新基因NOR1對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響

1、新基因NOR1對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響                     作者：聶新民*, 周建大, 黃竹英, 桂嶸, 李登清, 唐華  【摘要】  目的: 研究NOR1基因?qū)Ω伟┘?xì)胞系HepG2蛋白質(zhì)表達(dá)譜的影響。方法: 將pcDNA3.1(+)/ NOR1的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體導(dǎo)入HepG2 細(xì)胞, Northern blot篩選出陽(yáng)性克隆, 通過(guò)雙向電泳

2、分離過(guò)表達(dá)NOR1的HepG2細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì), 篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn), 并進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定。結(jié)果: 鑒定出6種表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn), 包括鋅指蛋白、 腫瘤壞死因子受體、 酪氨酸蛋白磷酸化受體等, 這些蛋白質(zhì)涉及基因轉(zhuǎn)錄、 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等腫瘤發(fā)生相關(guān)事件。結(jié)論: NOR1基因可能通過(guò)上調(diào)這些蛋白參與多種途徑影響肝癌的發(fā)生。 【關(guān)鍵詞】  NOR1基因 雙向電泳 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜硝基還原酶基因NOR1是課題組克隆的一個(gè)與亞硝胺類化合物致癌密切相關(guān)的新基因1, GenBank登錄號(hào)為AF462348。人體多組織Northern blot表達(dá)分析顯示NOR1基因在所檢測(cè)的肝、 腦、

3、腎、 肺、 脾臟、 骨骼肌等12種正常組織中廣泛表達(dá), 且有2個(gè)轉(zhuǎn)錄本(1600 bp, 1200 bp)2。通過(guò)構(gòu)建NOR1基因真核表達(dá)載體及NOR1基因轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞系, 發(fā)現(xiàn)NOR1基因轉(zhuǎn)染可引起IL8的表達(dá)升高3, 4。為了深入研究NOR1基因功能, 本試驗(yàn)運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)NOR1基因肝癌細(xì)胞系HepG2, 采用高通量的蛋白質(zhì)組技術(shù)（雙相電泳, 質(zhì)譜）研究過(guò)表達(dá)NOR1肝癌細(xì)胞系HepG2后蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變, 通過(guò)對(duì)差異蛋白點(diǎn)的鑒定與分析, 探討NOR1基因在肝癌發(fā)生、 發(fā)展中的作用。1  材料和方法1.1  材料  人肝癌細(xì)胞系HepG

4、2細(xì)胞由中南大學(xué)湘雅三檢驗(yàn)科保存; pcDNA3.1(+)載體為哺乳動(dòng)物高效表達(dá)載體, 為Invitrogen公司的產(chǎn)品; pcDNA3.1(+)/NOR1載體由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科構(gòu)建; 隨機(jī)引物標(biāo)記盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司; TRIzolTM試劑購(gòu)自美國(guó)Gibcol/BRL公司; 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)研究所; 同位素32pdCTP、 33pdATP, 購(gòu)自北京福瑞公司; 引物由大連寶生物有限公司合成; 固相pH梯度干膠條（pH310, 18 cm）、 載體兩性電解質(zhì)（pH310）、 IPG緩沖液、 覆蓋液（Drystrip cover Fluid）、

5、 石蠟油、 銀染試劑盒、 IPGphor電泳單元及雙向電泳附件、 EPS 3500電源、 重泡脹附件和循環(huán)水浴箱等電聚焦系統(tǒng)、 IPGPhor電泳系統(tǒng)等購(gòu)自Pharmacia公司; 丙烯酰胺（acrylamide）、 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）為國(guó)產(chǎn)分析純; 乙腈（ACN）為國(guó)產(chǎn)色譜純; 其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭? 垂直平板電泳系統(tǒng)、 循環(huán)水浴箱購(gòu)自BioRad公司; PDQUEST 2D膠分析系統(tǒng)購(gòu)自BioRad 公司。1.2  方法1.2.1  pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2穩(wěn)定表達(dá)系的建立  方法詳見(jiàn)3。上游引物為5ATG ACT TCC AA

6、G CTG GCC GTG GCT3, 下游引物為5TCT CAG CCC TCT TTC AAA AAC TTC TC3; 為了進(jìn)一步驗(yàn)證穩(wěn)定細(xì)胞系的建立,  我們還使用Northern blot方法進(jìn)行了驗(yàn)證, 方法見(jiàn)分子克隆操作。1.2.2  蛋白抽提與定量  細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 棄出培養(yǎng)液, 用胰酶消化, PBS洗后約2×106細(xì)胞中加入50 L裂解液（8 mol/L urea, 40 g/L CHAPS, 40 mmol/L Tris, 65 mmol/L DTT）, 液氮反復(fù)凍融后, 加20 L RNase(20 g/L)在4放置15 m

7、in, 13000 r/min, 4離心30 min, 收集上清液, 樣品存放-70。蛋白定量用BSA方法操作, 每次上樣量為300 mg。1.2.3  等電聚焦電泳及銀染  采用IPGphor等電聚焦系統(tǒng), 把干膠條置于膠條盒中放置在IPGphor電泳儀上水化（水化液組成為: 8 mol/L urea, 5 g/L CHAPS, 2.8 g/L DTT及痕量溴酚藍(lán)） 1518 h, 水化完畢按500V, 1000V各1 h, 8000V 5 h等電聚焦聚焦結(jié)束后, 取出膠條, 加入平衡液A（8 mol/L urea, 0.5 mol/L TrisHCl, 20 g/L S

8、DS, 300 g/L甘油, 1 g/L DTT）振蕩平衡15 min, 再換平衡液B(8 mol/L urea, 0.5 mol/L TrisHCl, 20 g/L SDS, 300 g/L甘油, 15 g/L碘乙酰胺)振蕩平衡15 min, 取出膠條濾干。第二向SDSPAGE基本上按照Bjellguist的方法進(jìn)行。采用分離膠濃度為15 g/L的不連續(xù)SDSPAGE垂直平板電泳。銀染按銀染試劑盒操作手冊(cè)操作。1.2.4  圖像分析  通過(guò)PDQuest 2D分析軟件系統(tǒng), 分別比較4次重復(fù)結(jié)果圖譜, 將HepG2和轉(zhuǎn)染NOR1細(xì)胞的進(jìn)行匹配分析, 獲得NOR1基因轉(zhuǎn)染所

9、致的蛋白質(zhì)差異表達(dá)變化, 將這些蛋白點(diǎn)在雙向電泳凝膠圖譜上標(biāo)出。1.2.5  蛋白質(zhì)的原位酶解  蛋白質(zhì)原位酶解按Fernandez5和Gharahdaghi6的方法進(jìn)行。1.2.6  MADLITOF肽質(zhì)指紋圖分析  在樣品中加入10 L 1 g/L TFA水溶液, 振蕩, 使樣品充分溶解, 再用美國(guó)Millipore公司的10 L ZipTipTM C18器嘴脫鹽。制備好的樣品使用美國(guó)BRUKER公司的ProFlexTM III MADLITOF質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。2  結(jié)果2.1  陽(yáng)性克隆的鑒定  將挑選出來(lái)的單克隆細(xì)胞

10、擴(kuò)大培養(yǎng), 抽提RNA進(jìn)行RTPCR鑒定。共挑選出8個(gè)單克隆細(xì)胞, 用RTPCR鑒定, 其中有4個(gè)為陽(yáng)性克隆。為了進(jìn)一步確正其真實(shí)性, 對(duì)其進(jìn)行Northern blot篩選分析, 結(jié)果見(jiàn)圖1。1         圖1  Northern blot 篩選分析（略）Fig 1  Result of Northern blot analysis2.2  肝癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染NOR1的肝癌細(xì)胞的雙向電泳圖譜  根據(jù)雜交結(jié)果選取1號(hào)克隆為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞, 抽提HepG2和穩(wěn)定表達(dá)NOR1基因的H

11、epG2陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)總蛋白, 采用雙向凝膠電泳分離細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì), 圖象掃描后用Pdquest軟件分析, 可以識(shí)別700個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。4次重復(fù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示HepG2和pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2細(xì)胞二維圖譜的蛋白質(zhì)點(diǎn)分別為(700±19)、 (700±28)個(gè), 通過(guò)IMAGEMASTER軟件匹配分析后確立了10個(gè)受NOR1基因轉(zhuǎn)染影響表達(dá)明顯上調(diào)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn), 通過(guò)質(zhì)譜鑒定出其中6個(gè)差異點(diǎn), 結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2  肝癌細(xì)胞與轉(zhuǎn)染NOR1的肝癌細(xì)胞的雙向電泳圖譜（略）Fig 2  2D of HepG2 and pcDNA3.1(+)

12、/NOR1/HepG2 cell proteinA: 2D of pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2 cell protein; B: 2D of HepG2 cell protein.2.3  質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)  應(yīng)用MALDITOFMS方法對(duì)10個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行鑒定, 6個(gè)獲得了比較可靠的結(jié)果。將獲得的肽質(zhì)量指紋與數(shù)據(jù)庫(kù)的人類標(biāo)準(zhǔn)的肽質(zhì)指紋匹配, 這些蛋白分別為: 腫瘤壞死因子受體蛋白超家族成員11（tumor necrosis factor receptor superfamily, member 11b）, 肝磷脂結(jié)合生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（heparinbindin

13、g growth factor binding protein）; 酪氨酸蛋白磷酸化受體B(protein tyrosine phosphatase, receptor type, B); 鋅指蛋白（zinc finger protein 223）; 假設(shè)蛋白（hypothetical protein）,  Haptoglobin precursor等。3  討論    肝癌的發(fā)生涉及到多個(gè)基因, 這些基因在整個(gè)基因網(wǎng)發(fā)揮著重要的作用, 一個(gè)基因也可能通過(guò)多個(gè)基因、 多個(gè)途徑來(lái)影響細(xì)胞的功能。研究表明, HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染NOR1基因后, 蛋

14、白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生了改變, 我們鑒定出6個(gè)表達(dá)明顯上調(diào)的蛋白點(diǎn), 其中: 包括鋅指結(jié)構(gòu)蛋白, 鋅指結(jié)構(gòu)指的是在很多蛋白中存在的一類具有指狀結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域, 鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域能通過(guò)其保守的組氨酸、 半胱氨酸殘基介導(dǎo)DNA, RNA及蛋白蛋白相互作用。鋅指蛋白功能非常廣泛, 其功能主要包括DNA識(shí)別, RNA包裝轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 蛋白折疊和裝配、 脂質(zhì)結(jié)合, 并參與生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和惡性腫瘤的形成等7, 8。此外, NOR1基因還可引起腫瘤壞死因子受體超家族成員蛋白的表達(dá)增加, 腫瘤壞死因子受體通過(guò)免疫調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生、 血管生成以及腫瘤轉(zhuǎn)移中起到信號(hào)通路連接作用9, 這也可能與NOR1基因參與腫瘤壞死因子的表達(dá)調(diào)

15、控相關(guān), 其具體機(jī)制和作用信號(hào)通路有待進(jìn)一步深入研究?！尽?#160; 1 聶新民, 周 鳴, 唐 珂, 等. 一個(gè)與化學(xué)因素致鼻咽癌相關(guān)的硝基還原酶基因的克隆與鑒定J. 生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2003, 19（4）: 423-428.2 Nie XM, Zhang BC, Li GY. Cloning, Expression and Mutation analysis of NOR1, a novel human gene downregulated in HNE1 nasopharyngeal carcinoma cell lineJ. J Cancer Res Clin Oncol,

16、 2003, 129（7）: 410-414.3 傅錦芳, 李登清, 聶新民, 等. NOR1基因?qū)epG2細(xì)胞白介素8水平的影響J. 臨床檢驗(yàn)雜志, 2006, 14（4）: 282-284.4 傅錦芳, 李登清, 桂 嶸, 等. NOR1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響J. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 28(12): 1267-1269. 5 Fernandez J, Gharahdaghi F, Mische SM. Routine identification of proteins from sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide

17、 gel electrophoresis(SDSPAGE) gels or polyvinyl difluoride membranes using matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flightmass spectrometry (MALDITOFMS)J. Electrophoresis, 1998, 19(6): 1036-1045.6 Gharahdaghi F, Weinberg CR, Meagher DA, et al. Mass spectrometric identification of proteins from silverstained polyacrylamide gel: a method for the removal of silver ions to enhance sensitivityJ. Electrophoresis, 1999, 20(3): 601-605.7 Ladomery M, Dellaire G. Multifunctional zinc finger proteins in deve