單倍體技術(shù)在玉米育種上的應(yīng)用研究進(jìn)展

1、單倍體技術(shù)在玉米育種上的應(yīng)用研究進(jìn)展摘要：介紹了單倍體技術(shù)在作物育種中應(yīng)用的概況，特別是在玉米育種中，對(duì)如何獲得單倍體，如何進(jìn)行單倍體的鑒別和加倍等問題進(jìn)行了綜述。并介紹了stock6及其衍生的幾個(gè)玉米單倍體誘導(dǎo)系【1】，評(píng)述了單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：玉米; 單倍體; 育種前言近年來，玉米在糧食中的地位越來越重要。我國飼料、加工、能源等行業(yè)對(duì)玉米消費(fèi)量的迅速增加，國內(nèi)外市場(chǎng)供求關(guān)系日趨緊張。為了適應(yīng)市場(chǎng)的需求，2005 年我國玉米面積已擴(kuò)大到2630萬公頃，總產(chǎn)達(dá)1.38 億噸，單產(chǎn)352公斤。但據(jù)預(yù)測(cè)，2010 年我國玉米總需求約1.66億噸。長(zhǎng)期以來，我國玉米育種主要依靠

2、常規(guī)技術(shù)，培育優(yōu)良自交系和新品種很大程度上取決于育種家的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，育種周期長(zhǎng)、偶然性大、效率低，主要依賴國外種質(zhì)資源和技術(shù)，自主的種質(zhì)創(chuàng)新、技術(shù)研發(fā)等方面十分缺乏，相關(guān)種子產(chǎn)業(yè)發(fā)展不穩(wěn)定，已不能滿足當(dāng)前玉米生產(chǎn)對(duì)優(yōu)良新品種的需求。玉米育種的成功在很大程度上取決于選育方法和選擇的正確性。選育高產(chǎn)、高抗、高配合力的“三高”優(yōu)良自交系【2】,是玉米育種的核心環(huán)節(jié)。常規(guī)的育種方法選育自交系,獲得一個(gè)純系的時(shí)間平均大約需要6 a左右時(shí)間期限長(zhǎng),耗費(fèi)大量的人力和物力。單倍體育種技術(shù)直接利用配子體進(jìn)行選擇,提高有利基因型的入選頻率,大大縮短自交系的選育年限。在國外已經(jīng)投入了大量的人力、物力、財(cái)力進(jìn)行了卓有成

3、效的研究工作。單倍體技術(shù)在自交系的選育過程中已經(jīng)是主要的、常規(guī)的方法之一,綜述單倍體技術(shù)的應(yīng)用與研究進(jìn)展,促進(jìn)單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用十分必要。1 關(guān)于單倍體的幾個(gè)基本問題單倍性（haploid）變異【3】是指同一物種中出現(xiàn)體細(xì)胞只具有配子染色體數(shù)目（n）的變異（劉大鈞，1998）攜有配子染色體數(shù)目的個(gè)體稱為單倍體。被子植物中單倍體現(xiàn)象是很廣泛的。Katayama（1935）以細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)為依據(jù)，提出了為單倍體分類的方法，即根據(jù)原始個(gè)體的倍數(shù)性水平，把所有單倍體分為兩個(gè)基本類型：一倍體是從具有二倍染色體數(shù)的個(gè)體所產(chǎn)生的單倍體；多倍單倍體是從具有多倍染色體數(shù)的個(gè)體所產(chǎn)生的單倍體。霍赫洛夫等

4、（1970）根據(jù)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)所決定的單倍體的遺傳結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，給出如下的單倍體分類：母性單倍體。從減數(shù)卵細(xì)胞或由有機(jī)體的母本有性組織【4】（胚囊）的細(xì)胞發(fā)育而成的單倍體，具有來自同一個(gè)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。雄核發(fā)育單倍體。從卵細(xì)胞或胚囊的任何其它細(xì)胞發(fā)育而來，其染色體被外來精子的染色體所代換，這類單倍體具有質(zhì)核雜種的性質(zhì)?；ㄋ巻伪扼w。從雄性的（花粉粒）細(xì)胞發(fā)育而來，具有同一個(gè)體的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。不同類型的單倍體其基因型的特性是不同的，母性單倍體和花藥單倍體都具有來自同一個(gè)體的染色體和細(xì)胞質(zhì)；而雄核發(fā)育單倍體則不同，它是從父本獲得染色體，從母本獲得細(xì)胞質(zhì)。弄清這種差異對(duì)于在育種和遺傳中有效地利用單

5、倍體技術(shù)將會(huì)大有幫助。2如何獲得單倍體2.1 自然發(fā)生的單倍體 在自然界，大多數(shù)生物是二倍體，而動(dòng)物幾乎都是二倍體。在植物中，大多數(shù)低等植物的生命周期的主要階段是單倍體，是由配子（孢子）直接產(chǎn)生的，不會(huì)出現(xiàn)不育性問題。高等植物自然發(fā)生的單倍體，一般是由于生殖過程異常所引起的孤雌或孤雄生殖而來的。由于高等植物中的單倍體高度不育，其植株和它的組織器官等都比它們的二倍體和雙倍體弱小，所以，在自然界存在的單倍體很少。2.2 人工誘變單倍體2.2.1 遠(yuǎn)緣雜交 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的花粉一般很難與母本卵細(xì)胞發(fā)生受精作用,但卻具有刺激卵細(xì)胞的作用,使其單性發(fā)育成為單倍體或雙倍體。在玉米遠(yuǎn)緣雜交過程中,可能由于雙親

6、體細(xì)胞分裂周期的不同步,導(dǎo)致某一親本染色體的丟失,從而引起單倍體的發(fā)生。朱慶麟等（1979）用失活花粉、衰老而喪失受精能力的花粉、無授粉能力的幼嫩花粉及異種花粉誘發(fā)玉米孤雌生殖,誘導(dǎo)率較低,而用向日葵、南瓜和棉花花粉混合給玉米授粉,誘導(dǎo)率比分別授粉高。遠(yuǎn)緣花粉誘導(dǎo)孤雌生殖【5】效果不穩(wěn)定,不同材料的變異很大。2.2.2 孤雌生殖利用異種花粉授粉，刺激未受精卵發(fā)育引起孤雌生殖產(chǎn)生單倍體；利用X或紫外線來處理玉米成熟花粉粒，并用輻射過的花粉給正常植株授粉，讓已無授精能力的花粉去刺激未受精的卵細(xì)胞單性發(fā)育成單倍體的胚；利用甲苯胺藍(lán)（TB）【6】處理花粉也能產(chǎn)生單倍體。2.2.3 孤雄生殖 孤雄生殖就

7、是花藥離體培養(yǎng)。以單核期的花藥為材料,利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)其分裂形成愈傷組織或胚狀體,再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基形成再生苗,然后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根,形成單倍體植株。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是：要經(jīng)過組織培養(yǎng)的過程，先誘導(dǎo)愈傷組織，再分化形成再生植株，并非每個(gè)小孢子都能無性增殖。此外，二倍體化以后，因適應(yīng)性問題而出現(xiàn)生長(zhǎng)或結(jié)實(shí)的困難?；ㄅ嘤N效率不高，除了受基因型影響外，綠苗誘導(dǎo)率低和染色體加倍的困難也是原因之一。2.2.4 核質(zhì)互作 據(jù)報(bào)道，在小麥中連續(xù)回交進(jìn)行核置換時(shí)，發(fā)現(xiàn)單倍體出現(xiàn)的頻率極高（53%-93.8%）Mukai（1983）認(rèn)為，這是由于1BS上抑制單倍體發(fā)生的基因隨著1BS被1RS代換而丟失，

8、而1RS不能補(bǔ)償1RS在這方面的功能。該途徑產(chǎn)生單倍體的頻率雖然很高，但是在單倍體二倍體化后依然是雄性不育，在育種中難以利用。2.2.5 利用單倍體誘導(dǎo)系雜交獲得玉米單倍體 利用遠(yuǎn)緣雜交、孤雌生殖、孤雄生殖等誘導(dǎo)產(chǎn)成單倍體的方法均有各種不足,無法使單倍體技術(shù)廣泛的應(yīng)用于玉米育種。利用單倍體誘導(dǎo)系作親本雜交時(shí),能顯著提高另一親本產(chǎn)生單倍體的頻率。 1950年美國的Northrup King種子公司發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高頻誘導(dǎo)單倍體的材料，為早熟、白色、粉質(zhì)、硬粒型的玉米，送給威斯康辛大學(xué)作遺傳研究。Ed Coe(1956)發(fā)現(xiàn)這份材料有利用的價(jià)值，并導(dǎo)入了控制子粒性狀和植株性狀的兩種顯性標(biāo)記基因(R-nj

9、、Pl)，有經(jīng)過兩次回交和兩次自交，然后定名為Stock6。它具有兩個(gè)標(biāo)記性狀：子粒Navajo斑紋【7】，是由A1A2C1C2R-nj互補(bǔ)基因控制；成株葉片和葉鞘呈紫色，是由AIA2C2BP1互補(bǔ)基因控制。 Stock6誘導(dǎo)單倍體的原理是選擇受精，即Stock6花粉粒中的兩個(gè)精核，在受精過程中運(yùn)行的速度不同，往往形成兩種不同的單受精形式。一種是兩個(gè)精核中的一個(gè)優(yōu)先進(jìn)入卵細(xì)胞與卵核結(jié)合，另一個(gè)精核由于某種原因死亡，形成紫胚芽尖、非紫粒頂?shù)亩扼w籽粒。另一種是兩個(gè)精核中的一個(gè)，與兩個(gè)極核選擇受精，另一個(gè)精核死亡，形成紫粒頂、無色胚芽尖的單倍體籽粒。在育種中用Stock6 作父本，被誘導(dǎo)的育種材料

10、作母本，大約有3%的單倍體。此外，Kermicle發(fā)現(xiàn)的ig基因【8】，chase的A358，Trynov和Zavalishina使用的ZMS,Chalyk使用的MHI及中國農(nóng)業(yè)大學(xué)宋同明使用的農(nóng)大高誘一號(hào)等, 它們都可以產(chǎn)生3%左右的單倍體。在這些材料中目前利用最多的是Stock6單倍體技術(shù)，用Stock6單倍體宣布與技術(shù)選育自交系只需2-3代就可以育出新系。Stock6與基礎(chǔ)材料雜交時(shí)，必須用Stock6做父本。雜交穗數(shù)一般是100穗以上!以保證單倍體的發(fā)生率。不同的材料和環(huán)境，單倍體發(fā)生率有所不同，一般為1%-5%，自然加倍率為10%左右。1987年張銘堂博士用此技術(shù)獲得249個(gè)雙單倍體

11、純系，并已育成2玉米個(gè)自交系，并配出優(yōu)良雜交種。1993年張銘堂博士用Stock6做父本，與杜邦公司的高油玉米雜交種雜交，獲得300多個(gè)純系。張銘堂用Stock6做父本，誘導(dǎo)單交種Oh43×Mo17，共獲得660個(gè)雜交果穗，305110粒種子，經(jīng)籽粒標(biāo)記選擇，最后獲得249個(gè)雙單倍體純系，經(jīng)過同工酶分析【9】、形態(tài)性狀鑒別和產(chǎn)量測(cè)試后，2份優(yōu)良自交系作為高產(chǎn)雜交種的親本進(jìn)入市場(chǎng)銷售。我國的學(xué)者對(duì)Stock6作了有效的改造，劉志增從BHO/Stock6的自交后代中育成了我國第一個(gè)孤雌生殖誘導(dǎo)系-高誘1號(hào)，其誘導(dǎo)率可高達(dá)5.8%，比Stock6高出5倍，已經(jīng)用于育種實(shí)踐。目前許多育種單位

12、也都嘗試著應(yīng)用Stock6進(jìn)行自交系選育。3 單倍體的鑒定方法3.1 細(xì)胞遺傳學(xué)方法 最準(zhǔn)確的方法是用根尖分生組織壓片觀察體細(xì)胞中或減數(shù)分裂細(xì)胞中的染色體數(shù)目，可區(qū)分整倍單倍體和非整倍單倍體。利用光度計(jì)法分析細(xì)胞核中DNA含量，但不能區(qū)分整倍單倍體和非整倍單倍體，又由于該法檢測(cè)速度慢和需要儀器設(shè)備，不適合在田間進(jìn)行大批量地鑒定。3.2 形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)方法利用植株、種子形態(tài)學(xué)的明顯差異是鑒定單倍體最直觀、經(jīng)濟(jì)、便捷的方法，在幼苗期可以用目測(cè)選出大部分的單倍體。 單倍體在正常生長(zhǎng)狀態(tài)下常常比它的標(biāo)準(zhǔn)類型小得多；在解剖學(xué)上觀察葉片表皮氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞的大小和數(shù)目，也可以區(qū)分單倍體和二倍體。3.3 射線

13、照射法植物對(duì)輻射的敏感性隨著倍數(shù)性的變化而變化是生物學(xué)的一般規(guī)律?；痉椒ㄊ怯秒婋x射線照射，如6射線)葉片的一部分，先看到褪綠，而后出現(xiàn)輻射壞死。關(guān)鍵是要探索出不同作物的最適劑量和照射時(shí)間，如果掌握的好，該法可成為最簡(jiǎn)便和實(shí)用的鑒定方法之一。3.4 遺傳標(biāo)記法 利用遺傳標(biāo)記是目前最簡(jiǎn)便有效的單倍體鑒定方法。 在玉米中，著名的Navajo標(biāo)記基因R-nj，是利用較成功的。Coe的Stock6和宋同明的高誘1號(hào)單倍體誘導(dǎo)系，導(dǎo)入了籽粒和植株顯色的遺傳標(biāo)記基因。由單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)出的子粒分三種類型：胚乳糊粉層呈現(xiàn)紫色或紫紅色%胚芽部位也呈現(xiàn)、紫色或紫紅色；胚乳糊粉層呈現(xiàn)紫色或紫紅色標(biāo)記，胚芽部位無色

14、；胚乳糊粉層和胚芽部位均不顯色（無標(biāo)記）。 張銘堂（1998）報(bào)道：第一、第三類型的子粒占絕大多數(shù)，為二倍體子粒；第二類型子粒所占的比例很小，為單倍體子粒。根據(jù)子粒的顏色標(biāo)記特征，對(duì)單倍體做出初步判斷之后，還可在田間根據(jù)植株ABP1紫色標(biāo)記【10】對(duì)單倍體做出進(jìn)一步的判別：凡幼苗葉鞘全部為紫色者不是單倍體。在拔節(jié)期，單倍體植株大多表現(xiàn)出生長(zhǎng)緩慢、植株矮小、葉片短和顏色淺等特點(diǎn)； 此外，玉米植株的育性也是鑒別玉米單倍體的一個(gè)重要指標(biāo)。玉米的單倍體植株由于只含有一套染色體組，通常都是雄性不育或育性很低。 綜上所述，單倍體的鑒定方法很多，但是運(yùn)用之妙存乎一心。在育種實(shí)踐中，結(jié)合育種家的經(jīng)驗(yàn)，靈活運(yùn)用

15、諸方法，無疑是成功的關(guān)鍵。4 單倍體的二倍體化方法 在使用單倍體誘導(dǎo)系選系程序中，單倍體個(gè)體必須加倍成為二倍體才能產(chǎn)生可育后代，單倍體的加倍頻率直接關(guān)系到單倍體育種的效率。加倍方法主要有自然加倍和人工加倍兩種方法。4.1 自然加倍 Chase研究表明：在一般情況下單倍體植株表現(xiàn)為雌雄不調(diào)，正?；ǚ哿：苌伲詥伪扼w自然加倍的頻率僅占全部單倍體植株的10%左右，Chalyk研究發(fā)現(xiàn)單倍體植株在生長(zhǎng)發(fā)育的過程中，只有0.4%-1.2%的植株可以自然加倍成二倍體。Zabirova等認(rèn)為許多材料自然加倍率低于2%。也有的材料不發(fā)生自然加倍?？梢妰H依靠單倍體的自然加倍難以滿足育種實(shí)踐的要求，必需對(duì)其進(jìn)行

16、人工加倍!以提高其育性，通過自交以獲得更多的純合二倍體種子，以便從中選育出優(yōu)良的自交系。4.2 人工加倍 單倍體的人工加倍，目前主要是利用秋水仙素處理單倍體的根尖或莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)?；旧嫌?種方式：處理萌發(fā)的種子，處理根尖，處理莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。其中效果較好的是第二和第三種方式。處理根尖，在實(shí)際操作中會(huì)受到一些限制，而處理頂端分生組織較為方便，可采用微量注射【11】和涂抹。劉志增等在拔節(jié)期將0.1ml的不同濃度（0.01%、0.05%、0.10%）的秋水仙素注射到莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)偏下的組織中，結(jié)果在0.01%低濃度下效果最好，隨著濃度的提高，受害植株的數(shù)量也在增加。Gagen.P【12】等用不同濃度（0.03

17、%、0.06%、0.10%）的秋水仙素，在兩個(gè)不同溫度（18和25）下分別對(duì)單倍體的種子和幼苗進(jìn)行不同時(shí)間（6h、12h、24h）的處理，結(jié)果證明，在18左右的溫度下，用0.06%的秋水仙素處理12h，單倍體加倍的百分率為18.05%；張銘堂認(rèn)為，如果扣除自然加倍的頻率，人工化學(xué)加倍的效果尚不十分顯著。此外!我們不能忽略環(huán)境條件對(duì)單倍體加倍效果的影響。所以，有效的單倍體加倍方法是單倍體技術(shù)能否在作物育種中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵問題之一。5 單倍體在玉米育種中的應(yīng)用 單倍體技術(shù)選育玉米自交系在國外已經(jīng)廣泛使用,目前國外大約60%的馬齒型自交系【13】，30%的硬粒型【14】自交系由單倍體技術(shù)選育出來。在

18、我國最早開展此項(xiàng)研究的是中科院遺傳所,通過孤雌生殖技術(shù),在不到20天里育成3000多個(gè)孤雌生殖純系,其中綜合性狀優(yōu)良或個(gè)別性狀突出,可直接或者間接用于育種的近350個(gè),此外近幾年中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院、山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等也都先后從事了這方面的研究,目前也都育成了多個(gè)性狀較優(yōu)良的DH系，并且選育出多個(gè)優(yōu)良組合參加國家級(jí)和省級(jí)區(qū)域試驗(yàn),有的組合已經(jīng)通過審定并在生產(chǎn)上推廣。6 玉米單倍體育種存在的問題及發(fā)展前景 玉米雙單倍體育種技術(shù)是一項(xiàng)革新育種技術(shù)。利用單倍體育種方法，可以大大縮短育種年限、加快育種進(jìn)程、降低育種成本，在玉米商業(yè)育種中的應(yīng)用前景

19、是十分廣闊。其技術(shù)體系開發(fā)利用方興未艾，在美國早已投入商業(yè)育種。目前我國尚處于技術(shù)熟化改良階段。 玉米雙單倍體育種當(dāng)前主要存在的三個(gè)問題：一是單倍體的誘導(dǎo)頻率不高，僅為3%難以獲得足夠數(shù)量的單倍體育種材料；二是單倍體二倍化率低，一般為10%；三是不能有效打破不良基因的連鎖，且基因間的重組率較低。 單倍體技術(shù)在玉米育種中的應(yīng)用前景十分誘人。如與種質(zhì)擴(kuò)增和新材料的創(chuàng)制緊密融合起來，先進(jìn)行優(yōu)良基因重組，聚合盡可能多有利基因，然后采用單倍體誘導(dǎo)技術(shù)快速獲得新型“三高”自交系，將極大提高育種效率和雜種優(yōu)勢(shì)水平。單倍體在遺傳學(xué)研究上具有重要的研究?jī)r(jià)值，可應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建【15】、基因定位及克隆。 通過

20、進(jìn)一步完善玉米單倍體誘導(dǎo)育種技術(shù)體系，進(jìn)一步提高單倍體誘導(dǎo)率【16】和染色體加倍率，建立成熟、配套的技術(shù)體系，無疑將實(shí)現(xiàn)玉米雜交育種的重大技術(shù)革新。 參考文獻(xiàn)1 趙延明,董樹亭,張鎖良,等.玉米單倍體育種技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展J.玉米科學(xué), 2007, 15(5): 60-642 韓贊平,王彬,張澤民.玉米的單倍體育種J.種子, 2010, 29(1): 120-1223 馬蘭.淺談?dòng)衩讍伪扼w的產(chǎn)生途徑J.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010(8): 16-174 陳紹江,宋同明.利用高油分的花粉直感效應(yīng)鑒別玉米單倍體J.作物學(xué)報(bào), 2003, 29(4): 587-5905 Chalyk S T.Prop

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