人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向成骨細(xì)胞分化的研究

1、人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及向成骨細(xì)胞分化的研究 作者：農(nóng)丕地，黃海玲，解繼勝【摘要】 目的 擬建立一套較為簡便、有效和實用的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外分離培養(yǎng)體系，探討其向成骨細(xì)胞分化的可行性。方法 由人臍靜脈血獲得MSCs，純化培養(yǎng)后用含地塞米松、-甘油磷酸鈉和維生素C的培養(yǎng)液誘導(dǎo)，通過倒置顯微鏡觀察、堿性磷酸酶染色檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞。結(jié)果 來源于臍血的單個核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)貼壁后出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上可見間充質(zhì)樣的細(xì)胞，間充質(zhì)樣細(xì)胞為類似成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽性。結(jié)論 人臍血MSCs經(jīng)合理的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)后，可以分化為成骨細(xì)胞。 【關(guān)鍵詞】 胎血 間質(zhì)干細(xì)胞 成骨

2、細(xì)胞 細(xì)胞分化 地塞米松 -甘油磷酸鈉Abstract: Objective To establish a more simple, effective and practical isolation and culture system for human umbilical cord blood (HUCB)-derived mesenchymal stem cells (MSCs), and investigate the feasibility of turning them into osteoblasts. Methods MSCs isolated from HUCB with

3、Percoll density gradient solution were culture-expanded because the cells attached and grew on dishes, then MSCs were subcultured in a condition medium including dexamethasone, vitamin C and ?-glycerophosphate. An inverted microscope, immunocytochemical staining for alkaline phosphatase (ALP) were a

4、pplied to observe the MSCs proliferation capability and osteogenic property. Results The HUCB-derived mononuclear cells, when placed in culture, gave rise to adherent cells, which exhibited either a fibroblast-like or mesenchymal-like phenotype. The MSCs in induced culture showed immunocytochemical

5、staining for ALP. Conclusion The HUCB-derived MSCs can be cultured and differentiated into osteoblasts in vitro. Key words: fetal blood; mesenchymal stem cells; osteoblasts; cell differentiation; dexamethasone; ?-glycerophosphate臍血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎兒出生時臍帶內(nèi)及胎盤近胎兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞和祖細(xì)胞

6、。目前研究證實臍血中存在的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)在一定條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化后能成為神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞14，可作為細(xì)胞治療新的種子細(xì)胞和基因治療新的載體細(xì)胞。隨著組織工程學(xué)研究的深入，對于相關(guān)功能細(xì)胞研究逐漸擴展到干細(xì)胞領(lǐng)域，MSCs對骨組織修復(fù)有重要意義，本實驗主要探索人臍血MSCs分離培養(yǎng)及分析其向成骨細(xì)胞分化的可行性。1 材料與方法1.1 材料主要試劑和儀器：Dulbecco改良培養(yǎng)基(DMEM)，胎牛血清（HYCLONE公司）；-甘油磷酸鈉、地塞米松（美國SIGMA公司）；Percoll分離液(P

7、HARMACIA公司)；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（博士德公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；CO2培養(yǎng)箱（SHELDONA公司）；AE31型倒置顯微鏡（MOTIC公司）。1.2 方法1.2.1 臍血MSCs的分離培養(yǎng)從胎盤臍靜脈穿刺抽取15ml臍血，肝素抗凝，加等量磷酸緩沖液稀釋，取50ml離心管，先加入15ml密度1.077g/ml的Percoll梯度分離液，小心加入稀釋后的臍血，2000r/min離心25min后，用吸管吸取分層界面的白色環(huán)形絮狀物（富含單個核細(xì)胞），800r/min離心洗滌2次，5min/次，沉積細(xì)胞用含15胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素的DMEM高糖

8、培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L，接種于25T的培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置在37、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育72h后更換培養(yǎng)基，去除紅細(xì)胞及其他未貼壁細(xì)胞，以后視細(xì)胞生長情況平均三四天換液1次。1.2.2 臍血MSCs的傳代培養(yǎng)MSCs約于7周相互匯合達(dá)培養(yǎng)瓶底7080的生長表面，此時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒掉舊培養(yǎng)基，加入2ml 0.25的胰酶消化，作用30s后棄掉大部分，留置少許于瓶中，適當(dāng)用力振蕩培養(yǎng)瓶，整瓶細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中5min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞解離程度，以細(xì)胞突起縮回、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞近乎圓形為度，加入含15胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，用吸

9、管輕柔吹打瓶底，收集細(xì)胞，800r/min離心洗滌2次，每次5min，接種于置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中。1.2.3 MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)取第56代細(xì)胞按密度為5×104/ml接種于6孔培養(yǎng)板(孔內(nèi)置無菌蓋玻片)中，第2天換液，其中半數(shù)培養(yǎng)孔用誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)液(5FCS的DMEM含10mmol/L-甘油磷酸鈉；10nmol/L地塞米松；50mg/L維生素C)進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)液1次，并觀察細(xì)胞形態(tài)特征。1.2.4 成骨細(xì)胞檢測1.2.4.1 形態(tài)學(xué)觀察誘導(dǎo)后，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，特別注意其形態(tài)的改變，記錄可見變化特征及其出現(xiàn)時間，拍照。1.2.4.2 ALP染色誘導(dǎo)培養(yǎng)56

10、天的細(xì)胞長滿玻片時，取出玻片，用10%中性福爾馬林溶液固定，按ALP試劑盒說明書行ALP免疫組化染色。對照染色，以正常羊血清替代一抗進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察臍血間充質(zhì)干細(xì)胞接種24h，僅見少量梭形貼壁細(xì)胞，近似圓形或短梭形，48h后貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞漸變長，3天后換液除去絕大部分懸浮細(xì)胞，可見分散的間充質(zhì)干細(xì)胞小集落，集落細(xì)胞呈放射狀生長。隨著培養(yǎng)時間延長細(xì)胞集落逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，2周后細(xì)胞集落彼此融合，呈旋渦狀或菊花狀生長。傳代后3周細(xì)胞基本融合成層（見圖1）。MSCs經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)由長梭形漸變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫?、三角?見圖2)。2.2 AL

11、P免疫組化染色可見胞漿中出現(xiàn)大量棕褐色顆粒（見圖3）。對照染色細(xì)胞胞漿未見著色。3 討論骨組織工程的種子細(xì)胞來源主要有成骨細(xì)胞和MSCs等。成骨細(xì)胞雖然具有良好的成骨活性，但來源有限，大量分離獲取困難，體外大量擴增的潛力不足，故不能滿足骨組織工程臨床應(yīng)用的需要；MSCs不僅具有良好的成骨細(xì)胞分化潛能和高成骨活性，而且具有強大的增殖潛能。目前，MSCs主要來源于骨髓，但由于骨髓源性MSCs存在高度病毒污染的可能，且隨著年齡增長其細(xì)胞數(shù)量和擴增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢，故尋找一種能替代骨髓MSCs，并可彌補其缺陷的間充質(zhì)干細(xì)胞來源，已越來越受到各國學(xué)者的關(guān)注。HUCB是胎兒出生時臍帶內(nèi)及胎盤近胎

12、兒一側(cè)血管內(nèi)的血液，含有豐富的干細(xì)胞，主要包含造血干細(xì)胞和MSCs。臍血中的MSCs可在體外培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化后能成為神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞14等。與骨髓相比，臍血有更充足的來源，臍帶血中干細(xì)胞含量豐富，明顯超過成人外周血含量，相當(dāng)或超過成人骨髓中的含量5。由于MSCs具有多方向分化潛能，如何定向誘導(dǎo)其成骨分化是解決骨組織工程中種子細(xì)胞來源的一個前提。本實驗采用Rosada等6描述的成骨誘導(dǎo)方法，即用地塞米松、維生素C和-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，在傳代的MSCs中加入誘導(dǎo)劑后，細(xì)胞逐漸增大，細(xì)胞形態(tài)由長梭形漸變?yōu)槎噙呅位蛄⒎叫巍⑷切?，隨著誘導(dǎo)時間的延長，細(xì)胞逐漸匯合呈鋪路石狀，形態(tài)向成骨

13、細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。ALP是成骨細(xì)胞分化成熟的重要標(biāo)志，是參與骨組織形成、代謝及再生的重要物質(zhì)，ALP能水解有機磷酸酶，使局部磷酸根濃度增高，而且可破壞鈣化抑制劑，從而啟動鈣化，完成基質(zhì)礦化過程，發(fā)揮在體外鈣化過程中的關(guān)鍵性作用。本實驗經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后的MSCs，ALP染色為陽性，而相應(yīng)對照組均為陰性。這證明用地塞米松、維生素C和-甘油磷酸鈉聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs后具有成骨活性，即相當(dāng)一部分MSCs經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后已經(jīng)誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，我們的研究結(jié)果與許多學(xué)者研究結(jié)果一致6,7。 本實驗證實從人臍血中獲取MSCs，在條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)下，短期內(nèi)可獲得大量有成骨能力的細(xì)胞，該細(xì)胞具有明確的成骨生物學(xué)活性，是種子

14、細(xì)胞的理想來源。骨科臨床上，創(chuàng)傷和骨病等引起的大段骨缺損的修復(fù)一直是個棘手的難題。最佳方法是自體骨移植，但對于大段骨缺損而言，存在取骨量有限和取骨處創(chuàng)傷的問題；而異體骨移植則有免疫排斥反應(yīng)等缺陷，并有傳播疾病的潛在風(fēng)險。用組織工程學(xué)的方法構(gòu)建人工骨是目前的研究熱點。其基本思路是將具有成骨潛能的種子細(xì)胞結(jié)合到人工骨支架材料，在骨生長因子的作用下生成新骨用于臨床。因此尋找合適的種子細(xì)胞，提高組織工程化人工骨的成骨效能具有重大意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Hou L, Cao H, Wang D, et al. Induction of umbilical cord blood mesenchymal st

15、em cells into neuron-like cells in vitro J. Int J Hematol,2003,78(3):256-261.2候玲玲，曹華，魏國榮,等.人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴增和向神經(jīng)元樣細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的研究J.中華血液雜志,2002，23（8）：415-419.3Kadner A, Hoerstrup SP, Tracy J, et al. Human umbilical cord cells: a new cell source for cardiovascular tissue engineering J. Ann Thorac Surg,2004,74(4):1422-1428. 4農(nóng)丕地,解繼勝,黃海玲.體外誘導(dǎo)人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的初步研究J.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2007,29(5):689-691.5沈柏鈞.人類臍血基礎(chǔ)與臨床M.天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2000:157-176.6Rosada C, Jus tesen J, Melsvik D, et al. The human umbilical cord blood: a potential source for osteoblast progenitor cells J. Calcif Tissue Int,20