神經(jīng)系統(tǒng)中富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白

1、神經(jīng)系統(tǒng)中富含亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白    【關(guān)鍵詞】  神經(jīng)系統(tǒng)；富亮氨酸重復(fù)；蛋白相互作用；功能【摘要】 從細菌到哺乳動物，多種物種的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)都存在有一3D結(jié)構(gòu)為馬蹄形的富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)（LRR）蛋白，其主要在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞黏連，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等過程中起作用. 過去的幾年內(nèi)，在無脊椎動物及脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了許多具LRRs的蛋白，它們參與了多種神經(jīng)生理活動. 對這些蛋白的功能作進一步分析，有助于揭示該蛋白家族的分子作用機制，并對進一步認識神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等重要生理活動有所裨益.【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)系統(tǒng)；富亮氨酸重復(fù)；蛋白相互作用；功能隨著對神經(jīng)

2、系統(tǒng)發(fā)育研究的進展,目前發(fā)現(xiàn)了多種參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的基因、蛋白，近幾年內(nèi)，在研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中發(fā)現(xiàn)在果蠅及一些脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的多種蛋白均具有相同的結(jié)構(gòu)域富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域，目前已發(fā)現(xiàn)20多種具富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi).富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)（Leucinerich repeats，LRRs）是于1985年首次發(fā)現(xiàn)存在于人血清中一種未知功能的糖蛋白，富亮氨酸2糖蛋白（leucienrich 2glycoprotein） 1,目前已在多種組織中的60多個功能相異及細胞定位不同的蛋白中發(fā)現(xiàn)了富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu).富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)不同于被廣泛認識的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu). 亮氨酸拉鏈存在于寡聚

3、蛋白中，包括許多DNA結(jié)合蛋白，如cfos和cjun原癌基因產(chǎn)物. 亮氨酸拉鏈由重復(fù)的7個氨基酸殘基構(gòu)成，亮氨酸位于第7位氨基酸上. 這些亮氨酸位于其構(gòu)成的螺旋一側(cè)，其側(cè)鏈向外伸出，構(gòu)成狀如齒形排列的半拉鏈，與其異源的互補螺旋接觸后，可借助側(cè)鏈疏水性交錯對插，形成具有穩(wěn)定卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的二聚體，即亮氨酸拉鏈2. 富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)與富亮氨酸拉鏈唯一相似之處在于，兩者的保守亮氨酸殘基間都具有特定的間隔，并且這些亮氨酸無法被其他疏水性氨基酸所替代. 然而兩者間亮氨酸殘基間的距離不同，只有在羧基端（C端）的LRRs中的特定亮氨酸之間間隔有7個氨基酸. LRRs與亮氨酸拉鏈中的亮氨酸功能也完全不同，亮氨酸

4、拉鏈中的亮氨酸殘基參與了亮氨酸拉鏈的寡聚化形成，而LRR中亮氨酸只參與了結(jié)構(gòu)構(gòu)成，并不直接參與蛋白之間的作用.對含有LRRs蛋白的一級結(jié)構(gòu)分析顯示，LRRs 通常呈連續(xù)分布，有的蛋白只含有一個LRR，如血小板糖蛋白Ib，有的蛋白則含有多個LRR基序（motif），如Chaoptin則含有30個連續(xù)LRRs3. 不同蛋白中LRRs結(jié)構(gòu)長度可變，通常含有2029個氨基酸殘基，其中最常見的LRR結(jié)構(gòu)含有24個氨基酸殘基，它們都含有一個長度為11個氨基酸殘基的保守序列，排列為LxxLxLxxN/CxL(“x”可為任意氨基酸)，其中第1，4，6，11位氨基酸通常為亮氨酸(Leu)或其他脂肪族氨基酸，第9

5、位氨基酸為天冬氨酸Asp或半光胺酸Cys3. 結(jié)構(gòu)研究顯示LRRs的排列越規(guī)則其3D結(jié)構(gòu)也越規(guī)則. 當1，4，6，11位上的Leu被其他疏水性氨基酸如異亮氨酸，纈氨酸或苯丙氨酸所代替時，LRRs重復(fù)結(jié)構(gòu)會變得不規(guī)則4.人們對LRRs 3D結(jié)構(gòu)的認識來自對豬肝臟核糖核酸酶抑制因子（Ribonuclease Inhibitor, RI）X射線衍射分析5. RI為一種胞漿蛋白，其幾乎完全由15個連續(xù)的LRRs結(jié)構(gòu)組成，它可與包括催化位點在內(nèi)的核糖核酸酶表面的大部分區(qū)域牢固結(jié)合，從而起到抑制核糖核酸酶對RNA的剪切作用. 對核糖核酸酶抑制因子晶體結(jié)構(gòu)的研究揭示了LRR連續(xù)重復(fù)的3D結(jié)構(gòu)構(gòu)成，每一個獨立

6、的亮氨酸重復(fù)構(gòu)成一個獨立的單位，由一個短的折疊和一個螺旋組成，兩者近乎平行排列. 另外，每個連續(xù)重復(fù)的螺旋圍繞一個共同的軸，彼此也近乎平行地排列，構(gòu)成一個彎曲的馬蹄形結(jié)構(gòu)的外層，折疊圍繞此軸平行排列為片層結(jié)構(gòu)構(gòu)成馬蹄結(jié)構(gòu)的內(nèi)層（圖1）.正是LRR蛋白的這種馬蹄狀結(jié)構(gòu)的特性，使得其容易和較小的球狀蛋白相結(jié)合，并可增強它們之間的親和力和相互作用. 目前已知的LRR蛋白除具有重復(fù)結(jié)構(gòu)的相似處之外，其另一個共同的特點就是富含亮氨酸重復(fù)序列蛋白質(zhì)的LRR結(jié)構(gòu)域為與其他蛋白相互作用的結(jié)合區(qū). LRR蛋白主要在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細胞黏連，發(fā)育，DNA修復(fù)、重組、轉(zhuǎn)錄，以及RNA加工等方面起作用. 它們分布廣泛，從細

7、菌到哺乳動物中都有存在，并且在多種組織以至細胞器中也有發(fā)現(xiàn). 過去的幾年內(nèi)，在無脊椎動物及脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種具LRRs的蛋白(表1). 而我們最感興趣的正是這些存在于神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的LRR蛋白.表1神經(jīng)系統(tǒng)中含有富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)的蛋白（略）我們對上述這些蛋白進行了初步的結(jié)構(gòu)及功能域分析，以及細胞定位分析，結(jié)果顯示這些蛋白中絕大部分位于細胞膜上，只有Slit蛋白分泌到胞外，LANP蛋白定位到核內(nèi)（圖2），在整個蛋白序列中，LRR 結(jié)構(gòu)域均位于蛋白的N端且占整個蛋白結(jié)構(gòu)的絕大部分. 它們通過LRR結(jié)構(gòu)與相應(yīng)的配體或受體蛋白結(jié)合、相互作用，從而在胚胎發(fā)育，神經(jīng)發(fā)育，細胞極化，基因表達調(diào)控，信號

8、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮作用.將上述蛋白與典型的LRR蛋白核酶/血管生成素抑制因子一同進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果顯示，這些富含LRR結(jié)構(gòu)域的蛋白主要分為三個系統(tǒng)發(fā)生群. 不同種屬來源的LRR結(jié)構(gòu)域散布于這三個系統(tǒng)發(fā)生群中，揭示這些蛋白有可能由一個或幾個共同的祖先進化而來(圖3).上述發(fā)現(xiàn)的LRR蛋白有多種位于果蠅（Drosophila）的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，它們大多參與細胞細胞相互作用，多作為細胞黏連分子，在神經(jīng)發(fā)育過程中扮演重要角色. 我們在這里對上述蛋白進行一下簡單的介紹.Toll果蠅Toll基因編碼一個跨膜蛋白,由803個氨基酸組成的19個富含亮氨酸重復(fù)序列的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和269個氨基酸組成的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成.

9、其中,17個潛在的糖基化位點和17個半胱氨酸殘基均分布于胞外 (圖2). 自合子期起，Toll蛋白表達貫穿于果蠅胚胎發(fā)育的整個過程，其主要分布于胚胎的腹側(cè)，在胚胎發(fā)育的后期，主要使肌肉組織形成的過程中，其表達量明顯升高. 當RP3或其他運動神經(jīng)元生長錐伸經(jīng)肌細胞時，生長錐表面會表達大量Toll蛋白，其作用為支配突觸末梢的肌細胞，當神經(jīng)肌肉接頭形成后，Toll表達量隨之下降. 在Toll缺失突變體中，RP3生長錐有時會錯誤支配非目的靶肌細胞. 此外，在非Toll表達期人為表達Toll蛋白，雖然能促使生長錐到達正確的目的細胞，但是會抑制神經(jīng)肌肉接頭的形成. 因此認為，Toll局部作用并制約特定運動

10、神經(jīng)元生長錐支配其目的細胞，其時空表達調(diào)控對其在胚胎發(fā)育過程中的作用十分重要6.Slit在果蠅、線蟲、大鼠和人類等均發(fā)現(xiàn)Slit基因的存在，它是由發(fā)育期神經(jīng)管的腹側(cè)中線膠質(zhì)細胞分泌的一組Mr為170000190000的分泌型糖蛋白，分布于膠質(zhì)細胞表面并在所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突表面低水平表達，如果缺乏會導(dǎo)致縱行傳導(dǎo)路和交叉(連合)神經(jīng)元軸突在中線的異常聚集. 其結(jié)構(gòu)從氨基末端到羧基末端有一段N端短的信號肽序列，4個富亮氨酸重復(fù)(LRRs)序列,79個EGF重復(fù)序列,一個層粘素(laminin) G序列和一個C末端富含的胱氨酸的序列，相對于EGF或G序列，LRR結(jié)構(gòu)域幾乎構(gòu)成了Slit蛋白的絕大部分

11、結(jié)構(gòu). Slit可結(jié)合于軸突及生長錐表面的3種Roundabout受體（Robo，Robo2，Robo3）（圖2），研究表明，Slit/ Robo參與多種軸突導(dǎo)向過程，其主要功能在于對軸突的排斥性導(dǎo)向作用，并能促進軸突的分枝和延伸及引導(dǎo)神經(jīng)細胞的遷移7.體外研究表明，LRR結(jié)構(gòu)域是Slit作為排斥信號的必需結(jié)構(gòu). 編碼LRR結(jié)構(gòu)域的單個氨基酸發(fā)生點突變即可降低Slit的排斥作用，轉(zhuǎn)基因顯示主要是該結(jié)構(gòu)域影響軸突的導(dǎo)向. 實驗證明，Slit和Robo的結(jié)合及排斥作用需要LRR結(jié)構(gòu)域的存在，LRR缺失后，Slit無法與Robo相結(jié)合8.Connectin果蠅Connectin蛋白,屬于具有LRR重

12、復(fù)的細胞細胞黏附分子家族,它含有一個信號肽，10個LRR結(jié)構(gòu)域，依靠糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞外膜上（圖2），可作為吸引或排斥特定神經(jīng)細胞的分子,參與運動神經(jīng)元生長錐導(dǎo)向及突觸形成. 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Connectin最初表達于果蠅腹側(cè)的8塊肌肉組織以及支配這些肌肉的運動神經(jīng)元表面，以及沿運動神經(jīng)元軸突伸展路徑上的膠質(zhì)細胞表面. 在突觸形成過程中，Connectin蛋白定位于神經(jīng)肌肉接頭形成時的突觸上，突觸形成后，則檢測不到Connectin的表達. 此外，Connectin還具有促使同型細胞黏連的作用，在肌肉發(fā)育的早期表達于成肌細胞，并促使這些成肌細胞成束化. 在運動神經(jīng)元的軸突生長

13、錐延伸經(jīng)過外周神經(jīng)系統(tǒng)時，Connectin蛋白還表達于兩種膠質(zhì)細胞PG1和PG3內(nèi). Connectin主要通過同型細胞黏附，協(xié)調(diào)細胞間相互作用，從而在靶位點識別中起到重要作用9.Capricious在果蠅胚胎發(fā)育后期，運動神經(jīng)元軸突生長錐到達靶目標區(qū)域時，會一度搜尋多個可能的靶位點的肌細胞表面，但只會和其中的一個正確靶細胞建立穩(wěn)定的突觸聯(lián)系，果蠅體內(nèi)Capricious（caps）基因即調(diào)控此過程. caps編碼一含有14個LRRs結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，其胞外區(qū)幾乎完全由14個LRRs及其N端、C端側(cè)翼結(jié)構(gòu)構(gòu)成（圖2）. CAPS蛋白定位于發(fā)育期的運動神經(jīng)元表面，在神經(jīng)肌肉接頭形成過程中，ca

14、ps表達于很少數(shù)目的突觸后靶目標肌肉中，以及表達于支配這些肌肉的運動神經(jīng)元中. 體內(nèi)研究顯示，當位于其第一個外顯子內(nèi)蹬LRRs編碼區(qū)缺失突變后，運動神經(jīng)元對靶目標選擇的特異性就會發(fā)生改變，顯示caps具有調(diào)控特異性突觸形成的作用，其可能通過LRRs結(jié)構(gòu)域調(diào)控突觸靶位點的識別10.Tartan果蠅Tartan蛋白為一跨膜蛋白，胞外區(qū)由10個LRR結(jié)構(gòu)域及其N端，C端側(cè)翼結(jié)構(gòu)組成，占整個蛋白結(jié)構(gòu)的絕大部分，近接為跨膜區(qū)和短的胞內(nèi)區(qū). Tartan的表達與果蠅胚胎幼蟲分節(jié)發(fā)育，神經(jīng)發(fā)生相關(guān)，它參與了神經(jīng)母細胞，感覺母細胞以及外周神經(jīng)的形成過程，其表達幾乎貫穿了胚胎發(fā)育的整個過程. tartan等位基

15、因缺失突變體會導(dǎo)致隱性致死，造成周圍感覺器官內(nèi)細胞位置和數(shù)目的缺陷，影響外周神經(jīng)的投射，并造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)連合的組織錯誤. 其缺失突變還可影響到肌肉組織的排列11.Chaoptin果蠅Chaoptin蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的具有LRR結(jié)構(gòu)域最多的蛋白，其幾乎完全由41個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域組成（圖2）. 其作為一種特異性細胞黏附分子，為光感神經(jīng)元特異性的黏附分子，在成體果蠅復(fù)眼中，Chaoptin表達于光感神經(jīng)元胞體、軸突，起光導(dǎo)作用的微絨毛，以及視神經(jīng)纖維的細胞膜上，它還表達于單眼及果蠅幼蟲的光感組織中，通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定在細胞膜上. 其功能是作為細胞黏附分子，參與視神經(jīng)的發(fā)育過程

16、，尤其是對視桿微絨毛的排列組成發(fā)揮作用12.Kekkonkekkon基因家族的兩個產(chǎn)物Kek1和Kek2均為跨膜蛋白，二者的胞內(nèi)區(qū)差別較大，只有19%同源性，而胞外區(qū)相同，均含有6個LRR結(jié)構(gòu)和一個C2型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（圖 2），這兩種結(jié)構(gòu)域均能介導(dǎo)蛋白蛋白間相互作用. 兩者在胚胎發(fā)育過程CNS多種神經(jīng)元內(nèi)都有表達. 作為細胞黏合和信號分子，它們可能參與了胚胎CNS神經(jīng)元的分化，通過其細胞細胞間相互作用功能，使得神經(jīng)元在分化過程中能夠識別相鄰細胞及分子，從而引導(dǎo)軸突生長及導(dǎo)向13.近20年來，隨著對LRR家族蛋白研究的深入，在高等的脊椎動物，包括哺乳動物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了多種LRR家族新成員.Tr

17、k神經(jīng)營養(yǎng)素（NTs）高親和性受體Trk為原癌基因trk編碼的跨膜蛋白，其包含有與配體結(jié)合的胞外區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶三部分. NTs的信號主要是通過Trk家族酪氨酸蛋白激酶受體到達神經(jīng)元的. NTs各個因子特異地識別Trk家族特定的酪氨酸蛋白激酶受體：NGF特異地識別TrkA，BDNF、NT4特異地識別TrkB，NT3識別TrkC. 所有Trk家族受體胞外區(qū)包括3個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域及其N端和C端富含半胱氨酸的側(cè)翼結(jié)構(gòu)，緊接2個Ig樣結(jié)構(gòu). 而第二個LRR motif正是與神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合的位點（圖 2）. 實驗表明，單獨的一個由24個氨基酸殘基構(gòu)成的LRR結(jié)構(gòu)多肽可高效結(jié)合NGF，

18、阻礙NGF結(jié)合于TrkA胞外的相應(yīng)區(qū)域. TrkB受體上的相應(yīng)的第二個LRR結(jié)構(gòu)域也具有特異性結(jié)合BDNF，NT4的作用14.LANPLeucinerich acidic nuclear protein （LANP）是酸性富亮氨酸核蛋白，包括247個氨基酸，含兩種不同的結(jié)構(gòu)域，其中N端為5個串聯(lián)的LRR結(jié)構(gòu)域，C端結(jié)構(gòu)域為第105247位氨基酸殘基，為一段富含酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的高度重復(fù)序列并包含一段核定位信號（圖2）. LANP廣泛分布于大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，尤以小腦分布最多，免疫組化研究表明，該蛋白主要位于小腦蒲肯野細胞核內(nèi). 其表達量在出生后發(fā)育前期一度升高，在大鼠出生后第7天，該基因mRNA在小腦外粒層及蒲肯野細胞內(nèi)適度表達，而在內(nèi)粒層細胞內(nèi)弱表達. 在出生后第2周，該基因在上述細胞內(nèi)，尤其是蒲肯野細胞內(nèi)表達量升高，出生3wk后回落到成體表達水平. 從該蛋白的上述生物學(xué)特性推測，LANP有可能在小腦神經(jīng)元分化過程中起信