缺血對大鼠大腦皮層神經元NMDA受體通道的影響

1、    缺血對大鼠大腦皮層神經元NMDA受體通道的影響*        摘要目的：研究“缺血”大鼠大腦大皮層神經元N-甲 基-D-天冬氨酸(NMDA)受體通道的單通道變化特征。方法：細胞貼附式膜片 鉗技術。結果：在“缺血”狀態(tài)下，NMDA受體通道35 pS和100 pS電導水平 的開放概率分別由對照組的0.079±0.006和0.067±0.004增加到0.308±0.155和0.488±0.1 26 (P0.01)，35 pS通道開放

2、時間常數2由對照值(4.17±0.38) ms增加到(8.54 ±2.05) ms(P0.01)，關閉時間由(75.50±14.10) ms縮短到(11.80±4.30) ms(P 0. 01)。結論：“缺血”可顯著開放大鼠大腦皮層神經元NMDA受體通道，使鈣 內流增加，對胞內鈣超載起重要作用，此可能是腦缺血細胞損傷的機制之一。主題詞局部缺血；神經元； 受體， N-甲基-D-天冬氨酸；離子通道 Effects of “ischemia” on NMDA-receptor-channelsin rat cerebra l cortical neuronsW

3、ANG Zhong-Feng, XUE Chun-Sheng, WAN Zi-Bing, LUO Quan-Sheng Department of Physiology, Third Military Medical University, ChongqingDepartment of Pharmacology, Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing( 400046)Abstract AIM： To study the effects of “ischemia” on N-methyl- D-aspartate (NMDA) r

4、eceptor-channels in isolated rat cerebral cortical neurons. METHODS：Cell-attached configuration of patch clamp technique.RESULTS：During “ischemia”, the open probability of 35 pS and 100 pS NM DA-rec eptor channels increased from control values 0.079±0.006 and 0.067±0.004 to 0. 308±0.1

5、55 and 0.488±0.126, respectively(P0.01). The open time constant 2 of 35 pS channels increased from (4.17±0.38) ms to (8.54±2.05) ms(P 0.01) The close time constant decreased from (75.50±14.10) ms to (11.80 ±4.30) ms (P0.01).CONCLUSION：NMDA-receptor-chann els in rat cerebral

6、cortica l neurons were activated significantly during “ischemia”, which increases Ca 2 inflow and plays and important role in intracellular Ca2 overl oad. It was one of the cell injury mechanisms during cerebral ischemia.MeSHIschemia; Neurons; Receptors, N-methyl-D-aspartate; Ion channels興奮性氨基酸是所有脊椎

7、動物中樞神經系統(tǒng)內的主要興奮性遞質，N- 甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate, NMDA)受體為其最重要的受體。NMDA受體介導了 廣泛的生理和病理過程，包括神經的發(fā)育，可塑性，LTP的產生和興奮毒等。NMDA受體耦聯 的通道即NMDA受體通道。眾多的學者認為腦缺血時，由于興奮性氨基酸釋放增多，從而激活 該通道，使其過度興奮，產生離子的跨膜流動，其中以Ca2+為主，使細胞內鈣濃度增 高1，2。本實驗用細胞貼附膜片鉗單通道記錄技術研究大鼠大腦皮層神經元NMDA 受體通道在體外模擬缺血狀態(tài)下的變化特征。材料與方法實驗選用生后24周的Wistar大鼠，雌雄不拘，斷頭取腦，分

8、離頂葉及其周圍皮層，用手 工切成厚約400500 m的冠狀腦片，在通混合氣(95% O2+5% CO2)的人工腦脊液內孵 育，人工腦脊液成分為(mmolL-1):NaCl 126; KCl 5;NaH2PO4 1.25；NaHCO3 26；CaCl2 2；MgSO4 2; HEPES 10；葡萄糖10，pH 7.2(NaOH調制)。0.5 1 h后，取 2片置入含0.1%胰 蛋白酶的2 mL人工腦脊液內消化0.5 h,消化過程中仍通混合氣。將腦片稍加剪碎，移入2 mL 人工腦脊液內，用尖端火拋光的Pasteur吸管(直徑500，300，150 m)順續(xù)吹打，使組織塊 分散，細胞游離。將此液靜置

9、710 min，吸取上清液，滴加于事先涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上，靜置10 min使細胞貼壁，加入浴液即可開始膜片鉗記錄。分離過程在室溫(2025) 下進行。采用膜片鉗細胞貼附式結構記錄通道電流3。實驗用細胞浴液成分(mmolL -1):NaCl 140, CsCl 5， CaCl2 1.8， HEPES 10， TTX 0.001， 葡萄糖1 0，pH7.2；電極液成分(mmolL-1)；NMDA 20 molL-1；L-甘氨酸1molL-1，不含葡萄糖，其余同細胞浴液?！叭毖苯M細胞浴液成分除不含葡萄糖外 ，其余同正常浴液，在施加于細胞前通混合氮氣(95%N25%CO2結果在電極液內加入20

10、 molL-1的NMDA和1 mol*L-1的L-甘氨酸以激動NMDA 受體，可記錄到NMDA受體通道的單通道電流，其開放一般有兩個電導水平，其電導值分別為 35 pS和100 pS，開放時電流幅度分別為(2.79±0.14) pA和(7.79±0.05) pA.開放概率 分別為(0.079±0.006) pS和(0.067±0.004)。 35 pS NMDA通道的開放時間需用雙指數 擬合，其開放時間常數1和2分別為(0.56±0.10) ms和(4.17±0.38) ms, 10 0 pS NMDA通道的開放時間也需用雙指數擬合，

11、其開放時間常數1和2分別為(0.50 ±0.38) ms和(7.80±1.74) ms.通道的關閉時間常數為(75.50±14.10) ms (n= 10)。 在“缺血”狀態(tài)下，NMDA受體通道被顯著激活，部分細胞膜片的通道開放為單個水平的開放 增加(1C)，部分細胞膜片的通道開放為多電導的開放(1D)，其電導水平以35 pS和100 p S為主。35 pS通道的開放時間常數1和2分別為(0.69±0.15) ms和(8.54±2. 46)ms.與對照組相比，2顯著增加(P0.01)，通道的開放概率顯著增加，達到0 .308±0.15

12、5(P0.01)；100 pS通道的開放時間常數1和2分別為(0.58 ±0.12) ms和(7.91±2.53)ms，與對照組相比，1和2均無顯著差異，但通道的 開放概率明顯增加，達到0.488±0.126(P0.01，n=7)。對于有多電導開放的 細胞，其總 的開放概率可達0.896±0.034，通道的關閉時間常數為(11.80±4.30) ms，顯著縮短 于對照組(P0.01，n=9)。NMDA受體通道拮抗劑MK-801可顯著抑制“缺血”誘導 的 通道開放(1E)。     Fig 1 Effect

13、s of “ischemia” on NMDA-receptor-channels in rat cereb ral cortical neurons recorded in the cell-attached configuration. Holding potent ial was set at-80 mV. Inward currents are indicated as downward deflections. A. 100 pS channels; B. 35 pS channels; C. 35 pS channels in “ischemia" condition.

14、D. 35 pS and 100 pS channels in “ischemia" condition; E. MK-801 0.05 mgmL-1 on NMD A-receptor channels in "ischemia" condition1“缺血”對大鼠大腦皮層神經元NMDA受體通道的影響討論NMDA受體通道是存在于中樞神經系統(tǒng)內的一類受體門控通道，該通道對Ca2+ 有較大 的選擇性，而對Na+和K+非選擇性通透，對Cl?不通透，因此通道被激活后主要產生C a2內流48。本實驗在玻璃微電極內加入20molL-1的 NMDA和1molL-1的L-甘氨酸

15、以激動NMDA受體，記錄到正常的通道電活動，其開 放、關閉的動力學特征與文獻報道基本一致，證明實驗所記錄到的通道是典型的NMDA受體通 道。該通道在開放時有多電導水平，本文僅分析35 pS和100 pS通道電流在“缺血”時的變 化特征。多數實驗室均證明腦缺血時，腦細胞內Ca2濃度急劇增高，這是腦缺血損傷的 啟動 因素之一。本實驗用膜片鉗技術直接觀察到，在“缺血”狀態(tài)下，大鼠大腦皮層神經元NMDA 受體通道被激活，35 pS電導水平通道開放時間常數較大的2顯著延長，通道35 pS和1 00 pS電導水平的開放概率顯著增加，關閉時間縮短，由于該通道對Ca2有選擇性 通透，因此，NMDA受體通道的激

16、活可顯著增加Ca2內流，對缺血時細胞內鈣超載起 重要 作用。有些學者認為，腦缺血時，胞內Ca2的增多主要是通過NMDA受體通道，而膜 電壓依賴性鈣通道不起作用2，但我們用膜片鉗技術直接觀察到了在腦“缺血” 時L-和N-型電壓依賴性鈣通道的開放增加9。從本實驗結果來看，大鼠皮層NMDA 受體通道在腦“缺血”時的開放程度比電壓依賴性鈣通道更顯著，由此導致的Ca2 內流可能處于主導地位，電壓依賴性鈣通道的開放進一步加重了胞內鈣的聚集，另外，在缺 血時，胞內鈣釋放也參與了鈣的聚集10。* 第三軍醫(yī)大學科研基金資助作者單位：王中峰 中國科學院上海生理研究所7 信箱(上海200031)萬子兵羅全生第三軍醫(yī)

17、大學生理學教研室(重慶400038)薛春生重慶醫(yī)科大學藥理學教研室參考文獻1Salinska E, Pluta R, Puka M, et al. Blockade of N-methyl-D- aspartate-sensitive excitatory amino acid receptors with 2-amino-5-phosphovalera te reduces ischemia-evoked calcium redistribution in rabbit hippocampus. Exp Neu rol, 1991, 112:89.2Xie YX, Zacharias E,

18、Hoff P, et al. Ion channel involvement in anoxic depolarization induced by cardiac arrest in rat brain. J Cereb Blood Fluid Metab , 1995, 15:587.3Hamill OP, Marty A, Neher E, et al. Improved patch-clamp techniques fo r high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. P flugers Arch, 1981, 391:85.4Gibb AJ, Colquhoun D. Glutamate activation of a single NMDA receptor-c hannel produces a cluster of channel openings. Proc R Soc LondBiol, 1991, 243:39.5Gibb AJ, Colquhoun D. Activation of N-methyl-D-aspartate receptors by L-glutamate in cells dissociated from a