維胃方對乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍愈合效果及血清GASEGF水平的影響

1、維胃方對乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍愈合效果及血清GAS，EGF水平的影響         【摘要】  目的探討維胃方對消化性潰瘍病愈合情況的影響及作用機(jī)制。方法采用乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型。觀察維胃方對大鼠潰瘍面積的改變；檢測大鼠胃液pH值變化；通過石蠟包埋、病理切片染色觀察潰瘍愈合質(zhì)量，并進(jìn)行鏡下分析；采用放射性免疫法（RIA）檢測大鼠血清表皮生長因子（EGF）和胃泌素（GAS）水平的變化。結(jié)果鏡下可見維胃方治療的大鼠胃黏膜造模處潰瘍愈合情況較好，其中以中劑量組的效果最好；模型組與各用藥組比較，胃液pH值變化明顯

2、（P0.05）；而在潰瘍面積的治療效果比較中，維胃方各治療組與對照組相比較有顯著意義（P0.05），其中以維胃方中劑量組值最小，療效最好（0.76±0.30）mm2，P0.01；維胃方治療的3組大鼠血清GAS均數(shù)都高于模型組和對照組，但其差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而經(jīng)維胃方治療的大鼠血清EGF水平均有所降低，其中以維胃方中劑量組治療效果最顯著（0.252 5±0.549 7 ng/ml)，P0.01。結(jié)論維胃方對消化性潰瘍有較好的治療效果，其作用機(jī)制與防御因子GAS，EGF的變化有關(guān)系。 【關(guān)鍵詞】  維胃方 消化性潰瘍 表皮生長因子 胃泌素 潰瘍愈合效果Therape

3、utic Effect of WeiWeiFang(WWF) on Acetic Acidinduced Gastric Ulcer and the Levels of GAS and EGF in RatsAbstract:ObjectiveTo discuss the therapeutic effect and mechanism of WWF on peptic ulcer(PU). MethodsTo observe the change of ulcer area and pH of gastric juice,and analyse the slice up of patholo

4、gy by the optics  microscope by the method of acetic acidinducted gastric ulcer. Levels of GAS and EGF serum were determined by specific radioimmunoassay method.ResultsThe effect was significant when cured by WWF,especially in mid-dose group when observed under the optical microscope.The change

5、 of pH of gastric juice was evident in model group compared with cured groups（P0.05）. The difference was significant (P0.05) while compare the curative effect on ulcer areas in control group of WFF with that in cured groups, and the effect was the best in the mid-dose group (P0.01). The levels of GA

6、S in serum were higher in cured groups of WFF than those in model group and control group. But the difference was not significant. The level of EGF in WWF groups decreased,mid-dose group had the best effect（P0.01.ConclusionThere is evident therapeutic effect of WWF on PU. And its mechanism is correl

7、ated to the defense of GAS and EGF.Key words:WeiWeiFang;  Peptic ulcer;  EGF;  GAS;  Effect of ulcer healing   消化性潰瘍病（peptic ulcer，PU）是臨床常見多發(fā)病。目前H2受體拮抗劑及質(zhì)子泵抑制劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，使?jié)儾〉挠下曙@著提高，但由于費(fèi)用、副作用、耐藥性、患者依從性等問題的存在，最終使該病的復(fù)發(fā)率仍居高不下。維胃方是經(jīng)過臨床應(yīng)用的經(jīng)驗(yàn)方， 對PU有較好的遠(yuǎn)期療效。而胃泌素（GAS）和表皮生長因子（EG

8、F）被認(rèn)為是PU愈合過程中的防御因子，發(fā)揮著很重要的作用 1,2。因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察維胃方對大鼠胃潰瘍愈合情況及血清GAS，EGF水平的影響，探討其治療機(jī)理，為中醫(yī)藥治療PU提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1  材料與方法1.1  材料1.1.1  動物SPF級Wistar雄性大鼠56只，180220 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，粵檢證字第2005A048號，質(zhì)量檢測單位：廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所。1.1.2  藥物維胃方由茯苓、蒲公英、白及、三七組成，藥材由南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院藥用植物與鑒定教研室鑒定。維胃方分高、中、低3個(gè)

9、劑量組，常規(guī)煎煮取汁、濃縮、高壓滅菌。雷尼替丁為山西太原藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號060501，國藥準(zhǔn)字H14022109。4冰箱保存?zhèn)溆谩?.1.3  試劑100%冰醋酸，廣東省光華化學(xué)廠有限公司，批號20060325；表皮生長因子（EGF）試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供，批號061120；GAS試劑盒由解放軍總醫(yī)院放免所提供，批號064020。1.1.4  儀器低速離心機(jī)LD5-2A型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn)；光學(xué)顯微鏡，Olympus公司生產(chǎn)；LeicaRM2135切片機(jī)，德國Leica公司生產(chǎn)；SN-695B型放免測量儀，上海日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)。1.2  方法

10、1.2.1  造模方法乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型，參照Takagi等3的經(jīng)典造模方法，并加以改進(jìn)。大鼠禁食24 h，予10水合氯醛腹腔注射麻醉，于劍突下縱向切開腹壁約2 cm，暴露胃體，并在胃前壁體竇交界處靠胃竇側(cè)漿膜面，用100%乙酸浸泡過的5 mm濾紙壓貼60 s，然后將胃納入體內(nèi)，放回原位，逐層縫合，75酒精消毒傷口。1.2.2  劑量換算維胃方按照動物與人等效劑量折算，大鼠生藥含量0.75  g/ml為中劑量，高劑量和低劑量分別為1.5 g/ml和0.375 g/ml；雷尼替丁水懸液濃度為0.003 g/ml。1.2.3  動物分組及給藥動物分為7組

11、，每組8只：正常組、模型組、對照組、維胃方高劑量組、維胃方中劑量組、維胃方低劑量組、雷尼替丁組。正常組予每日正常飲食；模型組在造模3 d后處死；對照組觀察自愈情況，在造模3 d后正常飲食，與用藥組同時(shí)處死；其余各用藥組均在造模3 d后予相應(yīng)藥物2 ml灌胃，灌胃7 d后處死。1.2.4  標(biāo)本采集和處理腹主動脈采血4 ml于真空管內(nèi)，傾斜放置30 min后，放入低速離心機(jī)，以3 000 r/min，離心30 min，取上清2 ml,-20冷藏；剝離胃，結(jié)扎幽門，于十二指腸和食管處剪斷取胃，由賁門擠胃液于pH試紙上檢測；10甲醛10 ml至賁門注入胃腔，結(jié)扎賁門，放入10%甲醛溶液固定

12、30 min；沿胃大彎剪開胃，展平，沖洗胃內(nèi)壁，用游標(biāo)卡尺測量潰瘍面的橫徑及縱徑，潰瘍面積(S)按公式S×d1×d2×1/4(為圓周率取值3.14，d1，d2分別為潰瘍面的最長徑和最短徑)計(jì)算；以潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心取材，10%甲醛固定，石蠟包埋，病理切片。1.3  觀察指標(biāo)胃液pH值；潰瘍面積計(jì)算；血清GAS，EGF含量；病理觀察，并進(jìn)行光學(xué)顯微鏡下分析。1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行One-way ANOVA的樣本均數(shù)多重比較的F檢驗(yàn)，P0.05。2  結(jié)果2.1&

13、#160; 大體標(biāo)本觀察2.1.1  正常組胃黏膜光整完好，呈淡紅色，無異常變化。2.1.2  模型組大鼠腹腔可見胃腸脹氣，漿膜面充血水腫，有組織粘連。胃竇和幽門處黏膜有多處潰瘍點(diǎn)。2.1.3  維胃方高、低劑量組漿膜表面均有粘連，造模痕跡明顯；胃竇與胃體黏膜可見單個(gè)不規(guī)則潰瘍點(diǎn)，其它無異常改變。中劑量組漿膜光滑，黏膜表面少見潰瘍點(diǎn)或僅見小范圍瘢痕增生。2.1.4  雷尼替丁組漿膜面少許粘連，胃竇區(qū)黏膜表面粗糙，周圍偶見充血或糜爛點(diǎn)。2.1.5  自愈組漿膜表面粗糙、粘連，造模處凹陷明顯，周圍淤血，胃竇區(qū)黏膜潰瘍愈合不全，可見暗紅色瘢痕組織增生

14、。         2.2  光學(xué)顯微鏡下觀察2.2.1  正常組胃上皮細(xì)胞及腺細(xì)胞形態(tài)和分布正常。黏膜層完整，腺體排列整齊，黏膜下層未見炎性細(xì)胞浸潤及出血傾向，漿膜層完整。2.2.2  模型組可見造模處黏膜缺損，偶及肌層，腺體完全破壞，有少量新生上皮細(xì)胞生成，黏膜下小動脈可見血栓閉鎖性動脈內(nèi)膜炎；非造模處炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，黏膜下層可見滲血；漿膜層有纖維蛋白滲出，亦有較多炎性細(xì)胞浸潤，部分標(biāo)本有缺損。2.2.3  對照組造模處黏膜缺損，偶及肌層，胃底腺輕度不典型性增生，再生腺

15、細(xì)胞排列不整齊，黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤，并可見瘢痕纖維生成，部分小動脈血管內(nèi)皮腫脹、增生，可見血栓或炎性栓塞；非造模處炎性細(xì)胞浸潤；漿膜層有少量炎性細(xì)胞浸潤，部分標(biāo)本有缺損。2.2.4  雷尼替丁組造模處可見被新生的胃上皮細(xì)胞和腺細(xì)胞覆蓋，黏膜全層均有炎性浸潤，但較模型組和對照組少，胃底腺輕度不典型性增生，黏膜下層有部分小動脈血管內(nèi)皮腫脹、增生，可見少量血栓，漿膜層偶見炎性浸潤。2.2.5  維胃方組低、高劑量組與雷尼替丁組差別不大，其中高劑量組黏膜愈合情況相對較好，腺體細(xì)胞增生數(shù)量較多，黏膜下血管未見明顯病理改變，但炎性細(xì)胞浸潤仍較嚴(yán)重；中劑量組黏膜基本完整，胃上皮細(xì)胞與腺

16、細(xì)胞形態(tài)及分布良好，腺體細(xì)胞增生數(shù)量較多，輕度不典型性增生，黏膜下層僅見少量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜下微循環(huán)未見明顯病理改變，漿膜層完整，少量炎性細(xì)胞浸潤。2.3  潰瘍面積分析各用藥組與對照組（即觀察造模后自愈情況）做比較，即可觀察治療效果，故作為空白對照的正常組以及模型組與各用藥組不作比較。而對照組與各用藥組間的比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以維胃方中劑量組最小，效果最顯著（P0.01）。結(jié)果見表1。表1  潰瘍面積mm2（略）2.4  維胃方對血清EGF，GAS及胃液pH值的影響結(jié)果顯示：對照組與維胃方中、高劑量組，模型組與維胃方中劑量組之間EGF值水平差異有意義，其中

17、以維胃方中劑量組最低，差異最顯著（P0.01）；GAS各組均數(shù)符合方差齊性，但組間差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組pH值和各用藥組間的均數(shù)差異比較都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)果見表2。表2  維胃方對血清EGF，GAS及胃液pH值的影響（略）3  討論   消化性潰瘍，屬中醫(yī)“胃脘痛”“痞證”“吐酸”范疇。中醫(yī)辨證寒熱虛實(shí)夾雜，氣血失和占大多數(shù)。氣機(jī)阻滯，升降失調(diào)是其主要病機(jī)。維胃方是臨床上用于治療PU的經(jīng)驗(yàn)方，方由茯苓、蒲公英、白及、三七組成。茯苓健脾補(bǔ)中；蒲公英清熱消癰利濕；更兼白及、三七化淤止血、消癰斂瘡、祛腐生肌。其中白及內(nèi)含豐富的白及多膠糖，有很

18、強(qiáng)的抗?jié)冏饔?，對胃黏膜損傷具有明顯的保護(hù)作用4。該方在臨床上加減化裁，療效顯著。   PU的愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的生理過程，包括細(xì)胞移行分化增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成及新生血管生成等。胃酸分泌過多時(shí)，易破壞愈合環(huán)境，引起PU復(fù)發(fā)；另一方面，胃蛋白酶的最適合pH為1.83.5，乳蛋白經(jīng)胃內(nèi)少量胃蛋白酶作用就可以被消化。當(dāng)泌酸不足時(shí)，會影響蛋白質(zhì)的消化與吸收；同時(shí)隨食物進(jìn)入胃內(nèi)的細(xì)菌也容易在體內(nèi)生長和繁殖5。本實(shí)驗(yàn)中，模型組pH值顯著高于用藥組，這是由于模型組大鼠胃黏膜受到了嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致泌酸功能乏力；而經(jīng)各用藥組治療后，潰瘍愈合，胃黏膜被修復(fù)，泌酸功能逐漸恢復(fù)。這也與潰瘍面積數(shù)據(jù)

19、吻合：維胃方治療組潰瘍面積均小于對照組，其中以維胃方中劑量組效果最好（與各組比較均P0.01）。胃黏膜病理組織鏡下觀察結(jié)果也與上述結(jié)論相符，尤以維胃方中劑量組效果最好。   GAS是與PU密切相關(guān)的胃腸肽類激素之一，它具有強(qiáng)大的刺激胃酸分泌效應(yīng)。有實(shí)驗(yàn)證明6，GAS起著刺激循環(huán)激素和神經(jīng)遞質(zhì)的雙重作用，能刺激胃酸分泌和營養(yǎng)胃黏膜，即促進(jìn)胃腸道黏膜生長和刺激胃腸蛋白質(zhì)，RNA，DNA合成及胃竇運(yùn)動的作用7。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)維胃方治療的大鼠血清GAS水平均高于模型組和對照組，但用藥組和非用藥組的血清GAS水平差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這種結(jié)果可能是由于造模后胃竇體處胃黏膜遭到

20、破壞，H+逆向彌散進(jìn)入黏膜使胃竇體處酸化，從而反饋抑制GAS釋放，使血中GAS含量降低。而經(jīng)維胃方治療后，潰瘍逐漸愈合，胃黏膜逐漸修復(fù)，GAS釋放增加，從而GAS含量有所上升。但GAS又有刺激胃酸分泌和促進(jìn)血流增加的雙重作用，在潰瘍愈合過程中，這兩種不同的效果相互作用，達(dá)到一定的制衡。   EGF是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的由唾液腺和十二指腸Brunner腺分泌的單鏈多肽，能夠降低胃黏膜損傷程度，促進(jìn)組織損傷修復(fù) 8,9。此外，EGF還可增加胃黏膜黏液黏蛋白的合成和分泌，有助于上皮組織的修復(fù)。有研究認(rèn)為10，在正常情況下，胃腸黏膜的完整性較好，所以血中EGF水平較低。而當(dāng)胃腸

21、黏膜存在炎癥和潰瘍時(shí)，受損的胃腸黏膜通透性增加，加之此時(shí)胃腔內(nèi)EGF增加，便有較多的EGF進(jìn)入血液循環(huán)，所以造模后血清EGF水平會上升。而本實(shí)驗(yàn)顯示：經(jīng)維胃方治療的組別，血清EGF含量均較對照組下降，其中以維胃方中劑量組最為明顯（P0.01）。表明維胃方能改善潰瘍愈合的條件，促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)，從而使血清的EGF含量維持在正常的水平。   本實(shí)驗(yàn)通過對維胃方在潰瘍愈合過程中防御因子GAS和EGF的研究，證明維胃方對PU具有良好的治療效果，其中以中劑量組最明顯。在對PU愈合環(huán)境的檢測過程中，與對照組相比pH值（P0.05），潰瘍面積、EGF水平（P0.01），各指標(biāo)的變化均與維胃方的治療形成了量效依賴關(guān)系。但維胃方對潰瘍愈合過程中攻擊因子的具體作用機(jī)制及其在治療過程中防御因子與攻擊因子之間的相互制衡機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1劉 偉.EGF與胃腸關(guān)系的研究新進(jìn)展J.國外醫(yī)學(xué)·消化系疾病分冊，2002，22（4）：207.2Feng-Peng Sun, Yun-Gang, Han-Rong Qin. Alterations of gastric, somatosatin,G and D cell in rat gastric ulcerJ. World Chin J Digestol,2004,12(2):363.3TAK