選修3.1.1DNA重組技術(shù)的基本工具(上課用)

1、 能否培養(yǎng)出具有抗蟲能否培養(yǎng)出具有抗蟲性狀的抗蟲棉呢？性狀的抗蟲棉呢？基因工程基因工程：指按照人們的愿望指按照人們的愿望,進行嚴格的設(shè)進行嚴格的設(shè)計并通過計并通過體外體外DNA重組重組和和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造創(chuàng)造出更出更符合人們需要符合人們需要的的新的新的生物類型生物類型和和生物產(chǎn)品生物產(chǎn)品。由于基因工程是在。由于基因工程是在DNA分子水平分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作作DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)?；蚬こ痰膭e名基因工程的別名操作環(huán)境操作環(huán)境操作對象操作對象操作水平操作水平基

2、本過程基本過程結(jié)果結(jié)果原理原理優(yōu)點優(yōu)點基因拼接技術(shù)或基因拼接技術(shù)或DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)生物體外生物體外基因基因DNADNA分子水平分子水平創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物創(chuàng)造出人類需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品產(chǎn)品剪切剪切 拼接拼接 導(dǎo)入導(dǎo)入 表達表達基因重組基因重組定向改造生物性狀定向改造生物性狀思考：從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的思考：從結(jié)構(gòu)上分析，為什么不同生物的DNA 能夠重組？能夠重組？基本組成單位相同；空間結(jié)構(gòu)相同；堿基互補配對方式相同基本組成單位相同；空間結(jié)構(gòu)相同；堿基互補配對方式相同DNA DNA 重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具本節(jié)知識內(nèi)容本節(jié)知識內(nèi)容 1-1 D

3、NA1-1 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具專題一專題一 基因工程基因工程“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” 限制酶限制酶 “分子縫合針分子縫合針” DNADNA連接酶連接酶 “分子運輸車分子運輸車” 基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體 識別雙鏈識別雙鏈DNA DNA 分子的某種特定的核苷酸分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是原核生物主要是原核生物40004000種。種。 1、來源：、來源： 2、種類：、種類：3、作用：、作用：5、結(jié)果：、結(jié)果：形成兩種末端形成兩種

4、末端黏性末端黏性末端平末端平末端4 4、切割方式：、切割方式：錯切和平切錯切和平切作用特點：識別特定核苷酸序列，切割特定位點。具有專一性黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端限制性內(nèi)切酶作用過程 1 1、大腸桿菌的一種限制酶大腸桿菌的一種限制酶（EcoR)EcoR)能識別能識別GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之間切開形成之間切開形成黏性黏性末端。末端。 2 2、SmaSma能識別能識別CCCGGGCCCGGG序列，序列，并在并在C C和和G G之間切割形成之間切割形成平平末端末端 。常見的兩種限制酶中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoR)只能識別GAATTC

5、序列，并在G和A之間切開。EcoRI限制酶的作用黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割 被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。SmaI只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。中軸線SmaI限制酶的作用在G與C之間切割SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。18仔細觀察各限制酶仔細觀察各限制酶 識別的特定序列有識別的特定序列有何何 特點？特點？限制酶的識別序列限制酶所識別的序列的特點是：限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是呈現(xiàn)堿基互補對

6、稱，無論是6個個堿基還是堿基還是4個堿基，都可以找到個堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈雙鏈DNA上的堿基是上的堿基是反向?qū)ΨQ反向?qū)ΨQ重復(fù)重復(fù)排列的排列的 ，稱為，稱為回文序列回文序列想一想想一想1 1限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點體現(xiàn)了酶的哪限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點體現(xiàn)了酶的哪種特性？種特性？【提示提示】限制性核酸內(nèi)切酶只能識別特定的核限制性核酸內(nèi)切酶只能識別特定的核苷酸序列，并且只能在特定部位切割，這說明了苷酸序列，并且只能在特定部位切割，這說明了酶具有專一性。酶具有專一性。2.2.限制性核酸內(nèi)切酶與限制性核酸內(nèi)切酶與DNADNA解旋酶的不同？解旋酶的不

7、同？兩者作用部位不同，前者作用于磷酸與脫氧核糖之間的磷酸兩者作用部位不同，前者作用于磷酸與脫氧核糖之間的磷酸二酯鍵，而后者作用于兩個堿基之間的氫鍵。二酯鍵，而后者作用于兩個堿基之間的氫鍵。3. .原核生物體內(nèi)限制酶的作用原核生物體內(nèi)限制酶的作用？限制酶不切割自身限制酶不切割自身DNA的原因是的原因是？切割侵入的外源切割侵入的外源DNA，使之失效，從而達到保護自身的目的，使之失效，從而達到保護自身的目的原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾原核生物中不存在該酶的識別序列或識別序列已經(jīng)被修飾 學(xué)案例學(xué)案例1基因的針線：基因的針線：DNADNA連接酶連接酶G A A T T CC T T

8、 A A GG A A T T CC T T A A GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C GG C T T A A A A T T C G用同種限制酶切割用同種限制酶切割把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用DNADNA連接酶連接酶“分子縫合針分子縫合針”1.1.種類種類大腸桿菌大腸桿菌黏性黏性T4噬菌體噬菌體平平2.作用：將切下的作用：將切下的DNA片段片段“縫合縫合”，恢復(fù)被限制，恢復(fù)被限制酶切開的酶切開的_，拼接成新的，拼接成新的DNA分子。分子。磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵閱讀

9、課本第閱讀課本第5頁頁“分子縫合針分子縫合針”DNA連接酶連接酶的相關(guān)內(nèi)容，的相關(guān)內(nèi)容，完成下列問題完成下列問題兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：注意：DNADNA連接酶可連接雙鏈連接酶可連接雙鏈DNADNA中的中的DNADNA單鏈缺口，單鏈缺口，但不能連接單鏈但不能連接單鏈DNADNA！DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？聚合酶是一回事嗎？T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶的縫合作用DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶的比較聚合酶的比較DNA連接酶

10、DNA聚合酶相相同同點點化學(xué)本質(zhì)化學(xué)本質(zhì)都是催化兩個脫氧核苷酸之間形成都是催化兩個脫氧核苷酸之間形成 鍵鍵作用實質(zhì)作用實質(zhì)不不同同點點是否需要是否需要模板模板 鏈 鏈連接連接DNA單單/雙鏈雙鏈在 之間形成磷酸二酯鍵將 通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈作用過程作用過程將兩個DNA片段連接成重組DNA分子合成DNA分子的一條鏈作用結(jié)果作用結(jié)果用途用途基因工程基因工程DNA復(fù)制復(fù)制磷酸二酯磷酸二酯不需要不需要需要需要雙雙單單兩個兩個DNA片段片段單個脫氧核苷酸單個脫氧核苷酸都是蛋白質(zhì)都是蛋白質(zhì)A A T T GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合

11、酶DNA聚合酶的作用返回DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶相相同同點點作用實質(zhì)作用實質(zhì)化學(xué)本質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不不同同點點模板模板作用對象作用對象 作用結(jié)果作用結(jié)果用途用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)不需要需要形成重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵【探規(guī)尋律】【探規(guī)尋律】幾種酶的作用部位幾種酶的作用部位限制性核酸內(nèi)切酶、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、連接酶、DNA聚合酶作用于聚合酶作用于部位部位,DNA解旋酶解旋酶作用于作用于部位。部位。學(xué)案例學(xué)案例2三、分

12、子運輸車三、分子運輸車基因進入受體細胞的載體基因進入受體細胞的載體 要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體要讓一個從甲生物細胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)進行表達，首先得將這個基因送到乙生物的細胞內(nèi)去！內(nèi)去！能將外源基因送入受體細胞的工具能將外源基因送入受體細胞的工具就是就是載體載體?；蚬こ痰妮d體被喻為基因工程的載體被喻為：分子運輸車分子運輸車載體的作用載體的作用載體的必載體的必要條件要條件載體的種類載體的種類閱讀課本第閱讀課本第6頁頁“分子運輸車分子運輸車”運載體運載體的的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)細菌的質(zhì)粒細菌的質(zhì)粒病毒：

13、病毒：、動植物病毒等。、動植物病毒等。 有標(biāo)記基因的存有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點有切割位點能復(fù)制并帶著能復(fù)制并帶著插入的目的基插入的目的基因一起復(fù)制因一起復(fù)制質(zhì)粒質(zhì)粒裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌擬核裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細菌擬核DNA之外，之外，并具有并具有自我復(fù)制能力自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。分子。最常用運載體質(zhì)粒 實際上實際上在基因在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作載真正被用作載體的質(zhì)粒，都體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進行的基礎(chǔ)上進行過人工改造的。過人工改造的。作為載體的必要

14、條件作為載體的必要條件1. 1.能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存能在受體細胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存2.2.有一個至多個限制酶切位點，供外源有一個至多個限制酶切位點，供外源DNADNA片片段插入段插入3.3.具有標(biāo)記基因，供重組具有標(biāo)記基因，供重組DNADNA的鑒定和選擇的鑒定和選擇4.4.對受體細胞無害對受體細胞無害特別提醒特別提醒主動運輸中載體的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，主動運輸中載體的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其作用是運輸離子、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)進出細其作用是運輸離子、氨基酸、核苷酸等物質(zhì)進出細胞。胞。基因工程中的載體的化學(xué)本質(zhì)是基因工程中的載體的化學(xué)本質(zhì)是DNA，其作用是，其作用是攜帶目的基因進入受體細胞。攜帶

15、目的基因進入受體細胞。思考：天然的質(zhì)粒思考：天然的質(zhì)粒DNA分子可以直接用作基因工程分子可以直接用作基因工程的載體嗎？的載體嗎？實際上自然存在的質(zhì)粒并不完全具備載體需要滿實際上自然存在的質(zhì)粒并不完全具備載體需要滿足的條件，都要進行人工改造后才能用于基因工足的條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。程操作。學(xué)案例學(xué)案例3限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GGATCC，限制，限制性內(nèi)切酶性內(nèi)切酶的識別序列和切點是的識別序列和切點是GATC。在質(zhì)粒上有。在質(zhì)粒上有酶酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶的一個切點，在目的基因的兩側(cè)各有一個酶的切點。的切點。（1）請畫

16、出質(zhì)粒被限制酶）請畫出質(zhì)粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶切割后所形成的黏性切割后所形成的黏性末端。末端。（3）在）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？成的黏性末端能否連接？為什么？可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏可以連接。因為由兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互補的）性末端是相同的（或是可以互補的） 小試身手小試身手【易錯警示】巧辨基因工程操作工具的【易錯警示】巧辨基因工程操作工具的8個易錯點個易

17、錯點(1)限制酶是一類酶，而不是一種酶。限制酶是一類酶，而不是一種酶。(2)限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強酸或強堿均易使之變性失活。高溫、強酸或強堿均易使之變性失活。(3)在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相在切割目的基因和載體時要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。同的黏性末端。(4)將一個基因從將一個基因從DNA分子上切割下來，需要切兩處，同時產(chǎn)生分子上切割下來，需要切兩處，同時產(chǎn)生4個黏性末端。個黏性末端。(5)不同不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同分子用

18、同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個一個DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位點應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以限制酶切割位點應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進行檢測。便于進行檢測。(7)基因工程中的載體與細胞膜上物質(zhì)運輸?shù)妮d體不同?；蚬こ袒蚬こ讨械妮d體與細胞膜上物質(zhì)運輸?shù)妮d體不同。基因工程中的載體是中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細胞內(nèi)；膜載體是分子，能將目的基因?qū)胧荏w細胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細胞膜的通透性有關(guān)。蛋白質(zhì)，與細胞膜的通透性有關(guān)。(8)基因工程中有基因工程中有3種工具，但工具酶只有種工具，但工具酶只有2種。種?！菊n堂檢測】【課堂檢測】1-5：CBCBA:6-8：BCB 9、作用底物作用底物作用部位作用部位形成產(chǎn)物形成產(chǎn)物限制酶限制酶DNADNA分子分子磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 黏性末端或平末端黏性末端或平末端DNADNA連接連接酶酶DNADNA分子片段分子片段磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵重組重組DNA分子分子DNADNA聚合聚合酶酶脫氧核苷酸脫氧核苷酸磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵新的新的DNA分子分子解旋酶解旋酶DNADNA分子分子氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNADNA酶酶DNADNA分子分子磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵脫氧核苷酸脫氧核苷酸10