代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)證候的研究

1、代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)證候的研究【關(guān)鍵詞】 代謝組學(xué)；中醫(yī)證候；基因組學(xué)；蛋白質(zhì)組學(xué) 代謝組學(xué)(metabonomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科,是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。代謝組學(xué)主要研究生物對(duì)外源性物質(zhì)所引起的病理生理反應(yīng),以及對(duì)遺傳變異的應(yīng)答和內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)變化,它通過對(duì)生物體液和組織中隨時(shí)間改變的代謝物進(jìn)行檢測(cè)、確定、定量和分類,將這些代謝信息與病理生理過程中生物學(xué)事件關(guān)聯(lián)起來,以監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中化學(xué)變化?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動(dòng),而實(shí)際上細(xì)胞內(nèi)許多生命活動(dòng)是與代謝物相關(guān)的,是受代謝物調(diào)控的?；蚺c蛋白質(zhì)的表達(dá)緊密相連,

2、而代謝物則更多地反映了細(xì)胞所處的環(huán)境,這又與細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、藥物以及其它外界因素的影響密切相關(guān)。因此,有學(xué)者認(rèn)為,基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)能夠說明可能發(fā)生的事件,而代謝組學(xué)則反映確實(shí)已經(jīng)發(fā)生了的事情1。代謝組學(xué)強(qiáng)調(diào)把人體作為一個(gè)完整的系統(tǒng)來研究,通過測(cè)定人體各種體液內(nèi)代謝物的組成變化來認(rèn)識(shí)和反映人體代謝網(wǎng)絡(luò)在疾病和藥物作用下的變化規(guī)律。這對(duì)于揭示復(fù)雜性疾病的機(jī)理和藥物的代謝模式具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),與中醫(yī)學(xué)的整體觀、系統(tǒng)觀和辨證論治思維非常吻合,也與中醫(yī)重視從人與自然、人與社會(huì)和人體內(nèi)在的普遍聯(lián)系和動(dòng)態(tài)變化去分析、認(rèn)識(shí)把握疾病發(fā)生、發(fā)展、變化的客觀規(guī)律的認(rèn)識(shí)一致。因此,專家認(rèn)為,人類基因組計(jì)劃第一次使西

3、方醫(yī)學(xué)擺脫了還原論的束縛,在繼續(xù)強(qiáng)調(diào)分析的同時(shí),更加重視分析和綜合的統(tǒng)一。人類基因組計(jì)劃和隨后發(fā)展的各種“組學(xué)”技術(shù)把生物學(xué)研究帶入了系統(tǒng)科學(xué)的時(shí)代。組學(xué)的出現(xiàn)不是對(duì)個(gè)別基因或個(gè)別蛋白、代謝物的研究,而是對(duì)一個(gè)細(xì)胞或?qū)φ麄€(gè)生命體的基因以及它所編碼的蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物的研究。物理學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、信息科學(xué)、工程科學(xué)現(xiàn)在都已極大地融合到生命科學(xué)的研究之中,重視生命科學(xué)的復(fù)雜性和整體性研究已成為21世紀(jì)生命科學(xué)的發(fā)展趨勢(shì)；甚至有專家認(rèn)為,中西醫(yī)藥學(xué)在各自的發(fā)展中逐步整合,形成創(chuàng)新醫(yī)藥學(xué)體系的歷史機(jī)遇正悄然來臨。1 代謝組學(xué)技術(shù) 代謝組學(xué)主要研究的是作為各種代謝路徑的底物和產(chǎn)物的小分子代謝物(MW&

4、amp;lt;1 000)。其樣品主要是尿液、血漿或血清、唾液以及細(xì)胞和組織的提取液。完整的代謝組學(xué)流程包括樣品的采集、預(yù)處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)的分析及解釋。主要技術(shù)手段是核磁共振(NMR)、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、色譜(HPLC、GC)等。通過檢測(cè)一系列樣品的譜圖,再結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別方法,可以判斷出生物體的病理生理狀態(tài)、基因的功能、藥物的毒性和藥效等,并有可能找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物(biomarker)。1.1 核磁共振技術(shù)在代謝組學(xué)的研究中最常見的分析工具是NMR，主要是氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)及磷譜(31P NMR)三種,特別是1H NM

5、R。NMR是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場(chǎng)作用下,吸收射頻輻射而產(chǎn)生能級(jí)躍遷的譜學(xué)技術(shù)。該技術(shù)于20世紀(jì)70年代初開始應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的研究并得到迅速發(fā)展。利用高分辨率NMR技術(shù)對(duì)完整器官或組織細(xì)胞內(nèi)許多微量代謝組分進(jìn)行檢測(cè),可得到相應(yīng)的生物體代謝物信息,研究這些組分的NMR圖譜,綜合分析這些信息所反映的生物學(xué)意義,可以了解生物體代謝的規(guī)律,得出科學(xué)的結(jié)論。NMR方法具有無損傷性,不會(huì)破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì),可在接近生理?xiàng)l件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可在一定的溫度和緩沖液范圍內(nèi)選擇實(shí)驗(yàn)條件；可以進(jìn)行實(shí)時(shí)和動(dòng)態(tài)的檢測(cè)；可設(shè)計(jì)多種編輯手段,實(shí)驗(yàn)方法靈活多樣,滿足了代謝組學(xué)對(duì)盡可能多的化合物進(jìn)行檢測(cè)的目標(biāo)。N

6、MR還有一個(gè)重要的特點(diǎn),就是沒有偏向性,對(duì)所有化合物的靈敏度是一樣的。1H NMR譜峰與樣品中各化合物的氫原子是一一對(duì)應(yīng)的,所測(cè)樣品中的每一個(gè)氫原子在圖譜中都有其相關(guān)的譜峰,圖譜中信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)弱反映樣品中各組分的相對(duì)含量。因此,NMR方法很適合研究代謝產(chǎn)物中的復(fù)雜成分。從一維高分辨1H NMR圖可得到代謝物成分圖譜,即代謝指紋圖譜。對(duì)這種特質(zhì)性進(jìn)行區(qū)分、鑒定,被稱為“代謝指紋分析(metabolic fingerprint analysis)”,幫助找出機(jī)體代謝的共性與個(gè)性。對(duì)某一代謝物或組合隨時(shí)間變化的情況鑒定描述稱之為“代謝輪廓分析(metabolic profiling analysis

7、)”,觀察特定干預(yù)的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)中,找出機(jī)體代謝變化的規(guī)律。隨著NMR技術(shù)的發(fā)展,以前用于固體的魔角旋轉(zhuǎn)(MAS)技術(shù)被移植到液體領(lǐng)域,使得人們可以研究以前難以用液體NMR 研究的樣品,如器官組織樣品。利用MAS技術(shù),人們可以得到完整的組織樣品高分辨譜圖,擴(kuò)展了代謝組學(xué)研究的樣品范圍,同時(shí)可以更全面地對(duì)一個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行深入的研究2。在得到1H NMR譜圖之后,通常以0.04為單位,將譜圖劃分成若干區(qū)域,并對(duì)所有區(qū)域進(jìn)行積分,然后將積分值歸一化后輸出。在得到了這些數(shù)據(jù)之后,就可以利用模式識(shí)別(patten recognition,PR)方法來處理和分析這些數(shù)據(jù),得出有價(jià)值的生物學(xué)信息。在代謝組學(xué)的研究中

8、,最簡(jiǎn)單常用也是比較有效的模式識(shí)別方法是主成分分析法(principal component analysis,PCA)。PCA的特點(diǎn)是將分散在一組變量上的信息集中到某幾個(gè)綜合指標(biāo)即主成分(principal component,PC)上,利用這些主成分來描述數(shù)據(jù)集內(nèi)部結(jié)構(gòu),實(shí)際上也起著數(shù)據(jù)降維的作用。主成分是由原始變量按一定的權(quán)重經(jīng)線性組合而成的新變量,這些變量具有以下性質(zhì)：任意兩個(gè)主成分之間都是正交的；第1個(gè)主成分包含了數(shù)據(jù)集的絕大部分方差,第2個(gè)主成分則次之,依次類推。這樣,由前2個(gè)或3個(gè)主成分作圖,就能夠很好地反映數(shù)據(jù)集所包含的生物化學(xué)變化。這樣的主成分圖能夠直觀地描述藥物作用到器官之

9、后,或者基因改變之后生物體內(nèi)的代謝模式的變化。每一個(gè)樣本在主成分圖上的位置純粹由它的代謝反應(yīng)所決定。在這種比較簡(jiǎn)單的方法中,將從受試動(dòng)物得到的樣本與NMR產(chǎn)生的代謝組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,就可以確定它在主成分圖上的位置,從而確定其機(jī)制,并有可能找到生物標(biāo)志物。處于相似病理生理狀態(tài)的動(dòng)物得到的樣本通常具有相似的組分,因此,在主成分圖中也處于相似的位置。另外,一些環(huán)境因素和性別、飲食等因素都會(huì)影響分析結(jié)果,故需要采用濾噪技術(shù),如正交信號(hào)校正(orthogonal signal correction),同時(shí)采用更為復(fù)雜的分析方法,如偏最小二乘法、判別分析(PLS-DA)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。用這類方法可以建立復(fù)

10、雜的數(shù)學(xué)模型,對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。NMR技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用越來越廣泛,但儀器價(jià)格及維護(hù)費(fèi)用昂貴限制了該技術(shù)的進(jìn)一步普及。1.2 質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜(MS)技術(shù)是將離子化的原子、分子或是分子碎片按質(zhì)量或是質(zhì)荷比(m/e)大小順序排列成圖譜,并在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行各種無機(jī)物、有機(jī)物的定性或定量分析。新的離子化技術(shù)則使質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確度均有很大程度的提高。將預(yù)處理的體液或是組織,加至質(zhì)譜儀,經(jīng)歷汽化、離子化、加速分離及檢測(cè)分析后即可得出相應(yīng)代謝產(chǎn)物或是代謝組的圖譜。圖譜中每個(gè)峰值對(duì)應(yīng)著相應(yīng)的分子量,結(jié)合進(jìn)一步的檢測(cè)分析可以部分鑒定出化學(xué)成分以及半定量關(guān)系。不同組別的質(zhì)譜圖存在差異,加以區(qū)別、鑒定

11、,亦有助于研究代謝的變化規(guī)律及標(biāo)志性代謝產(chǎn)物3。NMR技術(shù)與MS技術(shù)相比,各有其優(yōu)缺點(diǎn),需要在研究中靈活選用?？傮w而言,NMR技術(shù)應(yīng)用的更為廣泛。此外,根據(jù)代謝組學(xué)的研究需要,還常用于其他的一些分析技術(shù),如GC、HPLC、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)等,它們往往與NMR或MS技術(shù)聯(lián)用,進(jìn)一步增加其靈敏性。2 代謝組學(xué)技術(shù)與中醫(yī)證候的研究辨證論治是中醫(yī)藥理論的核心。其實(shí)質(zhì)是根據(jù)個(gè)體心身特點(diǎn)及其當(dāng)時(shí)的疾病反應(yīng)狀態(tài)而有針對(duì)性地進(jìn)行個(gè)體化的治療和預(yù)防,從而達(dá)到最佳治療效果。中醫(yī)的“證”是論治的起點(diǎn)和核心?！白C”是指在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中,一組具有內(nèi)在聯(lián)系的、能夠反映疾病過程在某一階段的病理病機(jī),是機(jī)體

12、對(duì)體內(nèi)外各種環(huán)境變化和致病因素作出反應(yīng)的一種功能狀態(tài),其外候表現(xiàn)為一組有相互關(guān)聯(lián)的癥狀和體征群。辨證施治既不同于對(duì)癥治療,也不同于西醫(yī)的辨病治療。由于每一個(gè)證候都有其外象(外候)與內(nèi)涵,外候是望、聞、問、切四診所獲得的信息整理而得,很難量化,即使用流行病學(xué)方法加以演繹,依靠專家的經(jīng)驗(yàn)打分,最多亦只是半定量,很大程度上依賴于醫(yī)生的診療水平。由于辨證是由外揣內(nèi),在具體運(yùn)用上受到醫(yī)患雙方主觀因素的影響,難以客觀化和量化,所以必須通過“證”的內(nèi)涵研究。采用代謝組學(xué)技術(shù),通過對(duì)某一病證相關(guān)特定組分的共性加以分析、判斷,能夠幫助人們更好地理解病變過程及機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑和代謝狀況；同時(shí),代謝組學(xué)還有助于

13、疾病的生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)而達(dá)到輔助臨床診斷的目的。它能夠通過檢測(cè)不同時(shí)間患者的尿液或血液,對(duì)這些由疾病引起的代謝產(chǎn)物的響應(yīng)進(jìn)行分析,即代謝物組的分析,其準(zhǔn)確性依賴于儀器的性能,可以提高診治的科學(xué)化、定量化,避免了人為因素的誤診。成都中醫(yī)藥大學(xué)王米渠教授用基因芯片的方法研究中醫(yī)寒證患者,發(fā)現(xiàn)寒證的基因表達(dá)譜有顯著差異,在59條差異表達(dá)基因中,絕大多數(shù)與代謝(能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等)有關(guān),說明寒證患者的代謝網(wǎng)絡(luò)有別于常人。上海交通大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室采用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎陽虛模型動(dòng)物的代謝網(wǎng)絡(luò)明顯偏離正常組動(dòng)物,而用溫陽中藥干預(yù)后,模型動(dòng)物的代謝譜回歸至正常范圍,呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)的結(jié)果4。本課題組以慢性束縛

14、方法制作應(yīng)激大鼠模型，運(yùn)用動(dòng)物行為學(xué)評(píng)定和以方測(cè)證等方法確定該模型為肝郁脾虛證候模型5-10。經(jīng)NMR數(shù)據(jù)采集與分析發(fā)現(xiàn)：正常組與模型組之間存在代謝產(chǎn)物譜的顯著差異,也就是說正常組與以慢性束縛方法制作應(yīng)激大鼠肝郁脾虛證模型組之間有著代謝產(chǎn)物的不同。模型組隨著造模時(shí)間長(zhǎng)短的不同,其代謝產(chǎn)物有所變化。中醫(yī)證候之間可能存在著非常明顯的代謝產(chǎn)物的不同,這種不同是基于不同證候存在著不同物質(zhì)代謝或其代謝網(wǎng)路的改變。中醫(yī)證候的生物學(xué)基礎(chǔ)也可能從代謝組學(xué)研究中找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物,用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能,來確定“證相關(guān)代謝譜群”。基于這些研究,我們提出中醫(yī)證候的定義：證是機(jī)體對(duì)體內(nèi)外各種環(huán)境

15、變化和致病因素作出反應(yīng)的一種功能狀態(tài),其外候表現(xiàn)為一組有相互關(guān)聯(lián)的癥狀和體征群,其本質(zhì)是機(jī)體失衡而致的代謝或其網(wǎng)路的改變。3 中醫(yī)證候代謝組學(xué)研究的方法中醫(yī)證候代謝組學(xué)研究技術(shù)是通過采集證候樣本或模型動(dòng)物的血漿、尿樣品并進(jìn)行代謝產(chǎn)物譜分析,得到各自的代謝產(chǎn)物譜,找出特異的標(biāo)志性代謝產(chǎn)物,用生物信息學(xué)方法分析生物標(biāo)志物的功能,以確定“證相關(guān)代謝譜群”。也可以用方證反證的方式驗(yàn)證方藥的作用機(jī)理和進(jìn)行方證相關(guān)性的研究。值得注意的是,現(xiàn)已證明動(dòng)物體的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物與生理?xiàng)l件下的各種變化有關(guān),如性別、年齡、個(gè)體間的健康狀況、遺傳差異性、外源因素晝夜節(jié)律更替、飲食、溫度、覺醒等刺激,甚至周圍氣候不同、菌群

16、的改變,代謝組也可發(fā)生種類及數(shù)量的差別。因此,建立生理?xiàng)l件下對(duì)代謝譜的正確認(rèn)識(shí),是研究各種病理?xiàng)l件或刺激干預(yù)的前提。代謝組學(xué)正處于快速發(fā)展的階段,日益成為研究的熱點(diǎn)。高通量、高分辨率的分析技術(shù)與生物信息學(xué)相整合,從生物代謝層面進(jìn)行研究,提供了了解生物體的獨(dú)特視角。代謝組學(xué)研究側(cè)重于尋找相關(guān)特定組分的共性并加以分析、判斷,使診斷、治療力求個(gè)體化,如何把握個(gè)體及小樣本群體的特質(zhì)是今后努力的方向。代謝組學(xué)最終是要將研究的觸角涉及每一個(gè)代謝組分,研究其共性、特性及規(guī)律。在分析手段方面,各種技術(shù)都各有所長(zhǎng),怎樣進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),使得各種分析技術(shù)的數(shù)據(jù)能統(tǒng)一、交叉驗(yàn)證也是一個(gè)亟待解決的問題。而且代謝狀態(tài)變化之

17、迅速,影響因素之多,都給個(gè)體化研究帶來很大的困難。如何將代謝組學(xué)技術(shù)和方法與傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)理論結(jié)合起來,并遵循循證醫(yī)學(xué)的原則開展中醫(yī)藥的理論與臨床研究將是未來中醫(yī)方證研究的重點(diǎn)。【參考文獻(xiàn)】 1 Gennan JB,Bauman DE,Burrrin DG,et al.Metabolomics in the opening decade of the 21st century：building the roads to individualized healthJ.J Nutn,2004,134(10)：2729.2 劉昌孝.代謝組學(xué)的發(fā)展與藥物研究開發(fā)J.天津藥學(xué),2005,17(2)：16.

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