離子交換層析(共8頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上實(shí)驗(yàn)二離子交換層析純化兔血清 IgG 【原理】 DEAE-Sephadex A-50 （二乙氨基 - 乙基 - 葡萄糖凝膠 A-50 ）為弱堿性陰離子交換劑。用 NaOH 將 Cl - 型轉(zhuǎn)變?yōu)?OH - 型后，可吸附酸性蛋白。血清中的 球蛋白屬于中性蛋白（等電點(diǎn)為 pH6.85 7.5 ），其余均屬酸性蛋白。 pH7.2 7.4 的環(huán)境中。酸性蛋白均被 DEAE-Sephadex A-50 吸附，只有 球蛋白便可在洗脫液中先流出，而其他蛋白則被吸附在柱上，從而便可分離獲得純化的 IgG 。 【試劑與器材】 1. DEAE-Sephadex A-50 2.0.5mol

2、/L HCl 和 NaOH 3.0.1mol/L pH7.4 PBS 4.0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 5.0.02 NaN 3 6.PEG 7. 無(wú)水乙醇 8. 紫外分光光度計(jì) 9.1cm×20cm 玻璃層析柱 10. 自動(dòng)部分收集器 【操作步驟】 1 DEAE-Sephadex A-50 預(yù)處理 稱 DEAE-Sephadex A-50 （下稱 A-50 ） 5g ，懸于 500ml 蒸餾水內(nèi)， 1h 后傾去上層細(xì)粒。按每克 A-50 加 0.5mol/L NaOH 15ml 的比例，將浸泡于 0.5mol/L NaOH 液中，攪勻，靜置 30min ，裝入布

3、氏漏斗（墊有 2 層濾紙）中抽濾，并反復(fù)用蒸餾水抽洗至 pH 呈中性；再以 0.5mol/L HCl 同上操作過(guò)程處理，最后以 0.5mol/L NaOH 再處理一次，處理完后，將 A-50 浸泡于 0.1mol/L pH7.4 PBS 中過(guò)夜。 2 裝柱 （ 1 ）將層析柱垂直固定于滴定架上，柱底墊一圓形尼龍紗，出水口接一乳膠或塑料管并關(guān)閉開(kāi)關(guān)。 （ 2 ）將 0.1mol/L Tris-HCl(pH7.4) 沿玻璃棒倒入柱中至 1/4 高度，再倒入經(jīng)預(yù)處理并以同上緩沖液調(diào)成稀糊狀的 A-50 。待 A-50 凝膠沉降 2 3cm 高時(shí)，開(kāi)啟出水口螺旋夾，控制流速 1ml/min ，同時(shí)連續(xù)

4、倒入糊狀 A-50 凝膠至所需高度。 （ 3 ）關(guān)閉出水口，待 A-50 凝膠完全沉降后，柱面放一圓形濾紙片，以橡皮塞塞緊柱上口，通過(guò)插入橡皮塞之針頭及所連接的乳膠或塑料管與洗脫液瓶相連接。 3 平衡 啟開(kāi)出水口螺旋夾，控制流速 4 滴 /min ，使約 2 倍床體積的洗脫液流出。并以 pH 計(jì)與電導(dǎo)儀分別測(cè)定洗脫液及流出液之 PH 值與離子強(qiáng)度，兩者達(dá)到一致時(shí)關(guān)閉出水口，停止平衡。 4 加樣及洗脫 啟開(kāi)上口橡皮塞及下口螺旋夾，使柱中液體緩慢滴出，當(dāng)柱面液體與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉出水口，以毛細(xì)滴管沿柱壁加入樣品（ 0.5ml 血清，體積應(yīng)小于床體積的 2% ，蛋白濃度以 100mg 為宜）。松

5、開(kāi)出水口螺旋夾使面樣品緩慢進(jìn)入柱內(nèi)，至與柱面相切時(shí)，立即關(guān)閉下口，以少量洗脫液洗柱壁 2 3 次；再放開(kāi)出水口，使洗液進(jìn)入床柱，隨后立即于柱面上加入數(shù)毫升洗脫液，緊塞柱上口，使整個(gè)洗脫過(guò)程成一密閉系統(tǒng)。并控制流速， 4 滴 /min. 5 收集 開(kāi)始洗脫的同時(shí)就以試管進(jìn)行收集；每管收集 4ml. 共收集 10 15 管。 6 測(cè)蛋白 以 751 型紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定每管 A 260 ，按公式計(jì)算各管蛋白含量。并以 A 280 為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。 7 合并、濃縮 將洗脫峰的上坡段與下坡段各管收集液分別進(jìn)行合并，以 PEG （ Mw6000 ）濃縮至所需體積，加入 0.02 NaN 3

6、防腐，于 4 保存?zhèn)溆?。長(zhǎng)期保存時(shí)應(yīng)貯于 -40 冰箱。 8 A-50 凝膠的再生 在柱上先以 2mol/L NaCl 洗脫雜蛋白至流出液的 A 280 <0.02 ，再以蒸餾水洗去柱中鹽。然后按預(yù)處理過(guò)程將 A-50 再處理一遍即達(dá)再生。近期用時(shí)泡于洗脫緩沖液中 4 保存；近期不用時(shí)，以無(wú)水酒精洗 2 次，再置 50 溫箱烘干，裝瓶?jī)?nèi)保存。 離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡(jiǎn)稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動(dòng)相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時(shí)的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤

7、堿性物質(zhì)交換過(guò)程中發(fā)現(xiàn)離子交換現(xiàn)象。本世紀(jì)40年代，出現(xiàn)了具有穩(wěn)定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹(shù)脂。50年代，離子交換層析進(jìn)入生物化學(xué)領(lǐng)域，應(yīng)用于氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學(xué)領(lǐng)域中常用的一種層析方法，廣泛的應(yīng)用于各種生化物質(zhì)如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹(shù)脂 。 離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹(shù)脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹(shù)脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽(yáng)離子樹(shù)脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電

8、荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過(guò)提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將 吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來(lái)。反之陽(yáng)離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過(guò)逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來(lái)。 離子交換劑預(yù)處理和裝柱對(duì)于離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的顆粒，以保證有較好的均勻度，對(duì)于已溶脹好的產(chǎn)品則不必經(jīng)這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀堿處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用“堿-酸-堿”處理，使最終轉(zhuǎn)為-OH-型或鹽型交換劑；對(duì)于陽(yáng)離子交換劑則用“酸-堿-酸”處理，使最終轉(zhuǎn)為-H-型交換劑

9、。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時(shí)分層，要適當(dāng)加壓裝柱，同時(shí)使柱床壓緊，減少死體積，有利于分辨率的提高。柱子裝好后再用起始緩沖液淋洗，直至達(dá)到充分平衡方可使用。 加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應(yīng)與起始緩沖液有相同的pH和離子強(qiáng)度，所選定的pH值應(yīng)落在交換劑與被結(jié)合物有相反電荷的范圍，同時(shí)要注意離子強(qiáng)度應(yīng)低，可用透析、凝膠過(guò)濾或稀釋法達(dá)此目的。樣品中的不溶物應(yīng)在透析后或凝膠過(guò)濾前，以離心法除去。為了達(dá)到滿意的分離效果，上樣量要適當(dāng)，不要超過(guò)柱的負(fù)荷能力。柱的負(fù)荷能力可用交換容量來(lái)推算，通常上樣量為交

10、換劑交換總量的1-5。 洗脫：已結(jié)合樣品的離子交換前，可通過(guò)改變?nèi)芤旱膒H或改變離子強(qiáng)度的方法將結(jié)合物洗脫，也可同時(shí)改變pH與離子強(qiáng)度。為了使復(fù)雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強(qiáng)度，其中最簡(jiǎn)單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強(qiáng)度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由于這種洗脫pH與離子強(qiáng)度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時(shí)洗脫，純度較差，不適宜精細(xì)的分離。最好的洗脫方法是連續(xù)梯度洗脫，洗脫裝置見(jiàn)圖16-6.兩個(gè)容器放于同一水平上，第一個(gè)容器盛有一定pH的緩沖液，第二個(gè)容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個(gè)容器與柱相連，當(dāng)溶液由第一容器流入柱時(shí)，第二容器中的

11、溶液就會(huì)自動(dòng)來(lái)補(bǔ)充，經(jīng)攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時(shí)間的濃度都可用下式進(jìn)行計(jì)算： CC2（C2C1）（1V）A2/A1 式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對(duì)總體積之比。當(dāng)A1A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1A2時(shí)為凹形梯度，A1A2時(shí)為凸形梯度。 洗脫時(shí)應(yīng)滿足以下要求：洗脫液體積應(yīng)足夠大，一般要幾十倍于床體積，從而使分離的各峰不致于太擁擠。梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質(zhì)能被洗脫下來(lái)。梯度不要上升太快，要恰好使移動(dòng)的區(qū)帶在快到柱末端時(shí)達(dá)到解吸狀態(tài)。目的物的過(guò)早解吸，會(huì)引起區(qū)帶擴(kuò)散；而目的物的過(guò)晚解吸會(huì)使峰形過(guò)寬。 洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進(jìn)行測(cè)定，得到層析圖譜。依實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌刹捎眠m宜的檢測(cè)方法（生物活性測(cè)定、免疫學(xué)測(cè)定等）確定圖譜中目的物的位置，并目的物。 離子交換劑的與保存離子交換劑可在柱上。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強(qiáng)吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/LN