談微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用

1、談微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用 您正在瀏覽的特種醫(yī)學(xué)論文是談微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用摘要：微透析技術(shù)是將推挽灌流和透析技術(shù)結(jié)合起來并逐漸完善的一種新型生物采樣技術(shù),可在麻醉或清醒的生物體上使用,特別適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。微透析技術(shù)最早應(yīng)用于腦內(nèi)是在1972年美國耶魯大學(xué)報(bào)道的猴腦的微透析研究，之后微透析即開始應(yīng)用于對腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的改變，藥物動(dòng)力學(xué)監(jiān)測以及一些疾病腦內(nèi)神經(jīng)生理改變的研究，至今已有30多年的歷史。本文就微透析技術(shù)在腦組織研究中的應(yīng)用作一綜述。1 微透析技術(shù)的原理及探針回收率的測定微透析技術(shù)是以透析原理作為基礎(chǔ)的在體取樣技術(shù)，是在非平衡條件下即流出的透析液中

2、待測化合物的濃度低于它在探針膜周圍樣品基質(zhì)中的濃度，灌注埋在組織中的微透析探針，組織中的待測化合物沿濃度梯度擴(kuò)散進(jìn)入透析液，被連續(xù)不斷地帶出，從而達(dá)到從活體組織中取樣的目的，通過測定流出液即透析液中待測物的濃度來研究組織中待測物的水平。這是一種動(dòng)態(tài)連續(xù)的取樣方法。簡單地說，微透析技術(shù)的原理就相當(dāng)于在組織中創(chuàng)造了一個(gè)“毛細(xì)血管”，使化合物在濃度差的作用下擴(kuò)散而進(jìn)入此“毛細(xì)血管”，然后隨液體流動(dòng)帶出體外進(jìn)行檢測。微透析技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可在基本上不干擾體內(nèi)正常生理過程的情況下進(jìn)行在體、實(shí)時(shí)和在線取樣,透析過程探針周圍的組織液成分不會(huì)發(fā)生改變，所以可以持續(xù)收集樣品，而且被透析動(dòng)物可以小到老鼠一般大小。

3、通過微透析技術(shù)可以單獨(dú)取得細(xì)胞外液,因此可對大腦神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行活體監(jiān)測，由于透析液中不含蛋白質(zhì)和酶等生物大分子，能直接進(jìn)樣進(jìn)行高效液相和毛細(xì)管電泳等生化分析，免除了復(fù)雜的進(jìn)樣前樣品處理及由此而產(chǎn)生的樣品損失和誤差，也不會(huì)因在室溫取樣而酶解，提高了樣品的穩(wěn)定性，而且隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步可以對微透析試驗(yàn)進(jìn)行全程的自動(dòng)化控制。微透析試驗(yàn)中一個(gè)重要的步驟是要測定微透析探針的回收率(透析液中待測化合物的濃度與其在樣品基質(zhì)中濃度之比)，由于微透析是在非平衡條件下取樣，所以所測得的透析液中化合物的濃度只是探針周圍樣品基質(zhì)中該化合物濃度的一部分。在了解該化合物待測部位的實(shí)際濃度時(shí)必須測定探針的回收率，它是影響微透

4、析結(jié)果的重要因素，并取決于取樣部位的生物學(xué)性質(zhì)、透析膜的物理性質(zhì)(材料，孔徑，長度，幾何形狀等)、待測物質(zhì)的分子量、灌流速度、壓力、生物體本身的健康條件和生物節(jié)律等。探針回收率有體內(nèi)、體外之分，體外的測定方法比較簡單，配制被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行透析，測定透析液中該物質(zhì)的濃度，再與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度進(jìn)行比較即可得出。體內(nèi)的測定則較復(fù)雜，常用的體內(nèi)測定方法零凈通量法，該法是將灌流液流速控制恒定,分別測定不同濃度的灌流液達(dá)到穩(wěn)態(tài)后透析液中分析物的濃度。當(dāng)灌流液中分析物的濃度低于探針外介質(zhì)時(shí)，擴(kuò)散方向就是從介質(zhì)到探針;反之，即是從探針到介質(zhì)。零通量點(diǎn)時(shí)，探針內(nèi)外濃度相等。繪制灌流液不同濃度與透析液中分析物濃

5、度的直線回歸圖，這時(shí)斜率即為探針回收率3，5。此法是一種帶有嘗試性的方法，需要對分析物在體內(nèi)的濃度范圍有一定的了解。反透析法是用一種內(nèi)標(biāo)物加入到灌流液中進(jìn)行透析，通過測定透析液中內(nèi)標(biāo)物的濃度，與灌流液濃度做對比，用1減去該比值即為該物質(zhì)的體內(nèi)回收率4，5。這種內(nèi)標(biāo)物要求具有惰性，不與體內(nèi)物質(zhì)反應(yīng)且又盡可能與待測物結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近。該法優(yōu)點(diǎn)在于可真實(shí)反映體內(nèi)回收率的變化情況。低速灌流法2，3，在灌流速度約為50nL/min時(shí)進(jìn)行灌流，一般相對回收率可達(dá)90%。這種方法的缺點(diǎn)是顯而易見的，不但在樣本采集時(shí)耗時(shí)，且在灌流過程中樣品揮發(fā)程度也很嚴(yán)重。在只需要知道被測物質(zhì)的相對濃度變化時(shí)，可簡單的測定探針的

6、體外回收率，測定應(yīng)在透析前進(jìn)行，配制被測物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度要與該物質(zhì)在體內(nèi)的濃度相似)，用與體內(nèi)試驗(yàn)相同的灌流速度灌流探針，達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后收集透析液并進(jìn)行檢測，測定濃度與標(biāo)準(zhǔn)液濃度之比就是探針的體外回收率。此法雖簡單易行，但由于被測物質(zhì)在體內(nèi)、外的狀況不同，檢測結(jié)果不能嚴(yán)格的等同于體內(nèi)回收率。2 微透析系統(tǒng)的組成及腦內(nèi)微透析的操作步驟目前國際上生產(chǎn)微透析系統(tǒng)的公司主要有：瑞典CMA公司，美國BAS公司，以及日本的EICOM公司，我們使用的是美國BAS公司的產(chǎn)品。中國科學(xué)院北京化學(xué)研究所6，中國科學(xué)院上海生物研究所，天津神經(jīng)外科研究所都較早地開展了微透析技術(shù)，而且可以自行設(shè)計(jì)微透析探針并申請了

7、國家專利7。微透析系統(tǒng)主要有：微量灌注泵，與微量灌注泵相配套的微量注射器，連接管，微透析探針，與探針相配套的微透析套管以及微透析分段收集儀。另外在透析清醒大鼠時(shí)還需要一套光感應(yīng)收集籠以保證大鼠在透析過程中可以自由活動(dòng)而不影響透析過程。其中最關(guān)鍵的部分是微透析探針，它是由導(dǎo)入管,導(dǎo)出管,中空纖維管,半透膜組成。BAS公司有3種不同設(shè)計(jì)風(fēng)格的探針(針式、直線型、分流型)。該公司提供的可選擇探針有腦探針,主要用于腦組織及脊髓組織的透析;聯(lián)合灌注腦探針主要用于腦組織，可以同時(shí)進(jìn)行透析和灌注;脈管探針主要用于血管、肌肉、皮下組織、腹膜等組織部位的透析;線型探針主要用于真皮、肌肉、肝臟、胰腺、腎臟等部位的

8、透析;環(huán)型探針主要用于皮下組織,分流型探針主要用于檢測膽汁成分的變化。另外依據(jù)探針的形狀又可將其分為U型、I型、線性和環(huán)形探針8，其中U型、I型探針由于其體積小，對腦組織損傷小常用于腦內(nèi)微透析，而線型、環(huán)型探針的使用同上所述。每種探針都有幾種不同長度的半透膜供選擇。試驗(yàn)中探針的選擇主要依據(jù)所透析的部位以及靶組織的尺寸，不必完全拘泥于探針的設(shè)計(jì)風(fēng)格。對于腦內(nèi)的透析試驗(yàn)，為防止探針膜的損傷，在試驗(yàn)前應(yīng)先在麻醉狀態(tài)下，給大鼠腦部植入微透析探針引導(dǎo)管,依照大鼠腦立體定位圖譜，借助立體定位儀找到目標(biāo)部位植入微透析探針引導(dǎo)管，手術(shù)后34d大鼠恢復(fù)自由活動(dòng)后開始對其進(jìn)行透析，試驗(yàn)時(shí)先將微透析系統(tǒng)連接好，沖洗

9、探針(探針膜被甘油封存著，使用前應(yīng)先將其沖洗掉)，探針準(zhǔn)備好后，拔出大鼠腦部引導(dǎo)管內(nèi)芯將微透析探針插入，用微灌注泵通過探針的進(jìn)液管，向探針內(nèi)以恒定的速度灌流與腦組織液成分相似的等滲灌流液，此時(shí)膜外小分子物質(zhì)將順濃度梯度進(jìn)入灌流液中，并隨灌流液通過探針的導(dǎo)出管被引流出來，調(diào)整分段收集儀,一定時(shí)間段收集一次液體(BAS公司分段收集儀可直接在04環(huán)境中收集液體，有效避免了樣品在空氣中的降解)，由于透析過程中大分子量物質(zhì)不能通過透析膜，收集到的液體可以直接注入高效液相色譜儀或毛細(xì)血管電泳儀進(jìn)行定量檢測9。3 微透析技術(shù)在腦組織中的應(yīng)用腦內(nèi)微透析技術(shù)是剛剛發(fā)展起來的一種在體研究腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)的方法，微

10、透析技術(shù)結(jié)合高靈敏度的微量化學(xué)分析技術(shù)可以精確測定腦內(nèi)特定腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況。利用微透析技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，主要是在被限制動(dòng)物或在麻醉動(dòng)物身上，也可以用在自由活動(dòng)的清醒動(dòng)物(需要設(shè)計(jì)能供動(dòng)物自由活動(dòng)的光感應(yīng)籠)。Bagger等10將微透析技術(shù)應(yīng)用于經(jīng)鼻黏膜給藥后藥物在腦內(nèi)代謝過程的研究，探討了藥物經(jīng)嗅覺區(qū)吸收的模型。鄧小明等11利用微透析技術(shù)對大鼠腦缺血再灌注損傷進(jìn)行研究，認(rèn)為谷氨酸(Glu)與天門冬氨酸(Asp)等興奮性氨基酸在缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用，缺血時(shí)間越長腦間質(zhì)Glu與Asp的峰值濃度就越高，神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)學(xué)損傷也就越嚴(yán)重。在老年醫(yī)學(xué)的研究中，中國科學(xué)院上海生理研究所利用

11、微透析技術(shù)對老齡大鼠和年輕大鼠皮層膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能進(jìn)行活體監(jiān)測，檢測出老齡大鼠皮層乙酰膽堿(Ach)的基礎(chǔ)水平顯著低于年輕清醒大鼠皮層Ach的基礎(chǔ)水平,為進(jìn)一步探討老齡大鼠與年輕大鼠學(xué)習(xí)記憶方面差別的機(jī)理提供了證據(jù)12。腦內(nèi)微透析技術(shù)已經(jīng)成為研究各種動(dòng)物模型腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)變化不可缺少的方法，國內(nèi)眾多實(shí)驗(yàn)室都在逐漸開展微透析技術(shù)，以便更清晰準(zhǔn)確地反映一定條件下腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的變化情況。腦內(nèi)微透析技術(shù)近幾年在臨床也有較多應(yīng)用，Hutchinson等13利用微透析技術(shù)與其它監(jiān)測手段研究動(dòng)脈瘤手術(shù)的情況得出：患者穩(wěn)定期腦氧壓在1545mmHg之間，葡萄糖含量在(0.53)mmol/L之間，乳酸/丙酮酸

12、比值大于30，則提示有厭氧代謝的可能;小于3min的短暫動(dòng)脈夾閉不會(huì)引起腦氧量減少或乳酸/葡萄糖比值的升高，長時(shí)間夾閉則會(huì)有副作用。有研究，微透析能在患者腦缺血局部腦氧分壓和腦血流量出現(xiàn)變化后530min即發(fā)現(xiàn)代謝物的變化，早于臨床癥狀，為臨床治療提供了更大的空間14。在國外微透析技術(shù)和設(shè)備已經(jīng)逐漸標(biāo)準(zhǔn)化，被作為一種常規(guī)方法應(yīng)用于神經(jīng)外科手術(shù)和神經(jīng)內(nèi)科疾病的監(jiān)護(hù)治療，并能提供正常參考值來評價(jià)患者透析期間的變化，大大降低了患者的死亡率15。目前微透析技術(shù)應(yīng)用于臨床的疾病主要涉及顱腦損傷，蛛網(wǎng)膜下隙出血，癲，帕金森氏病，腦腫瘤等，但國內(nèi)有關(guān)腦內(nèi)微透析技術(shù)應(yīng)用于臨床的報(bào)道還很少。4 結(jié)語腦內(nèi)微透析技

13、術(shù)為研究腦內(nèi)的遞質(zhì)改變，損傷變化以及藥動(dòng)學(xué)監(jiān)測提供了有效手段，但該技術(shù)仍存在一些缺陷：植入套管手術(shù)對腦的刺激，相對回收率較低，透析量微少對檢測手段提出很大挑戰(zhàn)，而且由于微透析收集的透析液量在一定時(shí)間內(nèi)受到限制，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的透析液量一般僅可用于12次高效液相的測定，意味著一般只能得到12種生物活性物質(zhì)的信息，如果一次進(jìn)樣能夠得到多種物質(zhì)信息將大大節(jié)約成本和時(shí)間而且提高研究水平。同時(shí)國內(nèi)微透析設(shè)備主要還是依靠進(jìn)口，高質(zhì)量微透析探針的國產(chǎn)化，是推動(dòng)該技術(shù)發(fā)展的主要?jiǎng)恿?。微透析技術(shù)在腦內(nèi)的科學(xué)研究已顯示出其巨大的生命力，相信其會(huì)得到更快更好的發(fā)展?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】Marise P, David B,

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