基因工程復(fù)習(xí)筆記

1、學(xué)習(xí)必備歡迎下載第一章 一、電泳電泳（eletro phorosis）:帶電荷的分子在電場(chǎng)中以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng).移動(dòng)速度稱為電泳遷移率。影響因素：1電泳遷移率同電場(chǎng)的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目 成正比。2. 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。3當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度一定，電泳介質(zhì)相同，電荷相同的分子在電場(chǎng)中遷移的速度主要取決于分子本身的大小和形狀（構(gòu)型）。4分子形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān)：分子量越大,移動(dòng)越慢。指示劑：溴酚藍(lán)（Bb）:常用指示劑。分子量 670,分子篩效應(yīng)小，近 似于自由電泳，呈藍(lán)紫色。二甲苯青（Xc）:分子量554.6, 呈藍(lán)色，遷移速度比B

2、b慢。染料：溴化乙錠（EB）1、聚丙烯酰胺凝膠電泳優(yōu)點(diǎn)：比瓊脂糖凝膠的分辨率高的多；回收DNA樣品純度高，無(wú)色透明，韌性好，銀染的凝膠干燥后可長(zhǎng)期保存；能裝載的DNA量大，達(dá)每孔10DNA。2、SDS-PAGE原理：SDS是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上相同密度負(fù)電荷。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合使蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，成為形狀近似雪茄狀的長(zhǎng)橢圓棒，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物短軸相同，而長(zhǎng)軸與蛋白質(zhì)的分子量成正比。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物電泳的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與橢圓棒的長(zhǎng)度，即蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。二、PCR技術(shù)定義：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase

3、 Chain Reaction PCR)技術(shù)，以DNA為模板，在引物、dNTPs、Taq酶的作用下，經(jīng)變性退貨延伸反復(fù)循環(huán)，使某個(gè)基因在體外特異性地?cái)U(kuò)增。PCR法的原理也是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因或 DNA片段。影響因素：(1) Taq DNA聚合酶(具有5' 3聚合酶活性和5' 3'外切酶活性，但沒(méi)有 3' 5'卜切酶活性因此不能修復(fù)錯(cuò)誤的堿基配對(duì))。(2)引物(primer) 一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)1530bp;位置與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩3端序列互補(bǔ)(5端相同)的短DNA ;引物的堿基組成:盡可能提高 G+

4、C含量，避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列，避免形成引物二聚體。(3)引物的Tm值：實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于 Tm值5 oC。(4) dNTPs含量適中(5) Mg 2+的濃度(6)對(duì)照實(shí)驗(yàn)三、PCR技術(shù)的擴(kuò)展：反向PCR:不對(duì)稱PCR:差異顯示PCR。反向PCR 原理：擴(kuò)增兩個(gè)引物外側(cè)的未知序列，使引物的外側(cè)序列 轉(zhuǎn)變”成內(nèi)側(cè)序列。擴(kuò)增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA ,然后用連接酶連接成一個(gè)環(huán)狀 DNA分子，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增引物的上游片段和下游片段。不對(duì)稱PCR：用于擴(kuò)增單鏈DNA，單鏈DNA更適于測(cè)序。mRNA差別顯示技術(shù)：對(duì)組織特異性或誘導(dǎo)專一性表達(dá)基因進(jìn)行分離的有效方法之一。將mRNA

5、逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的 一種獲得差異表達(dá)基因的 RNA指紋圖譜技術(shù)，也稱為DDRT-PCR（差別顯示RT-PCR）。四、分子雜交 分子雜交（簡(jiǎn)稱雜交molecular hybridization）其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，使來(lái)源不同的DNA（或RNA）片段,按堿 基互補(bǔ)關(guān)系形成雜交雙鏈分子（heterodu pl ex）。五、Blotting （印跡）：凝膠電泳分離的DNA或RNA在雜交之前通過(guò) 毛細(xì)管虹吸作用或電導(dǎo)作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上， 而且是按照其在凝膠中 的位置原地 復(fù)印”上去，這一過(guò)程叫印跡。六、常用的分子雜交類型（south與north的區(qū)別）1、So

6、uthern blotting :用 DNA (RNA )探針檢測(cè) DNA。 基本過(guò) 程:樣品DNA樣品7酶切 7電泳 7堿變性 7轉(zhuǎn)膜7固定（80度或紫外線照射）T雜交 7洗滌7放射自顯影2、Northern blotting :用 DNA( RNA )探針檢測(cè) mRNA 樣品。提 取完整mRNA ;進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，破壞 RNA的局部雙螺旋；其它步驟的原理與 Southern印跡相似。與Southern blotting相比，Northern blotting條件較嚴(yán)格，特別是RNA易降解，前期制備和 轉(zhuǎn)膜要防止Rnase的污染。不需酶切。3、原位雜交(Situ hybridiz

7、ation):細(xì)胞及染色體上檢測(cè)特異DNA或RNA序列的一種技術(shù)，是一種直接，簡(jiǎn)便的研究基因定位和表達(dá)的方法。組織原位雜交(tissue in situ hybridization)和菌斑原位雜交 4、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blotting)七、DNA序列分析1、Sanger雙脫氧終止法*原理：雙脫氧核苷酸，2、3都脫氧，3無(wú)OH，后續(xù)核苷酸不能連 接，核苷酸鏈不能延伸。最后得到一系列小片段，電泳。(1) DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行的。脫氧核糖的連接是以3' 5'磷酸二脂鍵(2)復(fù)制反應(yīng)可以在體外進(jìn)行。反應(yīng)體系中包括：?jiǎn)捂溎０?、dNT Ps、合適

8、的引物、一定比例的 2 ；3 -雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)以及若干種適量的無(wú)機(jī)離子。(4) 2和3雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制反應(yīng)終止。(5)凝膠電泳分離DNA單鏈片段時(shí)，小片段移動(dòng)快，大片段移動(dòng)慢。2、Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法(化學(xué)降解法)八、基因芯片(Gene Chip)在固體支持物上高度密度排列的 DNA片段或寡核苷酸鏈，又稱DNA微陣列或寡核苷酸微陣列。技術(shù)原理：一種大規(guī)模集成的固相雜交，指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量預(yù)先制備的 DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面形成陣列，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過(guò)雜 交信號(hào)檢測(cè)樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的

9、信息）?；蛐酒膽?yīng)用：DNA測(cè)序 基因表達(dá)分析 基因診斷 基因突變: 藥物研究與開(kāi)發(fā) 九、基因突變技術(shù)基因突變（gene mutation）:基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基對(duì)組成或排列順序的改變，并引起個(gè)體表型的改變，而使生物體發(fā)生遺傳 變異。特異性突變：寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變；盒式突變；PCR點(diǎn)突變;基因合成。1、寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變（p38）原理 使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片段作為引物, 啟動(dòng)單鏈M13噬菌體DNA進(jìn)行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為 新合成DNA子鏈的一個(gè)組成部分，新合成的子鏈便具有發(fā)生突變的 堿基序列。2、盒式誘導(dǎo)突變（cassette mutagen

10、）-片段取代法（p39）以各種雙鏈質(zhì)粒DNA為載體，采用人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段置換待改造基因中兩個(gè)不同限制酶切點(diǎn)之間的序列，在轉(zhuǎn)化的大腸細(xì)菌中可形成數(shù)量眾多的突變體。 這些合成的突變 片段就好像不同的盒式錄音磁帶，可隨時(shí)插入準(zhǔn)備好的質(zhì)粒中，稱為 盒式突變。3、PCR點(diǎn)突變技術(shù)PCR法的原理也是利用人工合成帶突變位點(diǎn)的誘變引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增而獲得定點(diǎn)突變的基因或 DNA片段。第二章一、限制性核酸內(nèi)切酶（Restriction endonuclease 類能夠識(shí)別雙 鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列（48bp）,并在相關(guān)位置切 割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的類型：I型、

11、II型、山型限制性內(nèi)切酶 。II型酶就是通常所說(shuō)的DNA限制性核酸內(nèi)切酶。限制性內(nèi)切酶的命名原則：基本名稱：微生物的屬名第一個(gè)字母大 寫(xiě)斜體，種名的前兩個(gè)字母小寫(xiě)斜體。取變種或品系的第一個(gè)字母。該微生物中發(fā)現(xiàn)的酶的順序按照羅馬字母順序編寫(xiě)I、II、III等。（填空題）同裂酶：異源同工酶：來(lái)源不同，但具有相同的識(shí)別序列的限制性內(nèi) 切酶。同尾酶（Isocaudame）來(lái)源不同，識(shí)別序列不同，但是切割DNA分子 所得的DNA片段具有相同的粘性末端。雜交位點(diǎn)（hybrid site）:同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端連接后所形成的新的位點(diǎn)。同尾酶的粘性末端互相結(jié)合后形成的新位點(diǎn)一般不能再被原來(lái)的 酶識(shí)別。識(shí)

12、別位點(diǎn)在DNA分子中的頻率計(jì)算：理論上有n個(gè)核苷酸的識(shí)別序 列的酶出現(xiàn)概率為1/4n。星號(hào)活力（Star activity）:在非標(biāo)準(zhǔn)條件下，切割一些與特異識(shí)別序列類似的序列，降低酶切反應(yīng)的特異性，這種現(xiàn)象稱為酶的星號(hào)活性 記作:EcoRI*。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素:1. DNA的純度：純化DNA加大酶的用量 1ugDNA用10U酶 延長(zhǎng)保溫時(shí)間擴(kuò)大反應(yīng)體積（20田）2. DNA的甲基化程度：基因工程中必須使用甲基化酶失活突變的 菌株3. 溫度不同的限制性內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。大多數(shù)是37 oC,少數(shù)要求 25-30OC 或 50-65 oC4. 緩沖液：商品化的限制酶一般都帶有專用緩

13、沖液。二、連接酶 基因克隆實(shí)驗(yàn)中常用的DNA連接方法：（P102）a、同聚物加尾連接 用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈 DNA的3'端各加一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端b、銜接物連接法 原理：（1）T4DNA連接酶連接linker與克隆DNA 片段。（2）限制性內(nèi)切酶消化具有銜接物的 DNA分子和載體分子,產(chǎn)生出互補(bǔ)粘性末端，進(jìn)行粘性末端的連接。C、接頭連接法原理：接頭平末端與平末端的外源 DNA片段連接之后,使后者成為具有粘性末端的新的 DNA分子，而易于連接重組。d、黏末端連接e、平末端連接連接酶連接作用發(fā)生在雙鏈 DNA上切口處的磷酸二酯鍵。而不能連接兩條單鏈DNA或雙鏈DNA中缺失了

14、核苷酸的缺口。三、DNA聚合酶DNA聚合酶I的主要用途：切口平移（nick translation）法標(biāo)記DNA （制 備DNA探針）： 原理:雙鏈DNA在DNA酶I的作用下行成單鏈切口， DNA聚合酶I利用5' 3'卜切活性從切口的5端逐步水解核苷酸時(shí)，酶的聚合活性則利用切口的3游離羥基逐個(gè)加上相應(yīng)的核苷酸，使得切口向下移 動(dòng)。這種切口移動(dòng)的現(xiàn)象稱為切口平移。 如果反應(yīng)中使用的單核苷酸底物是用同位素標(biāo)記過(guò)的，則產(chǎn)物DNA分子既可作為帶放射性的DNA分子雜交探針。（利用DNA聚合酶I的5' 3'卜切酶活性和5' 3'勺聚合酶活性。）Klenow

15、fragment（Klenow聚合酶）由DNA Pol I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理產(chǎn)生的。性質(zhì):具有5' 3聚合酶活性和3' 5'卜切酶活性。T4 DNA聚合酶的性質(zhì)：5' 3聚合酶活性和3' 5'卜切酶活性（降解單鏈更快）。逆轉(zhuǎn)錄酶：依賴RNA的DNA聚合酶（RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶）。作用：具有5' 3聚合酶活性；具有RNaseH活性，雙向外切DNA-RNA雜合鏈中的RNA鏈。用途：構(gòu)建cDNA文庫(kù)四、DNA修飾酶1、S1核酸酶 特點(diǎn)：高度單鏈特異性：降解單鏈DNA或RNA , 降解DNA速度大于RNA速度；內(nèi)切或外切；需pH4.0-4.

16、3環(huán)境，Zn2+ 激活2、堿性磷酸酶：來(lái)自于小牛腸（CIP）或大腸桿菌（BAP），用于去掉DNA or RNA分子的5端的磷酸基團(tuán)。功能：防止線性化的載 體份子自我連接3、T4多核苷酸激酶（T4-PNK or T4-PNP）催化丫磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈DNA或RNA的5'-0H端。 用途：DNA 5 -OH端磷酸化、標(biāo)記DNA的5端。（1）正向反應(yīng)（2）交換反應(yīng)。4、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）不需要模板的DNA聚合酶，在DNA分子的3末端增加一個(gè)或多個(gè)脫氧核苷酸。特點(diǎn)： 需要H。 不需要 模板！ 底物可以是單鏈DNA、3'OH端突出的雙鏈DNA、平 末端DNA。 隨機(jī)添

17、加的dNTPs,如只有一種dNTP,則添加同聚 物。第三章 基因工程載體1、載體（Vectors）在基因工程操作中，把能攜帶外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子叫載體。2、基因工程對(duì)載體的要求：（1）在宿主細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)立復(fù)制，ori有選擇性標(biāo)記Ampr、Tetr、Kanr等。多克隆位點(diǎn)：外源基因插入的單一限制酶位點(diǎn) 分子量小，可容納較大的外源基因片段 拷貝數(shù)多，方便外源基因在細(xì)胞內(nèi)大量擴(kuò)增。具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性 具有較好的安全性，不能任意轉(zhuǎn)移3、質(zhì)粒載體質(zhì)粒（P lasmid）獨(dú)立于染色體以外的能自主復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子(Covalently Closed Circular DNA,

18、 ccc DNA)。質(zhì)粒（plasmid）的基本特征：1、自主復(fù)制性松弛型復(fù)制質(zhì)粒（relaxedplasmid ）和嚴(yán)緊型復(fù)制質(zhì)粒（stringent plasmid）2、可轉(zhuǎn)移性 這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的mob基因產(chǎn)物。3.質(zhì)粒的不相容性（incompatibility,又稱不親和性）4、攜帶特殊的遺傳標(biāo)記質(zhì)粒的CCC分子可有不同的構(gòu)型：SC構(gòu)型，OC構(gòu)型和L構(gòu)型 質(zhì)粒的分離純化P60（1）.CsCI密度梯度離心法原理：1.EB能夠嵌入DNA的堿基對(duì)之間,不同構(gòu)型DNA分子結(jié)合EB的量不同，從而密度不同。2.完整的超 螺旋質(zhì)粒沒(méi)有自由末端，解鏈比較困 難，結(jié)合EB的量少，密度較大.線形的DN

19、A和開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒DNA由于松弛，可以 結(jié)合較多的EB分 子，則密度小.3.EB濃度達(dá)到飽和時(shí)，超螺旋質(zhì)粒 DNA分子密度大于線形和開(kāi)環(huán)的質(zhì)粒DNA，從而分開(kāi)。（2）、沸水浴法 制備的質(zhì)粒不純，收率低，制備規(guī)模小，但快速,特別適用小量提取質(zhì)粒。(3) .堿裂解法質(zhì)粒構(gòu)建原則：1、選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒2、正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體的元件：酶切、 PCR 3、組裝合適的選擇標(biāo)記基因 4、選擇合適的啟動(dòng)子 5、提高外源DNA的容量 6、需要滅活出發(fā)質(zhì)粒上的某些編碼基因 7、達(dá)到預(yù)期目的前提下，構(gòu)建過(guò)程應(yīng)力求簡(jiǎn)單質(zhì)粒載體的類型的選擇：(1)高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體：適合大量增殖 克隆基因(2) 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體：適合

20、于克隆含量過(guò)高對(duì)寄主代謝有害的基因。減少蛋白質(zhì)產(chǎn)物對(duì)寄主細(xì)胞的毒害。(3) 失控的質(zhì)粒載體：一些低拷貝基因是溫度敏感型(4) 插入失活型質(zhì)粒載體：載體的克隆位點(diǎn)位于其某一個(gè)選擇性標(biāo)記基因內(nèi)部。外源DNA片段插入會(huì)導(dǎo)致選擇記號(hào)基因(如tetr、ampr、cmr等)失活。(5) 正選擇的質(zhì)粒載體：質(zhì)粒載體具有直接選擇記號(hào)并賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型。只有帶有選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化菌細(xì)胞才能在選擇培養(yǎng) 基上生長(zhǎng)。(6) 表達(dá)型質(zhì)粒載體：含有強(qiáng)的啟動(dòng)基因，合適的順序以及有效的終止子，以便外源基因在受體細(xì)胞內(nèi)的咼效表達(dá)。主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體:1. PSC101天然質(zhì)粒，屬嚴(yán)

21、緊型低拷貝質(zhì)粒2. ColEI質(zhì)粒載體 天然質(zhì)粒，屬松弛型、高拷貝質(zhì)粒,6.3Kb。選擇標(biāo)記：大腸桿菌素（colicin） E1和對(duì)E1免疫的基因（immEI)3. PBR322: PBR322的構(gòu)建元件是來(lái)源于三個(gè)親本質(zhì)粒:PMB1:出發(fā)質(zhì)粒(ColE1);PSF2124: Ampr ; pSC101: Tetr (填空題)PBR322的優(yōu)點(diǎn)：雙抗生素抗性選擇標(biāo)記分子小，克隆能力大高拷貝數(shù)安全具有較多的單一酶切位點(diǎn)4、pUC質(zhì)粒載體 組成：a .ori來(lái)自pBR322質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)b.標(biāo)記基因（ampr） :pBR322的Ampr基因 c. lacz'基因 d、克隆位點(diǎn)(MCS)菌落

22、藍(lán)白選擇的原理：在基因克隆時(shí)，細(xì)菌在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。IPTG誘導(dǎo)質(zhì)粒的lacz'基因產(chǎn)生a-肽，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生半乳糖苷酶的羧基端片段。兩種片段形成有功能的半乳糖苷酶，從而使 X-gal水解，產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì),使非重組菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源基因插到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后,使lacz'失活，不能表達(dá)a肽，破壞了互補(bǔ)作用，細(xì)胞內(nèi)無(wú)有活性半乳糖苷酶，使帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌將產(chǎn)生白色菌落。4、入噬菌體載體的構(gòu)建?cos位點(diǎn)：線狀雙鏈DNA，兩端各有一個(gè)12bP的互補(bǔ)單鏈（粘性末端，cohesive-e nd site）,稱入cos site，粘性末端粘連接變成環(huán)狀DNA。

23、入DNA載體的構(gòu)建（野生型改造成目的載體）：1、縮短長(zhǎng)度，裂解 所不必需的，切除便提高裝載量。2、酶切位點(diǎn)的刪除或增加 3、滅活某些與裂解周期有關(guān)的基因，將無(wú)義突變引入噬菌體裂解周期所需 的基因。 4、加裝選擇標(biāo)記，選擇標(biāo)記主要有兩類：免疫功能類標(biāo)記和顏色反應(yīng)類標(biāo)記（藍(lán)白斑篩選）。5、建立幾-噬菌體的體外包裝系5、柯斯質(zhì)粒（cosmid）定義：一類人工構(gòu)建的含有入DNA兩端cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊 類型的載體。組成：抗性標(biāo)記、質(zhì)粒復(fù)制起始部位、限制型內(nèi)切酶切位點(diǎn)、cos粘性末端特點(diǎn)：1、具有入噬菌體的特性2、具有質(zhì)粒載體的持性3、具有高容量的克隆能力4、便于篩選5、便于克隆6、不能體內(nèi)包裝

24、，不裂解受體細(xì)胞 6、M13DNA載體的特點(diǎn)1、克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細(xì)胞外，在 DNA定向突變中非常有用.2、M13重組體篩選簡(jiǎn)便可以利用菌落的藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化子3、制備的單鏈DNA、雙鏈RF-DNA M13噬菌體，不經(jīng)體外包裝,可以轉(zhuǎn)染大腸桿菌受體4、缺點(diǎn)：包裝能力有限，僅包裝克隆 DNA為1.5kb。7、噬菌粒載體的特點(diǎn)像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制，克隆雙鏈 DNA ； 能像M13 DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，制備單鏈DNA 裝載量比M13系列要大很多（10 kb）重組操作簡(jiǎn)便，篩選容易8、人工染色體克隆載體（artificial chromosome

25、 vector）定義：利用染色體的復(fù)制元件來(lái)驅(qū)動(dòng)外源 DNA片段復(fù)制的載體特點(diǎn)：含有質(zhì)?？寺≥d體所必需的第一受體（大腸桿菌）的質(zhì)粒復(fù)制 起始點(diǎn)；含有質(zhì)?？寺≥d體所必需的第一受體（大腸桿菌）的質(zhì)粒復(fù) 制起始點(diǎn)；合適的選擇標(biāo)記基因。酵母人工染色體（YAC）的組成：酵母4號(hào)染色體的復(fù)制起點(diǎn)（ARS）、著絲粒序列（CEN）、選擇標(biāo)記基因序列、端粒（TEL ）、sup4基因（含有克隆位點(diǎn)）細(xì)菌人工染色體（BAC)9、重組體的篩選:（作業(yè)）7大類方法，簡(jiǎn)答，論述or選擇第四章 DNA分子克隆基因克隆的一般步驟：目的基因片段的獲得；體外重組；重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞擴(kuò)增或表達(dá)；重組子的篩選轉(zhuǎn)化（transf

26、ormation）：感受態(tài)的大腸桿菌捕獲和表達(dá)質(zhì)粒DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)染(transfection)：感受態(tài)大腸桿菌捕獲和表達(dá)噬菌體 DNA的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(tran sductio n)：噬菌體將一個(gè)細(xì)胞的基因傳遞給另一細(xì)胞的過(guò)程。重組體導(dǎo)入細(xì)胞方法-CaCI2轉(zhuǎn)化法的原理:感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells):受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為最適攝取和容納外源DNA的生理狀態(tài)。CaCl2轉(zhuǎn)化法基本原理;0C低滲的CaCl2處理使大腸桿菌進(jìn)入感受態(tài)”(膜磷脂在低溫F形成液晶結(jié)構(gòu)， 細(xì)胞吸水膨脹),外源DNA與Ca2+形成復(fù)合物粘 附在表面，而熱休克使內(nèi)外膜溫度不

27、平衡，細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，這樣DNA得以進(jìn)入細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選。直接轉(zhuǎn)化法：a、電擊法(electroporation) or電穿孔法基本原理:將待轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中， 兩極施加短時(shí)高壓電場(chǎng)，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，在細(xì)胞膜雙脂層上形成瞬時(shí)微 孔，重組質(zhì)粒DNA可進(jìn)入細(xì)胞。b顯微注射法(microinjection )使用極細(xì)的毛細(xì)管在顯微鏡下 將目的DNA注射到動(dòng)物細(xì)胞或植物原生質(zhì)體的一種直接方法；直接 把外源DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上C、基因槍法(gene gun)將外源DNA包被在微小的金?；蜴u粒(0.6-1um)表面，然后在高壓的作用下將微粒

28、高速射入受體細(xì)胞或組織，微粒上的外源DNA進(jìn)入細(xì)胞整合到染色體上并表達(dá)，實(shí)現(xiàn)基 因的轉(zhuǎn)化。第五章目的基因的獲取化學(xué)合成法從反應(yīng)機(jī)理上分為：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸 三酯法、自動(dòng)化合成法操作過(guò)程：液相合成固相合成亞磷酸三酯法合成過(guò)程:1核苷酸的保護(hù)2核苷酸活化3縮合反應(yīng)4蓋帽反應(yīng)5氧化反應(yīng)6多次循環(huán)和釋放基因組裝戰(zhàn)略3種方法:1、小片段粘接法2、補(bǔ)丁延長(zhǎng)法3、大片段酶促法 反轉(zhuǎn)錄PCR: RT-PCR,以mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一條鏈為模板的PCR。反向PCR：根據(jù)已知DNA區(qū)的序列設(shè)計(jì)引物，以包含已知區(qū)和未知 區(qū)的環(huán)化DNA分子為模板來(lái)擴(kuò)增未知DNA區(qū)序列的PCR技術(shù)?；驇?kù)(ge

29、ne poo):特定生物體全基因組的集合(天然存在)。每個(gè)種群都具有其獨(dú)特的基因庫(kù)。基因文庫(kù)(gene library or gene bank) 通過(guò)克隆的方法將某一基 因組DNA或mRNA保存于適當(dāng)宿主菌中形成的轉(zhuǎn)化子群。所有重組DNA組合代表該基因組的全序列。根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫(kù)分為：基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)在構(gòu)建的基因文庫(kù)中任一基因存在的概率， 它與基因文庫(kù)最低所含克隆數(shù)N之間的關(guān)系可用下式表示：N=ln (1-P) /In (1-f)； P二任一基因被克隆（存在于基因文庫(kù)中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小?；蚪M文庫(kù)（genomic library）:包含某種

30、生物基因組全部遺傳信息的一系列DNA片段，通過(guò)克隆載體貯存在一種受體菌的群體中, 這個(gè)群體稱為這種生物的基因組文庫(kù)。基因組文庫(kù)的構(gòu)建程序:1、基因組DNA的制備和切割2、載體和受體的選擇3、DNA片段和載體的相連4、重組體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，構(gòu)建形成了基因組文庫(kù)的初庫(kù)（primary bank）5、初庫(kù)擴(kuò)增形成終庫(kù)質(zhì)粒-15kb常 用載體 容量：入-DNA-25kb ,考 斯質(zhì)粒 45kb ,YAC-400kb ，BAC-500kb，cDNA文庫(kù)的構(gòu)建定義：某生物mRNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA片段分別與合適的克隆載 體相連，通過(guò)轉(zhuǎn)化貯存在一種受體菌的群體之中， 把這種包含某生物基因組全部基因cDNA的受

31、體菌群體稱為該生物cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)：（1）不含內(nèi)含子序列（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá) （3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因。(4)比DNA文庫(kù)小的多，容易構(gòu)建。構(gòu)建過(guò)程：1、總RNA的提取 2、mRNA的純化3、雙鏈cDNA雙鏈cDNA的合成（cDNA第一鏈的合成，cDNA第二鏈的合成）4、 的克隆cDNA第二鏈的合成最常用的3種方法：自身引導(dǎo)法,法（RNase）,引導(dǎo)合成法（末端轉(zhuǎn)移酶：TdT）轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（transposon tagging原理：將轉(zhuǎn)座子插入到欲克隆基因的內(nèi)部或附近，使得目的基因發(fā)生突變，然后利用轉(zhuǎn)座子DNA為探針篩選突變株的基因組文庫(kù)，釣出含有轉(zhuǎn)座子的DNA片

32、段。然后再用篩選到的陽(yáng)性克隆中目的基因片段為探針， 篩選野生型生物基 因文庫(kù)分離目的基因。圖位克?。╩apbased cloning獲得目的基因-染色體步移（Chromosome Walking ）利用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記DNA片段為探針篩選基因組文庫(kù)，用已獲得的陽(yáng)性克 隆DNA的末端片段為探針繼續(xù)篩選，直到獲得含目的基因兩側(cè)序列 為止。染色體步移的基本過(guò)程：1）用遺傳作圖將目標(biāo)基因定位在染色體的 特定位置；2）找到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記； 3）構(gòu)建含有大插入片段的基因組文庫(kù)（BAC庫(kù)或YAC ）;4）以與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選基因組文庫(kù) 5）用獲得陽(yáng)性克隆構(gòu)建目的基因

33、區(qū)域的跨疊群； 6）通過(guò)染色體步行獲得含有目標(biāo)基因的大片段克隆 7）通過(guò)亞克隆獲得含有目的基因的小片段克隆；獲得差異表達(dá)的基因兩種方法:1、mRNA差別顯示技術(shù)（mRNA differe ntial dis play ）:對(duì)組織特異性或誘導(dǎo)專一性表達(dá)基因進(jìn)行分離的有效方法之一。將mRNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR技術(shù)相互結(jié)合發(fā)展起來(lái)的一種 RNA指紋圖譜技術(shù)，也稱為DDRT -PCR 2、減法雜交(subtractive hybridization )原理：從表達(dá)目的基因的組織提取mRNA所轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后與無(wú)目的基因表達(dá)的組織提取的mRNA做過(guò)量雜交，在兩組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成 cDNA/mRNA雙鏈雜交分子，而特異 mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA仍保持單鏈狀態(tài)，將這種單鏈cDNA分離出來(lái)即為差異表達(dá)的序列。酵母雙雜交系統(tǒng)(two-hybrid system)分離目的基因酵母雙雜交系統(tǒng)的原理，X基因和Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致rep