀察對 Smad3 p-Smad3和p-Smad2表達(dá)的影響。在動物模型上采用超聲 微泡法轉(zhuǎn)染FLAG標(biāo)記的PCDNA3-CHIP質(zhì)粒，研究上調(diào)腎臟 CHIP表達(dá)對UUC和糖尿病腎病 腎臟病理、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和腎功能的影響。根據(jù)Smad3和CHIP的分子結(jié)構(gòu)，設(shè)計

33、和構(gòu)建Protacs ;通過體外細(xì)胞模型，驗(yàn)證Protacs對系膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Smad3下游靶基因的抑制作用；通過體內(nèi)研究進(jìn)一步驗(yàn)證Protacs對UUC和糖尿病腎病模型的腎臟保護(hù)作用。HSP 72調(diào)控腎臟炎癥反應(yīng)的作用和機(jī)制。分別采用HSP72單基因、雙基因敲除和野生型小鼠建立UUO莫型；設(shè)立假手術(shù)組、UUOa和UUC加GGA灌胃組；觀察HSP72對炎細(xì)胞浸潤和炎癥因子表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、 成纖維細(xì)胞標(biāo)志蛋白（a -SMA和FSP-1）表達(dá)和腎間質(zhì)纖 維化的影響以及對腎組織 Stat3信號通路的作用。在體外細(xì)胞模型觀察上調(diào)/沉默細(xì)胞HSP72 對Angn刺激下腎細(xì)胞炎癥因子釋放及Sta

34、t3轉(zhuǎn)錄活性的影響。修正版6.四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1.2.3.4.5.建立研究所需的各種細(xì)胞模型、動物 模型，繁殖轉(zhuǎn)基因、基因敲除小鼠； 收集研究所需的臨床樣本。分析IgA腎病、家族性腎病綜合征家 系和特發(fā)性腎病綜合征患者足細(xì)胞骨 架蛋白的基因突變；針對補(bǔ)體系統(tǒng)、 淋巴細(xì)胞異?；罨緩揭约白允赏?的相關(guān)基因，進(jìn)行候選基因遺傳變異 與IgA腎病和狼瘡性腎炎發(fā)病易感性 的遺傳關(guān)聯(lián)分析。完成IgAN患者的全基因組SNP檢測； 以及腎臟病患者DNA甲基化位點(diǎn)的檢 測。篩選并確定抗 MPC抗體和抗GBM自身 抗體的初始線性抗原決定簇，研究抗 原決定簇與疾病時相以及臨床表型關(guān) 系。體外觀察活性維

35、生素 D對PAN誘導(dǎo)足 細(xì)胞損傷及巢蛋白表達(dá)的影響； 完成基于固相PCR反應(yīng)的DNA芯片以 及多重PCF產(chǎn)物檢測DNA芯片的構(gòu)建。1.2.3.4.5.6.建立各種細(xì)胞模型，以及成熟的細(xì)胞 分子生物學(xué)技術(shù)，為下步實(shí)驗(yàn)提供實(shí) 驗(yàn)材料和技術(shù)平臺。初步確定抗 抗原決定簇， 的作用。初步發(fā)現(xiàn)在GBM自身抗體的初始線性并證實(shí)其在抗GBM病中IgA腎病中差異表達(dá)的DNASNP位點(diǎn)，以及腎臟病患者的低 甲基化位點(diǎn)。通過體外細(xì)胞研究證明維生素D可治療PAN引起足細(xì)胞損傷。解決基因芯片構(gòu)建關(guān)鍵技術(shù)的優(yōu)化， 為臨床標(biāo)本檢測構(gòu)建可靠的技術(shù)平 臺。發(fā)表SCI論文5-10篇。修正版5.7.研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)1.2.3.4.

36、5.6.7.1.2.3.4.6.對差異表達(dá)的SNP和 DNA低甲基化位 點(diǎn)進(jìn)行大樣本驗(yàn)證；分析它們與臨床 表型、病理類型及預(yù)后的關(guān)系。針對所發(fā)現(xiàn)的遺傳基因變異，進(jìn)行SNP基因分型，基因拷貝數(shù)定量；及 其與疾病發(fā)病、表型的相關(guān)分析。檢測ANCAri關(guān)性腎炎患者C5a受體的 表達(dá)，研究C5a激活的中性粒細(xì)胞發(fā) 生呼吸爆發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。觀察炎癥對 SCAP在細(xì)胞器內(nèi)以及細(xì) 胞內(nèi)膽固醇分布的影響。在體外觀察氧化修飾蛋白質(zhì)和同型半 胱氨酸對腎臟固有細(xì)胞的損傷作用。 探討髓樣細(xì)胞 MR的致腎臟纖維化作 用，以及活性維生素 D對腎小球硬化 的影響。尋找受Smad3調(diào)控的新miRNAs研究 Wnt1、Wnt

37、4和CHIP對腎小管上 皮細(xì)胞EMT 3 -catenin 下游靶基因 snail、MMP-7 PAI-1、Fsp-1 表達(dá)的 影響。研究足細(xì)胞骨架蛋白分子在慢性腎臟 病進(jìn)展中的作用。利用動物模型，在整體水平研究C5a受體在ANCA相關(guān)性腎炎發(fā)病中的作 用。探討介導(dǎo)氧化修飾蛋白和同型半胱氨酸引起細(xì)胞損傷的信號機(jī)制。研究髓樣細(xì)胞 MR在糖尿病腎病中的 作用；利用 VDR基因缺陷小鼠，驗(yàn)證 維生素D通過VDR影響足細(xì)胞。研究Smad3對miRNAs的調(diào)控機(jī)制。通過臨床病例篩查進(jìn)一步優(yōu)化用于基因芯片的mRNA勺類別及數(shù)目。研究上調(diào) CHIP蛋白表達(dá)對腎臟結(jié)構(gòu) 和功能的影響。明確與IgAN發(fā)病密切相關(guān)的 SNP位 點(diǎn)，明確DNA低甲基化與慢性腎臟病 發(fā)病的關(guān)系。明確參與IgA腎病和狼瘡性腎炎發(fā)病 易感性的固有免疫成分補(bǔ)體系統(tǒng)和適 應(yīng)性免疫異常淋巴細(xì)胞激活的相關(guān)分 子，闡明自噬通路相關(guān)基因參與自身 免疫性疾病腎臟損害的機(jī)制。確定足細(xì)胞骨架蛋白分子異常的致病 機(jī)制。證實(shí)MR參與腎臟纖維化；證實(shí) miR-21 和 miR-29 是 TGF/Smad3 下游的腎臟纖維化的特異性靶基因， 發(fā) 現(xiàn)新的Smad3特異性靶基因。6. 闡明Wnt1和 Wnt4在腎纖維化、腎小 管上皮細(xì)胞EMT中的作用。7. 發(fā)表SCI論文5